葉藝蘭輻射突變體的氣孔特征與染色體核型分析*

蘇暢,李枝林,付永恒,李夏媛,王玉英

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院花卉研究所，云南 昆明650201)

葉藝蘭輻射突變體的氣孔特征與染色體核型分析*

蘇暢,李枝林,付永恒,李夏媛,王玉英

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院花卉研究所，云南 昆明650201)

為闡明輻射誘發(fā)的葉藝蘭植株與未經(jīng)誘變植株的差異，以經(jīng)輻射誘發(fā)的葉藝蘭植株(TRIR-2)與未經(jīng)誘變的全綠植株(TRIR-1)為試材，運(yùn)用顯微鏡觀察植物葉片的氣孔及根尖細(xì)胞的染色體并使用Photoshop軟件對(duì)染色體進(jìn)行分析。結(jié)果表明，(1)TRIR-2的氣孔數(shù)量、面積、密度值均小于TRIR-1；(2)TRIR-1植株的染色體核型公式為2n=2x=10m+24sm+6st，屬較為對(duì)稱(chēng)的“2B”型；TRIR-2植株的染色體核型公式為2n=2x=10m+28sm+2st，屬不對(duì)稱(chēng)的“2C”型。說(shuō)明輻射誘變產(chǎn)生的葉藝蘭突變體氣孔特征和染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

輻射誘變；葉藝蘭；氣孔；染色體；核型

蘭花是中國(guó)傳統(tǒng)名貴花卉，葉藝蘭(線藝蘭)是指蘭屬(Cymbidium)植株葉片上鑲嵌著或金黃、或銀白、或濃綠、或朱紅、或墨黑的嘴、邊、點(diǎn)、線、斑的中國(guó)蘭統(tǒng)稱(chēng)[1]。葉(線)藝品種以墨蘭〔Cymbidiumsinense(Jackson ex Andr.)Willd.〕最多，建蘭(C.ensifolium)次之，春蘭(C.goerigii)、蕙蘭(C.faberi)與寒蘭(C.kanran)較少[2]。藝象主要表現(xiàn)為：金棱邊類(lèi)、綠藝類(lèi)、先明后暗類(lèi)(全斑類(lèi))、鉗帽子類(lèi)、爪藝類(lèi)、水晶類(lèi)、斑縞類(lèi)(先明，后明)、棒縞類(lèi)(先明，后明)、圖斑藝類(lèi)、虎(豹)斑類(lèi)等[3]。葉藝蘭栽培已有千年，因其葉片艷麗，形態(tài)優(yōu)美，被譽(yù)為“花中君子”，是珍貴的觀賞花卉[4]；因其奇花、奇葉和矮種等各種變異類(lèi)型層出不窮，市場(chǎng)前景十分廣闊。

輻射誘變育種是一種新型育種方法，具有創(chuàng)造多種突變體、豐富種質(zhì)資源庫(kù)，打破基因連鎖、提高重組率，保持優(yōu)良性狀、改良品種的某些不良性狀，以及突變性狀穩(wěn)定快、縮短育種年限等特點(diǎn)，γ射線是植物誘變育種中最常用的輻射誘變因素[5]。目前，輻射誘變技術(shù)已在月季(RosachinensisJacq.)、菊花〔Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel〕、美人蕉(CannaindicaL.)、大麗花(DahliapinnataCav.)、葉子花(BougainvilleaspectabilisWilld.)、荷花(Nelumbonucifera)植物上獲得60多種突變體[6]。應(yīng)用60Coγ射線處理碧玉蘭〔Cymbidiumlowianum(Rchb.f.)Rchb.f.〕、西藏虎頭蘭(C.tracyanumL.)、冬鳳蘭(C.dayanumRchb.f.)、竹葉蘭〔Arundinagraminifolia(D.Don)Hochr.〕的組培苗以及墨蘭[7]和蘭花春劍隆昌素(C.longibracteatumcv.‘longchangsu’)根狀莖[8]已獲得了植株矮化、變粗、葉變寬、葉上有淡綠斑、綠芽分化和葉色失綠變淡等表型變化。已有研究表明，蘭花經(jīng)輻射誘變后引起一系列基因突變，進(jìn)而使蘭花的氣孔性狀發(fā)生變化[9]。此外，輻射可誘發(fā)染色體數(shù)量、結(jié)構(gòu)和行為畸變，重組體的產(chǎn)生、染色體斷裂、結(jié)構(gòu)重排，以及引起染色體行為變異，如染色體橋的出現(xiàn)、染色體落后等[10]。

