乙二醇預處理棉花秸稈糖化條件的優(yōu)化

蘇 霞，王美霞，王延琴，楊偉華，魏守軍，周大云，杜雙奎

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2. 中國農業(yè)科學院棉花研究所 棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000)

乙二醇預處理棉花秸稈糖化條件的優(yōu)化

蘇 霞1，王美霞1，王延琴2，楊偉華2，魏守軍2，周大云2，杜雙奎1

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2. 中國農業(yè)科學院棉花研究所 棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000)

以乙二醇預處理的棉花秸稈為試驗材料，以酶解時間、酶解溫度、pH、底物質量濃度和纖維素酶濃度為試驗因素，設計單因素試驗、Box-Behnken試驗，考察各因素對還原糖質量分數(shù)的影響，優(yōu)化酶解糖化條件。結果表明，纖維素酶濃度和酶解時間對還原糖質量分數(shù)的影響極顯著，二者的交互作用對還原糖質量分數(shù)有顯著影響。還原糖質量分數(shù)與纖維素酶濃度、底物質量濃度、酶解時間之間的回歸模型有統(tǒng)計學意義，各因素的影響主次順序為纖維素酶濃度>酶解時間>底物質量濃度。酶解糖化優(yōu)化條件為纖維素酶濃度90 FPU/g、底物質量濃度47.2 g/L、50 ℃、pH 4.8下糖化72 h，還原糖質量分數(shù)高達486.9 mg/g，顯著高于原秸稈糖化效果(178.2 mg/g)。

棉花秸稈；乙二醇預處理；酶解糖化

能源是人類賴以生存和發(fā)展的物質基礎，隨著世界經(jīng)濟持續(xù)快速的發(fā)展，對能源的需求越來越大，尋求一種新型的、清潔的、可持續(xù)發(fā)展的能源勢在必行[1-2]。生物乙醇以其環(huán)境友好、原料可再生等優(yōu)良特性，越來越受到研究者的重視[3]。農作物秸稈是一種重要的可再生生物質資源，世界能源危機和環(huán)保意識促使人們認識到秸稈能源化的必要性，利用可再生木質纖維素資源制備燃料乙醇已成為世界各國的研究熱點。秸稈生物質的預處理、糖化、乙醇化是突破目前生物質秸稈高效利用的技術瓶頸。棉花秸稈中纖維素質量分數(shù)高達32%～46%，半纖維素質量分數(shù)為20%～28%，利用其制備燃料乙醇具有非常大的潛力[4]。但纖維素酶的糖化作用受纖維素的結晶度和聚合度、底物的表面積、木質素的阻礙、半纖維素含量、原料粒徑、多孔性及細胞壁厚度等因素制約，所以預處理是高效利用秸稈制備燃料乙醇的關鍵所在[5]。呂學斌等[6]采用響應曲面法優(yōu)化玉米秸稈酶解條件，結果表明酶濃度57.5 FPU/g、底物質量濃度64.7 g/L、溫度48 ℃、pH 4.8、反應時間49 h，還原糖質量分數(shù)為463.4 mg/g。張?zhí)K江等[7]以棉花秸稈為原料，采用正交設計對酶解工藝條件進行優(yōu)化，結果表明纖維素酶用量0.5%、溫度50 ℃、pH 5.0條件下酶解效果最好。鄧輝等[8]以棉花秸稈為原料，對其堿預處理及微波/堿預處理，結果表明堿預處理后木質素、半纖維素分別降低60.42%、35.05%；微波/堿預處理后木質素、半纖維素分別降低61.31%、44.78%。田龍等[9]用丙酸在常壓溫和條件下預處理小麥秸稈，在最佳工藝條件即料液比 1∶16、粒度40目、丙酸質量濃度900 g/L、催化劑質量濃度 3 g/L、溫度70 ℃，處理時間150 min下，纖維素保留率為92.6%，半纖維素和木質素的脫除率分別為98.3%和70.5%。Xiao等[10]用乙二醇作為溶劑對玉米秸稈進行預處理，發(fā)現(xiàn)微波輔助加熱的作用效果比傳統(tǒng)加熱作用效果更佳。孫付保等[11]以常見高沸點有機酸、醇對麥草進行預處理，結果表明酸比醇類的預處理作用強；而高沸點醇類在高溫預處理麥草時，其酶解率顯著高于低溫處理。岳軍等[12]用乙醇對木糖渣、玉米芯和玉米秸稈進行預處理，結果發(fā)現(xiàn)預處理可降低木糖渣的木質素含量，提高纖維素轉化率；與木糖渣相比，乙醇更適合用于玉米芯和玉米秸稈酶解前的預處理。秸稈纖維的酶解效果受到纖維素的結晶度和聚合度、底物的表面積、木質素的阻礙、半纖維素含量、原料粒徑以及酶濃度、底物質量濃度、溫度、pH和酶解時間等影響。本研究以乙二醇預處理的棉花秸稈為試驗材料，對預處理的棉花秸稈粉進行酶解糖化，分析纖維素酶解溫度、酶解時間、pH、底物質量濃度、酶用量對還原糖質量分數(shù)的影響，采用Box-Behnken試驗對酶解糖化條件進行優(yōu)化以提高酶解糖化效率，為后續(xù)發(fā)酵奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉花秸稈由中國農業(yè)科學院棉花研究所提供，風干、粉碎，過40目篩，備用。水分7.92%，纖維素34.83%，半纖維素26.74%，木質素18.89%，灰分3.74%。

