酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物對(duì)酸乳發(fā)酵特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物對(duì)酸乳發(fā)酵特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響

劉澤朋，祝緣，王婷婷，趙麗麗，毛學(xué)英

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

本文旨在探究酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物（CPP-Ca）對(duì)酸乳發(fā)酵特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響。研究不同添加量CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中pH值、滴定酸度、乳酸菌數(shù)以及酸乳微觀結(jié)構(gòu)和乳清析出率的影響。結(jié)果表明，CPP-Ca絡(luò)合物的添加可以降低酸乳發(fā)酵過(guò)程中的pH值，提高滴定酸度；對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中的乳酸菌總數(shù)沒(méi)有顯著影響；增大酸乳蛋白網(wǎng)絡(luò)孔徑，提高凝膠結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和均一性，降低酸乳乳清析出率。

酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物；酸乳；發(fā)酵特性；乳清析出

0 引言

鈣質(zhì)缺乏是全球性的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題，人們一直在尋找吸收率高的補(bǔ)鈣制劑。傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)鈣鹽和有機(jī)鈣鹽由于難吸收，毒副作用大被逐漸淘汰。作為新型鈣營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，多肽鈣可以被動(dòng)物體內(nèi)獨(dú)立的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以較快的速度吸收[1]；大大提高鈣的吸收利用率[2]；且無(wú)毒副作用，是較為理想的鈣制劑[3-4]。

酪蛋白磷酸肽（CPP）是來(lái)源于牛乳酪蛋白的多肽，具有良好的促鈣吸收效果[5]。研究發(fā)現(xiàn)CPP可以提高成骨細(xì)胞對(duì)鈣的吸收[6]，與鈣離子形成螯合物促進(jìn)鈣以穩(wěn)定形式被細(xì)胞吸收[7]。

多肽可以為乳酸菌生長(zhǎng)提供氮源，酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物（CPP-Ca）既有助于酸乳發(fā)酵，又能夠起到鈣營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的作用。本文研究了CPP-Ca對(duì)酸乳發(fā)酵及產(chǎn)品特性的影響，為其在酸乳中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脫脂乳粉，直投式發(fā)酵劑YF-L812，CPP-Ca（實(shí)驗(yàn)室制備）。

普通化學(xué)試劑：氫氧化鈉、鄰苯酸氫二鉀、酚酞、EDTA二鈉、氯化銨、鉻黑T、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、吐溫80、無(wú)水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、一水合硫酸錳、檸檬酸氫二胺、Cys-HCl、瓊脂、氯化鈉等

1.1.2 儀器

恒溫水浴鍋（PK-8B），恒溫水浴振蕩器（DSHZ-300A），立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R），潔凈工作臺(tái)（BBS-SDC），漩渦振蕩器（QL-860），磁力攪拌器（78HW-1），pH計(jì)（FE20），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9076A），激光共聚焦掃描顯微鏡（LSM710）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸乳的制作

將CPP-Ca以0，0.5，1，1.5 g/L的質(zhì)量濃度添加于脫脂乳粉中，混合攪拌均勻，4℃冷藏過(guò)夜充分水合。脫脂乳經(jīng)95℃殺菌5 min后，冷卻至42～43℃，接種1%的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌種，在42℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵至pH值至4.6時(shí)到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.2 pH值的測(cè)定

將pH探頭清洗干凈后小心浸入樣品中，使pH計(jì)探頭完全浸沒(méi)，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取樣品pH值。

1.2.3 滴定酸度的測(cè)定

稱取2 g（精確到0.01 g）已混勻的試樣，置于150 mL錐形瓶中，加20 mL新煮沸冷卻至室溫的水，混勻。于溶解混勻后的試樣中加入2.0 mL酚酞指示液，混勻后用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，并在30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)，代入公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：X為試樣的酸度（°T）；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（moL/L）；V為滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mL）；m為試樣的質(zhì)量（g）；0.1為酸度理論定義氫氧化鈉的濃度（mol/L）。

1.2.4 酸乳微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將CPP-Ca絡(luò)合物以0，0.5，1，1.5 g/L的質(zhì)量濃度添加于脫脂乳中，混合攪拌均勻，水合過(guò)夜。經(jīng)95℃殺菌5 min后，冷卻至42～43℃。然后，按Lucey報(bào)道的方法制作酸乳激光共聚焦樣品[8]，在殺菌冷卻后的乳中加入羅丹明B作為熒光蛋白染料，使染料在乳中的最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。添加質(zhì)量濃度1 g/L發(fā)酵劑于乳中并攪拌均勻。取適量樣品（約100 μL）于載玻片凹槽內(nèi)，蓋上蓋玻片并用硅油密封，發(fā)酵至pH值為4.6時(shí)結(jié)束發(fā)酵，置于4℃冷藏。使用Zeiss780倒置共聚焦顯微鏡對(duì)酸乳凝膠的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，用Ar/Kr激光束激發(fā)出488 nm的波長(zhǎng)，在100倍油鏡下觀察不同視野酸乳凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.5 乳酸菌計(jì)數(shù)