為指導(dǎo)蘭屬其他種和變種的人工葉藝育成，本研究以經(jīng)輻射誘發(fā)的葉藝蘭與未經(jīng)誘變的全綠植株為試材，通過(guò)對(duì)植物葉片氣孔和根尖染色體的觀察，從細(xì)胞學(xué)水平分析兩種植株的差異，以期為闡釋葉藝形成的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為其他科、屬觀葉植物人工誘發(fā)葉藝的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2004年，本課題組獲得素花虎頭蘭(C.hooke-rianum)與黃蟬蘭(C.iridioides)F1雜交苗，并篩選出性狀穩(wěn)定、一致的株系；2005年7月，將性狀穩(wěn)定、一致的F1雜交種苗在云南華源輻射有限公司進(jìn)行60Coγ射線急性照射。培育2年，發(fā)現(xiàn)數(shù)株葉藝品系；經(jīng)過(guò)6年的繼代培養(yǎng)，獲得特異性狀穩(wěn)定的葉藝新品系2種。一種類(lèi)型的葉尖和葉邊緣為綠色、其他部分為白色的葉藝株系，是葉藝部分觀賞價(jià)值較高、葉形較為優(yōu)美的新品系，命名為T(mén)RIR-2；另一種類(lèi)型為全綠葉片，即未出現(xiàn)葉藝的新品系，命名為T(mén)RIR-1。本研究供試材料即為T(mén)RIR-2和TRIR-1的組培苗(圖1)。

TRIR-1植株TRIR-2植株TRIR-1植株與TRIR-2植株

圖1 TRIR-1和TRIR-2植株

Fig.1 TRIR-1 and TRIR-2

1.2 研究方法

1.2.1 氣孔觀察

取TRIR-1和TRIR-2各3株觀察植株的葉片，選取每一株植株中最長(zhǎng)的葉片觀察，每一片葉片平均分成上、中、下 3部分，撕取葉片下表皮，在顯微鏡下觀察，每個(gè)樣觀測(cè)3個(gè)視野。用Photoshop處理圖片并記下每張圖片中的氣孔數(shù)，用Photoshop計(jì)算每個(gè)氣孔的面積和整個(gè)視野面積，并計(jì)算其平均值。氣孔的面積(μm2)=長(zhǎng)徑×短徑。

1.2.2 染色體分析

中國(guó)蘭花通常是自養(yǎng)型的地生草本植物，具有粗大的根系，且被海綿狀白色的根被所覆蓋，中央有1個(gè)維管組織的髓部。因此，對(duì)蘭花根部進(jìn)行染色體制片較為困難。在對(duì)染色體制片各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行比較后，選擇出效果相對(duì)較好的制片方案[11～12]。

取TRIR-1和TRIR-2各3株觀察植株的根尖，每1株植株中選取3個(gè)根長(zhǎng)0.5cm左右的根尖，取根尖分生組織，在顯微鏡下觀察。

(1)預(yù)處理 將取出的大小為0.5cm的根尖組織加入0.1%的秋水仙素預(yù)處理液[13～14]，于常溫下預(yù)處理約4h，洗滌后轉(zhuǎn)入Carony’s液(乙醇︰乙酸=3︰1)中固定30min，取出后放入60℃濃度為1mol/ L的HCl中水解10min。

(2)染色 用蒸餾水清洗3～5次，加入1～2滴的卡寶品紅染色30min。

(3)壓片 將完成染色的根尖放于載玻片上，蓋上蓋玻片，橡皮頭輕敲團(tuán)狀物，使細(xì)胞均勻分散。

(4)鏡檢 將制作完成的裝片置于顯微鏡下觀察，選擇染色體形態(tài)、分散較好的根尖裝片進(jìn)行拍照。

(5)染色體核型分析 用Photoshop從原始圖中解析出染色體，根據(jù)目測(cè)進(jìn)行同源染色體配對(duì)、排序；然后按從大到小的順序進(jìn)行同源染色體排序，使用變形工具對(duì)染色體的位置進(jìn)行調(diào)整，使其短臂朝上，長(zhǎng)臂朝下，使所有染色體主縊痕盡量在同一水平線上[15～16]。