乙二醇、濃硫酸、濃鹽酸、濃硝酸、無水乙醇、苯、檸檬酸、檸檬酸三鈉、吐溫-80、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉等均為分析純；葡萄糖為生化試劑；纖維素酶，美國MP公司，活力為160 FPU/g。

1.2 儀器設備

SHA-C型水浴恒溫振蕩器，常州國華儀器有限公司；PB-10標準pH計，德國賽多利斯公司；UV-1200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；HH-S4A恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；KDC-40低速離心機，科大中佳公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 秸稈預處理 取棉花秸稈粉5 g，按液固比20∶1(V∶m)加入90%的乙二醇溶液，并加入0.5%濃鹽酸作為催化劑，混勻，在180 ℃油浴下處理2.5 h，抽濾，用蒸餾水將濾渣洗至中性，于60 ℃烘干，得乙二醇預處理秸稈。預處理后棉花秸稈纖維素質量分數(shù)為75.65%，木質素質量分數(shù)為7.12%。

1.3.2 酶解糖化 取一定量預處理棉花秸稈和未經(jīng)處理棉花秸稈，按試驗設計的底物質量濃度(g/L)和纖維素酶濃度(FPU/g)加入一定量的檸檬酸緩沖液和纖維素酶，并按照m(吐溫-80)∶m(底物) =1∶10比例添加吐溫-80作為表面活性劑，混勻，控制一定的溫度和時間，在140 r/min下進行酶解，待酶解結束后沸水浴10 min滅酶，離心分離得酶水解液，用DNS法測定還原糖質量分數(shù)。

單因素試驗設計：以酶解時間、酶解溫度、pH、底物質量濃度、纖維素酶濃度為試驗因素，考察酶解時間1～96 h、酶解溫度40～60 ℃、pH 4.4～5.2、底物質量濃度20～100 g/L及酶濃度10～90 FPU/g對酶水解糖液中還原糖質量分數(shù)的影響。

Box-Behnken試驗設計：在單因素試驗的基礎上，取酶解溫度為50 ℃、pH 4.8，以纖維素酶濃度、底物質量濃度、酶解時間為主要因子，設計Box-Behnken試驗，因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

2 結果與分析

2.1 時間對酶解效果的影響

在纖維素酶濃度為50 FPU/g、底物質量濃度60 g/L、pH 4.8、50 ℃酶解糖化，還原糖質量分數(shù)隨時間的變化規(guī)律如圖1所示。

由圖1可以看出，對預處理秸稈酶解糖化，當酶解時間<48 h時，隨著時間的延長，還原糖質量分數(shù)呈迅速增大趨勢；當酶解時間>48 h時，還原糖質量分數(shù)呈現(xiàn)緩慢增長。這是因為初始階段大量的酶與暴露出的纖維素相互作用，將其水解為還原糖，還原糖質量分數(shù)快速增加，但隨著時間的延長，暴露在外的纖維素已經(jīng)基本被水解，反應體系中的副產(chǎn)物會逐漸增多，故還原糖質量分數(shù)增長趨于緩慢。對原秸稈酶解糖化，其還原糖質量分數(shù)明顯較低，這是由于未處理秸稈中的纖維素被木質素、半纖維素緊密包裹難以被酶作用所致[13]。

圖1 不同酶解時間的還原糖質量分數(shù)