酸乳樣品以適當(dāng)比例稀釋后接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選擇菌落數(shù)30～ 300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以CFU/mL表示。

1.2.6 黏度的測(cè)定

取酸乳樣品約8 mL置于10 mL離心管中，發(fā)酵完成后使用J-5S型數(shù)字式黏度計(jì)測(cè)定酸乳黏度。

1.2.7 乳清析出的測(cè)定

取約10 g酸乳樣品，在4℃下，采用100 g離心力離心10 min，結(jié)束后小心吸出上清液，稱重。按照下述公式計(jì)算酸乳乳清析出。

式中：m1為離心前樣品與空管的質(zhì)量（g）；m0為離心去掉上清液后樣品與空管的質(zhì)量（g）；m2為酸乳樣品的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPP-Ca對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中pH值和滴定酸度的影響

不同添加量的CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中pH值和滴定酸度的影響分別如圖1和圖2所示。發(fā)酵過(guò)程中酸乳的pH值隨著CPP-Ca添加量的增加而下降，滴定酸度隨CPP-Ca添加量的增加而升高。當(dāng)CPP-Ca添加量為1.5 g/L時(shí)，酸乳發(fā)酵過(guò)程中的滴定酸度和pH值分別顯著高于和低于其他樣品。說(shuō)明CPP-Ca具有促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸，降低發(fā)酵過(guò)程pH值，縮短發(fā)酵時(shí)間的作用。此外，CPP-Ca對(duì)酸乳滴定酸度的影響是在2 h后才出現(xiàn)顯著性差異，說(shuō)明CPP-Ca對(duì)酸度的影響存在滯后現(xiàn)象。隨發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，CPP-Ca可能發(fā)生了解離，釋放出游離的鈣離子。體系中隨Ca2+的增加會(huì)提高氫離子濃度，降低pH值[9]。因此，在發(fā)酵2 h后，酸奶的滴定酸度隨CPP-Ca濃度的增加開(kāi)始呈現(xiàn)顯著性的提高。

另外，由于牛奶本身含很少量的非蛋白態(tài)氮，且嗜熱鏈球菌的蛋白水解能力很弱，因此通過(guò)添加酪蛋白水解物CPP增加了發(fā)酵體系中肽和游離氨基酸的含量，從而增強(qiáng)了嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力[10]。同時(shí)由于微生物之間的益生作用球菌的生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生對(duì)保加利亞乳桿菌有益的促生長(zhǎng)因子，也有利于嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。

圖1 CPP-Ca的添加對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中pH值的影響

圖2 CPP-Ca的添加對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中滴定酸度的影響

2.2 CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的影響

不同添加量的CPP-Ca對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的影響如圖3所示。由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，添加不同劑量CPP-Ca的樣品乳酸菌數(shù)變化趨勢(shì)同對(duì)照組一致，均呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵至4 h，對(duì)照組、CPP-Ca添加量為0.5 g/L、1 g/L的樣品乳酸菌數(shù)稍有下降，但與其他樣品組之間無(wú)顯著性差異。并且當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，各樣品的乳酸菌數(shù)也無(wú)明顯差異，說(shuō)明CPP-Ca的添加對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中的乳酸菌數(shù)沒(méi)有顯著影響。而CPP作為酪蛋白水解后的多肽混合物，理論上能為微生物的生長(zhǎng)提供氮源，具有促發(fā)酵作用[11,12]。但在發(fā)酵過(guò)程中球菌和桿菌數(shù)量比卻可能發(fā)生了變化。CPP-Ca濃度的增加，可能促進(jìn)某一菌株的增加，而抑制了另外一菌株的生長(zhǎng)。Oliveira等人[13]研究表明，酪蛋白水解物對(duì)不同益生菌菌株的穩(wěn)定性是不同的。在發(fā)酵初期蛋白水解物可能對(duì)于水解能力有限的球菌有明顯促生長(zhǎng)作用，而對(duì)桿菌活菌數(shù)沒(méi)有顯著的變化。到發(fā)酵后期，由于酸度的增加，對(duì)酸性更敏感的球菌則可能減少，而桿菌活菌數(shù)則上升。