核型分析采用李懋學(xué)等的核型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[17]，染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比及類(lèi)型按Levan等的命名系統(tǒng)，核型分類(lèi)按照Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)劃分[18]。利用Photoshop版本輔助分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

方差分析采用DPS軟件，染色體核型分析采用Photoshop軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣孔特征分析

由表1和圖2可知，TRIR-1、TRIR-2白色區(qū)和TRIR-2綠色區(qū)的氣孔數(shù)量、氣孔面積和氣孔密度均存在差異，但三者之間的氣孔數(shù)量差異不顯著(P>0.05)，而TRIR-1的氣孔面積顯著高于TRIR-2白色區(qū)和TRIR-2綠色區(qū)(P<0.05)。說(shuō)明輻射誘發(fā)了葉藝蘭的葉片氣孔數(shù)量、面積和密度的變化。

表1 TRIR-1和TRIR-2植株的氣孔特征

注：小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

TRIR-1全區(qū)TRIR-2白色區(qū)TRIR-2綠色區(qū)

圖2 TRIR-1和TRIR-2植株的植株氣孔(×10)

Fig.2 Stomata of TRIR-1 and TRIR-2 (×10)

2.2 染色體核型分析

由表2、表3、圖3和圖4可知，TRIR-1的m(中著絲粒染色體，下同)染色體有10個(gè)，sm(近中著絲粒染色體，下同)染色體有24個(gè)，st(近端著絲粒染色體，下同)染色體有6個(gè)；TRIR-2的m染色體有10個(gè)，sm染色體有28個(gè)，st染色體有2個(gè)；TRIR-1的近中部染色體數(shù)比TRIR-2少4個(gè)，TRIR-1的近端部染色體數(shù)比TRIR-2多4個(gè)；TRIR-1的染色體長(zhǎng)度變化范圍和最長(zhǎng)染色體與最短染色體值比均大于TRIR-2；TRIR-1的核型公式為2n=2x=10m+24sm+6st，屬“2B”型；TRIR-2的核型公式為2n=2x=10m+28sm+2st，屬“2C”型。說(shuō)明與TRIR-2相比，TRIR-1具有較對(duì)稱(chēng)的核型，輻射誘發(fā)葉藝蘭的染色體核型發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致葉藝蘭突變體的形成。

表2 TRIR-1和TRIR-2植株的染色體參數(shù)

TRIR-1的根尖染色體TRIR-2的根尖染色體

圖3 TRIR-1和TRIR-2的染色體(×100)

圖4 TRIR-1和TRIR-2植株核型模式

Fig.4 Karyotypic of TRIR-1 and TRIR-2

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

輻射誘變導(dǎo)致葉藝植株氣孔的數(shù)量、面積和密度的變化；同時(shí)染色體核型由較為對(duì)稱(chēng)的“2B”型轉(zhuǎn)為不對(duì)稱(chēng)的“2C”型。表明輻射誘發(fā)了葉藝蘭植株(TRIR-2)變異體的產(chǎn)生。

3.2 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)影響氣孔發(fā)育的因素有基因[19]、激素[20]、微管和環(huán)境因子4方面[21]。其中基因控制著氣孔的發(fā)生；脫落酸、赤霉素和乙烯等激素影響氣孔的產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明輻射誘發(fā)葉藝蘭植株的氣孔數(shù)量、面積和密度的變化，說(shuō)明輻射能夠影響植物氣孔的發(fā)育。相關(guān)研究表明突變株系的葉片氣孔密度增大，氣孔面積減小，氣孔分布更密，氣孔更小，有利于水分的蒸騰擴(kuò)散[22]。本研究中氣孔面積縮小與前人研究結(jié)果一致，但輻射導(dǎo)致葉藝蘭植株葉片中白色區(qū)域氣孔數(shù)量降低，綠色區(qū)域氣孔數(shù)量增加，這可能是由于葉藝蘭植株為了能夠生存，當(dāng)白色區(qū)域氣孔數(shù)量較少時(shí)，綠色部分的氣孔數(shù)量就會(huì)增多，使葉藝植株的氣孔在光合、呼吸、蒸騰等作用中成為空氣和水蒸汽的通路，以此來(lái)滿足葉藝蘭植株的生長(zhǎng)需求。