2.2 溫度對酶解效果的影響

固定纖維素酶濃度為50 FPU/g、底物質量濃度60 g/L、pH 4.8時酶解48 h，酶解溫度對還原糖質量分數(shù)的影響如圖2所示。由圖2可以看出，當酶解溫度低于50 ℃時，隨著溫度的升高，還原糖質量分數(shù)呈上升趨勢；當酶解溫度高于50 ℃時，預處理過的秸稈酶解所得的還原糖質量分數(shù)下降明顯，而原秸稈酶解所得的還原糖質量分數(shù)下降緩慢[14]。這可能與纖維素酶的最適宜溫度有關，溫度過低會使酶的活性受到抑制，影響化學平衡反應，溫度過高會使酶的空間結構遭到破壞而永久失去活性。在任何溫度下，預處理后的秸稈糖化效果明顯高于未處理秸稈。50 ℃為酶解糖化適宜溫度，倫曉中等[15]對經(jīng)過膨化的玉米秸稈進行酶解糖化也得出了相同的結論。

2.3 pH對酶解效果的影響

在纖維素酶濃度50 FPU/g、底物質量濃度60 g/L， 50 ℃酶解48 h， 體系pH對還原糖質量分數(shù)的影響如圖3所示。由圖3可以看出，預處理秸稈的酶解還原糖質量分數(shù)顯著高于未處理秸稈。隨著pH值酶增大，秸稈酶解的還原糖質量分數(shù)呈先增大后減小趨勢。pH太高或者太低，不僅會抑制酶解反應，而且會破壞酶分子結構導致酶蛋白失活[16]，故在pH=4.8時具有最大的還原糖質量分數(shù)。

圖2 不同酶解溫度的還原糖質量分數(shù)

圖3 不同pH的還原糖質量分數(shù)

2.4 底物質量濃度對酶解效果的影響

固定纖維素酶濃度50 FPU/g、pH 4.8、50 ℃酶解48 h，還原糖質量分數(shù)隨著底物質量濃度的變化規(guī)律如圖4所示。由圖4可知，底物質量濃度對秸稈酶解糖化效果有顯著影響，適宜的反應底物質量濃度會使酶和底物充分接觸，有利于酶解反應平衡。當?shù)孜镔|量濃度為60 g/L時，還原糖質量分數(shù)達到最高。當?shù)孜镔|量濃度過低時，可被纖維素酶作用降解的纖維素質量分數(shù)低，纖維素酶不能充分發(fā)揮作用，因而導致還原糖質量分數(shù)低；當?shù)孜镔|量濃度過高時，纖維素原料不能完全漲潤，使得不能完全與酶液接觸，酶解效果不好。在相同底物質量濃度下，預處理秸稈的酶解糖化效果明顯高于未處理秸稈。

2.5 纖維素酶濃度對酶解效果的影響

在底物質量濃度60 g/L、pH 4.8、50 ℃酶解48 h，纖維素酶濃度與還原糖質量分數(shù)的關系如圖5所示。由圖5可以看出，當?shù)孜镔|量濃度一定時，隨著纖維素酶濃度的增加，還原糖質量分數(shù)呈先快速增加后趨于平緩的趨勢。纖維素酶濃度過低使纖維素和半纖維素不能被完全轉化，降低還原糖質量分數(shù)。當纖維素酶濃度達到一定程度后，底物與酶的結合呈飽和狀態(tài)，過多的酶會造成不必要的浪費[17]。50 FPU/g纖維素酶濃度為最適宜濃度。預處理秸稈對纖維素酶濃度的影響更加敏感。

對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，還原糖質量分數(shù)(Y1)對纖維素酶濃度 (X1)、底物質量濃度(X2)、處理時間(X3)的回歸模型為：

圖4 不同質量濃度底物的還原糖質量分數(shù)

由表3回歸模型檢驗可以看出，還原糖質量分數(shù)模型概率P為 0.0004<0.05，模型顯著，而失擬項概率P為0.0616>0.05，不顯著，表明所建回歸模型有統(tǒng)計學意義，可用來分析和預測酶解糖化的工藝參數(shù)。

2.6 酶解糖化模型的建立與條件優(yōu)化

2.6.1 回歸模型的建立 以纖維素酶濃度、底物質量濃度、酶解時間為試驗因素，Box-Behnken試驗方案及結果見表2。

圖5 不同濃度纖維素酶的還原糖質量分數(shù)

表2 試驗方案與結果

表3 回歸模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗

注：*差異顯著(P<0.05)，**差異極顯著(P<0.01)。

Note: *significant difference (P<0.05 )，**high significant difference(P<0.01).