圖3 CPP-Ca的添加對(duì)酸乳發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的影響

2.3 CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同添加量的CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖4所示。圖4中，A、B、C、D分別代表CPP-Ca添加量為0，0.5，1，1.5 g/L的酸乳樣品。結(jié)果顯示，未添加CPP-Ca絡(luò)合物時(shí)，酸乳蛋白質(zhì)交聯(lián)程度致密，網(wǎng)絡(luò)孔隙小，且不連續(xù)。隨CPP-Ca添加量的增加，酸乳蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)孔隙增大，致密性降低，但連續(xù)性和均一性增強(qiáng)。當(dāng)添加量為1.5 g/L，凝膠網(wǎng)絡(luò)孔隙最大，連續(xù)性和均一性最佳?？紫兜脑龃罄趯?duì)乳清進(jìn)行包裹，防止乳清過(guò)度析出。體系中鈣的增加有利于與膠體磷酸根離子結(jié)合，形成膠體磷酸鈣，進(jìn)而可以增加酪蛋白之間的交聯(lián)作用[14]，同時(shí)，CPP質(zhì)量濃度的增加也可以與乳清蛋白形成交聯(lián)，減少了乳清蛋白和酪蛋白之間交聯(lián)形成的致密結(jié)構(gòu)。

圖4 CPP-Ca的添加對(duì)酸乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.4 CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳乳清析出的影響

不同添加量CPP-Ca絡(luò)合物對(duì)酸乳乳清析出的影響如圖5所示。由圖5可以看出，隨著CPP-Ca絡(luò)合物濃度的增加，發(fā)酵乳乳清析出率顯著降低。當(dāng)CPP-Ca絡(luò)合物添加量為1.5 g/L時(shí)，乳清析出率最少。

圖5 CPP-Ca的添加對(duì)酸乳乳清析出率的影響

體系中鈣質(zhì)量濃度的增加，可以增加膠體磷酸鈣的形成并與酪蛋白膠束結(jié)合，形成連續(xù)性較強(qiáng)的膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高膠體持水力[9]。因此，CPP-Ca可以提高酸奶中可溶性鈣質(zhì)量濃度，使膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連續(xù)均一，抑制了乳清析出。但體系中鈣的存在形式也會(huì)影響酸乳凝膠特性。Ramasubramanian等人[9]比較了離子鈣和非離子鈣對(duì)酸乳黏度和硬度的影響，發(fā)現(xiàn)游離鈣一定程度會(huì)降低酸乳質(zhì)構(gòu)特性，而非游離鈣則會(huì)在一定程度改善酸乳質(zhì)構(gòu)特性。

3 結(jié)論

（1）在酸乳發(fā)酵過(guò)程中，CPP-Ca具有促進(jìn)酸乳發(fā)酵的作用，在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)可以促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸，降低pH值，增加滴定酸度。

（2）在酸乳發(fā)酵過(guò)程中，CPP-Ca的添加對(duì)乳酸菌數(shù)的變化沒(méi)有顯著影響，但可能會(huì)影響其比例。

（3）CPP-Ca的添加會(huì)增大凝膠結(jié)構(gòu)的孔徑，形成連續(xù)性和均一性較強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低了酸乳的乳清析出率。

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Effect of casein phosphopeptide-calcium complex on fermentation properties and microstructure of yogurt

LIU Ze-peng,ZHU Yuan,WANG Ting-ting,ZHAO Li-li,MAO Xue-ying
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083，China)

The effects of casein phosphopeptide-calcium complex(CPP-Ca)on the fermentation and product properties of yogurt were ex?plored.The changes of pH value,titration acidity,lactic acid bacteria count of yogurt which was added CPP-Ca complex were determined. The microstructure of yogurt was observed by confocal laser scanning microscopy.The results indicated that the addition of CPP-Ca com?plex could reduce the pH values,increase the titration acidity,and had no significant difference on the lactic acid bacteria counts during the fermentation.In addition,the addition of CPP-Ca complex increased the diameter size of gel pores and augmented the continuity and uni?formity of the gel structure,which decreased the whey separation of yogurt.

casein phosphopeptide-calcium complex;yogurt;fermentation properties

Q93-33

A

1001-2230（2016）09-0004-03

2016-03-29

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生科研訓(xùn)練計(jì)劃；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD18B12-05）。

劉澤朋（1994-），男，本科，研究方向?yàn)楣δ苄匀橹破贰?/p>

毛學(xué)英