相關(guān)研究表明菊花花色的輻射誘變導(dǎo)致菊花染色體結(jié)構(gòu)的變化，使基因發(fā)生缺失、重復(fù)、倒位、易位等現(xiàn)象[23]。菊花的花色變化是染色體的核型經(jīng)過(guò)輻射之后由對(duì)稱(chēng)變?yōu)椴粚?duì)稱(chēng)所致，同時(shí)染色體進(jìn)化與生物進(jìn)化有著極其密切的關(guān)系[24]。本研究結(jié)果也表明了輻射誘變導(dǎo)致葉藝蘭植株染色體核型結(jié)構(gòu)的變化。研究結(jié)果對(duì)整個(gè)植物核型進(jìn)化方式的研究提供了新的證據(jù)。高等植物核型進(jìn)化的基本趨勢(shì)是由對(duì)稱(chēng)向不對(duì)稱(chēng)方向發(fā)展，系統(tǒng)演化上處于比較古老或原始的植物，往往具有較對(duì)稱(chēng)的核型，不對(duì)稱(chēng)的核型通常出現(xiàn)在較進(jìn)化或特化的植物中[25～26]。李玉閣等[27]報(bào)道的7種蘭亞屬植物的核型，結(jié)果也表明蘭屬的染色體數(shù)目保守，除了兔耳蘭(C.lancifolium)和線藝春蘭外，其余染色體數(shù)目均為2n=40，且染色體的結(jié)構(gòu)主要由m和sm染色體組成，核型具有較高的對(duì)稱(chēng)性，為“2A”或“2B”型。金蘭(Cephalantheraerecta)、銀蘭(Cephalantherafalcata)的染色體主要由sm和st染色體組成，核型均屬較不對(duì)稱(chēng)的“3C”型，且為二型式核型，即1～3對(duì)為大型染色體，而4～17卻為小型染色體[27]。本研究表明TRIR-1植株的核型公式是2n=2x=10m+24sm+6st，屬較為對(duì)稱(chēng)的“2B”型；TRIR-2植株的核型公式是2n=2x=10m+28sm+2st，屬不對(duì)稱(chēng)的“2C”型。說(shuō)明通過(guò)輻射誘變的葉藝蘭植株的遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，導(dǎo)致核型由對(duì)稱(chēng)向不對(duì)稱(chēng)方向發(fā)展，這與高等植物核型進(jìn)化的基本趨勢(shì)一致。

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Leaf Stomatal and Chromosome Karyotype of Ye-yi Orchid Mutant Induced by Radiation

SU Chang,LI Zhi-lin,FU Yong-heng，LI Xia-yuan,WANG Yu-ying

(Horticulture and Landscape College of Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

In order to expound the differences of Ye-yi orchid that was induced by irradiation and that was not induced,the leaf stomatal and the chromosome of root tip cell were observed by microscope,and the chromosome were further analyzed by Photoshop software.The results showed that，(1) quantity,stomatic size and density of stomata of induced plant (TRIR-2)were less than plant that was not induced (TRIR-1);(2) karyotype formula of TRIR-1 is 2n=2x=10m+24sm+6st,a relatively symmetrical 2B type, and karyotype formula of TRIR-2 is 2n=2x=10m+28sm+2st,an asymmetric 2C type.

radiation induced；orchid with verge line pattern leaves (Ye-yi orchid)； stomatal ；chromosome；karyotype

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.016

2015-10-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30160074)，云南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2002C0003P)，云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(2012BB008)，

蘇暢(1989-)，女，研究生，主要從事園藝植物資源的利用及創(chuàng)新研究。E-mail:515718100@qq.com

簡(jiǎn)介：王玉英(1980-)，女，講師，主要從事植物資源的利用和創(chuàng)新研究。E-mail:wyysxp@126.com

S 682.31

A

1672-8246(2016)06-0089-06

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院院級(jí)基金(2014001)，云南省昆明市科學(xué)技術(shù)局重點(diǎn)項(xiàng)目(2015-1-N-00984)。