回歸系數(shù)顯著性檢驗結果可知(表3)，一次項X1、X3及二次項X22對還原糖質量分數(shù)有極顯著影響，交互作用項X1X3對還原糖質量分數(shù)有顯著影響，其余各項對還原糖質量分數(shù)影響均不顯著。由模型中X1、X2、X3回歸系數(shù)絕對值大小可以判定對還原糖質量分數(shù)影響的因素主次順序為X1>X3>X2，即纖維素酶濃度影響最大，酶解時間影響次之，底物質量濃度影響較小。

圖6為底物質量濃度取零水平時纖維素酶濃度和酶解時間對還原糖質量分數(shù)的影響。由圖6可以看出，纖維素酶濃度和酶解時間的交互作用對還原糖質量分數(shù)有顯著影響(P=0.017 7)，隨著纖維素酶濃度的提高，還原糖質量分數(shù)呈先快速增加后趨于平緩的趨勢；隨著酶解時間的增加，還原糖質量分數(shù)亦呈現(xiàn)先增加后下降趨勢。當纖維素酶濃度較高時，酶解時間對還原糖質量分數(shù)的影響較大。當纖維素酶濃度取最高水平，酶解時間取中間水平時，還原糖質量分數(shù)有最高值。

2.6.2 優(yōu)化條件的確定 對回歸模型分析得優(yōu)化工藝條件為X1=1、X2=0.32、X3=1，即酶濃度90 FPU/g、底物質量濃度47.2 g/L、酶解時間72 h時，酶解糖化后還原糖質量分數(shù)高達488.7 mg/g。對優(yōu)化工藝條件進行驗證，酶解糖化后酶水解液中還原糖質量分數(shù)為486.9 mg/g，與理論預測值無顯著差異。在優(yōu)化條件下對原秸稈進行酶解糖化，還原糖質量分數(shù)僅為178.2 mg/g，表明棉花秸稈經(jīng)乙二醇預處理后，酶解糖化效果得到明顯改善。

圖6 纖維素酶濃度與酶解時間對還原糖質量分數(shù)影響的響應曲面圖

3 結 論

乙二醇預處理的棉花秸稈酶解糖化時，纖維素酶濃度和酶解時間對還原糖質量分數(shù)的影響極顯著，二者的交互作用對還原糖質量分數(shù)有顯著影響。還原糖質量分數(shù)與纖維素酶濃度、底物質量濃度、酶解時間之間的回歸模型有統(tǒng)計學意義，各因素對還原糖質量分數(shù)的影響主次順序為纖維素酶濃度>酶解時間>底物質量濃度。乙二醇預處理棉花秸稈酶解糖化優(yōu)化條件為纖維素酶濃度90 FPU/g、底物質量濃度47.2 g/L、50 ℃、pH4.8下糖化72 h，還原糖量高達486.9 mg/g，遠高于原秸稈糖化效果(178.2 mg/g)，乙二醇預處理效果顯著。

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(責任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Optimization of Enzymatic Saccharification of Glycol Pretreatment Cotton Stalk

SU Xia1,WANG Meixia1,WANG Yanqin2,YANG Weihua2, WEI Shoujun2,ZHOU Dayun2and DU Shuangkui1

(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.State Key Laboratory of Cotton Biology,Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agriculture Science,Anyang Henan 455000,China)

The enzymatic saccharification parameters of cotton stalk pretreated by ethylene glycol were investigated. The effect of hydrolysis time,hydrolysis temperature,pH,substrate mass concentration,and cellulase concentration on reducing sugar mass fraction was studied by the single factor experiment and Box-Behnken design to optimize enzymatic saccharification conditions. The results indicated that the influence of cellulase concentration and hydrolysis time on reducing sugar mass fraction was highly significant,and the interaction between the two factors had a significant influence on the reducing sugars mass fraction. The model obtained had a statistically significance. The influences on reducing sugars mass fraction followed the order of cellulase concentration>hydrolysis time>substrate concentration. The reducing sugars mass fraction of pretreated cotton stalk was 486.9 mg/g,significantly higher than the native biomass (178.2 mg/g) under the optimized conditions of cellulase concentration 90 FPU/g,substrate concentration 47.2 g/L,hydrolysis time 72 h,hydrolysis temperature 50 ℃ and pH 4.8.

Cotton stalk; Glycol pretreatment; Enzymatic saccharification

SU Xia,female,master student.Research area:comprehensive utilization of straw.E-mail:18700943418@163.com

ZHOU Dayun,female,associate research fellow.Research area:comprehensive utilization of cotton seed quality and byproducts. E-mail:zhoudy@cricaas.com.cn

2015-11-04

2015-12-11

國家棉花產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-18)；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201503135)。

蘇 霞，女，碩士生，研究方向為秸稈的綜合利用。E-mail:18700943418@163.com

周大云，女，副研究員，主要從事棉花種子品質及副產(chǎn)品綜合利用研究。E-mail: zhoudy@cricaas.com.cn

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1123.044.html

TQ35

A

1004-1389(2016)12-1898-07

Received 2015-11-04 Returned 2015-12-11

Foundation item China Agriculture Research System (No.CARS-18),Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interes(No.201503135).