射頻消融治療對原發(fā)性肝癌患者T細(xì)胞免疫功能的影響*

苗同國 王立靜 馬立偉 陳午盛 邵明亮 段玉松 穆永旭

(石家莊市第五醫(yī)院介入科，石家莊 050021)

·實驗研究·

射頻消融治療對原發(fā)性肝癌患者T細(xì)胞免疫功能的影響*

苗同國 王立靜 馬立偉 陳午盛 邵明亮 段玉松 穆永旭**①

(石家莊市第五醫(yī)院介入科，石家莊 050021)

目的 探討射頻消融(radio frequency ablation，RFA)前后原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)患者T細(xì)胞亞群的變化。 方法 采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測2011年1月～2013年6月40例PHC患者RFA術(shù)前24 h與術(shù)后1周、4周時外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+Treg細(xì)胞的變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)含量。選擇40例健康志愿者作為對照組。 結(jié)果 術(shù)前肝癌患者外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯低于健康對照組，CD8+、Treg細(xì)胞明顯高于健康對照組(P<0.01)；肝癌患者IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯低于健康對照組(P<0.01)。術(shù)后1周，肝癌患者CD3+、CD8+、CD4+/CD8+與術(shù)前相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后4周CD3+、CD4+明顯升高，CD8+明顯降低(P<0.05)；Treg細(xì)胞術(shù)后1周、4周與術(shù)前比較均明顯降低(P<0.01)。RFA治療1周、4周IL-2、IFN-γ、TNF-α較治療前均明顯升高(P<0.01)。 結(jié)論 射頻消融可以改善肝癌患者短期內(nèi)的T淋巴細(xì)胞功能，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌，從而對原發(fā)性肝癌患者的免疫狀況產(chǎn)生有益的影響。

原發(fā)性肝癌； 射頻消融； T細(xì)胞亞群； Th1型細(xì)胞因子； 細(xì)胞免疫功能

對于原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinomas，PHC)，肝切除術(shù)、肝移植和肝部分切除術(shù)是肝細(xì)胞肝癌唯一的根治方法，雖然有早期的檢出計劃，但是大多數(shù)患者確診時仍為中晚期，只有20%～30%的患者可以手術(shù)切除[1]。射頻消融(radio frequency ablation,RFA)是近年發(fā)展起來的一種治療腫瘤的新技術(shù)，具有微創(chuàng)、安全、適應(yīng)證寬、耐受性好、療效肯定、并發(fā)癥少等特點，已應(yīng)用于各種實體腫瘤，尤其是肝癌的治療，己經(jīng)成為繼手術(shù)切除、介入治療后的第三大肝癌治療手段，而且由于其療效確切，特別是在小肝癌的治療方面，射頻消融療效與手術(shù)切除相近，被認(rèn)為是小肝癌的根治性治療手段之一[2]。

近年來，許多學(xué)者認(rèn)為，RFA不僅能直接滅活腫瘤，治療后還能增加腫瘤局部和外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量及抗腫瘤功能，提高機(jī)體免疫力可能是治療腫瘤的另一種作用。我們選取我院2011年1月～2013年6月經(jīng)臨床或肝穿刺病理證實為原發(fā)性肝癌患者40例，通過觀察RFA術(shù)前24 h與術(shù)后1周、4周時外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞，CD4+/CD8+，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，以及Th1型細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，探討RFA對肝癌患者外周血T細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

病例選擇標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)衛(wèi)生部《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011版)》[2]選取原發(fā)性肝癌，并且符合：①不適合手術(shù)切除的直徑≤5 cm單發(fā)腫瘤，或最大直徑≤3 cm的多發(fā)(≤3個)腫瘤，無血管、膽管和鄰近器官侵犯以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②無肝臟腫瘤射頻消融禁忌證[3]。

所選40例肝癌患者，男31例，女9例。年齡28～71歲，(56.2±13.8)歲。單發(fā)病灶25例，雙病灶11例，三病灶4例，共59處病灶。病灶直徑<3 cm 37處，3～5 cm 22處。均有乙型肝炎病史，治療前均在接受核苷類藥物抗病毒治療。以年齡、性別相同為匹配條件選擇40例正常體檢志愿者作為對照組。所有研究對象均無糖尿病、類風(fēng)濕、甲狀腺功能亢進(jìn)等自身免疫性疾病史和免疫治療史。

1.2 射頻消融步驟

采用美國RITA射頻消融治療系統(tǒng)(RF-1500)，消融電極針為RITA-Star Burst XL多極腫瘤消融電極及皮膚電極(美國硅谷公司生產(chǎn))。術(shù)前禁食，肌內(nèi)注射哌替啶50 mg、異丙嗪25 mg。取仰臥位，建立靜脈通路，常規(guī)消毒鋪巾，依據(jù)腫瘤部位尋找合適進(jìn)針路線，確定穿刺點。在CT引導(dǎo)下將射頻針穿刺至預(yù)定部位，根據(jù)腫瘤大小和位置，RITA消融參數(shù)為：溫度80～100 ℃，時間10～30 min。消融范圍包括腫瘤及瘤周0.5～1.0 cm肝組織。

1.3 觀察指標(biāo)

抽取40例健康志愿者和40例PHC患者術(shù)前24 h肘靜脈血3 ml作為基線，并于RFA術(shù)后1周和4周抽取40例PHC患者肘靜脈血3 ml，用于測定外周血免疫細(xì)胞亞群和相關(guān)免疫細(xì)胞因子。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量。嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行，采用德國美天妮MACS Quant流式細(xì)胞儀檢測并分析免疫細(xì)胞亞群。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α含量。嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行，采用美國Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀測定并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1RFA治療前肝癌患者與健康對照組T細(xì)胞亞群和Th1型細(xì)胞因子水平的比較

見表1。肝癌患者術(shù)前外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著低于健康對照組，CD8+、Treg細(xì)胞明顯高于健康對照組(P<0.01)；肝癌患者IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯低于健康對照組(P<0.01)。

2.2 RFA治療前后肝癌患者外周血T細(xì)胞亞群的變化

見表2。與術(shù)前比較，術(shù)后1周肝癌患者CD3+、CD8+、CD4+/CD8+無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后4周，CD3+、CD4+明顯升高，CD8+明顯降低(P<0.05)；Treg細(xì)胞術(shù)后1周、4周與術(shù)前比較均明顯降低(P<0.01)。

2.3 RFA治療前后肝癌患者血清Th1型細(xì)胞因子含量比較

見表3。治療1周和4周后肝癌患者IL-2、IFN-γ、TNF-α含量較術(shù)前明顯升高(P<0.01)。

時間IL-2IFN-γTNF-α術(shù)前24h①86.14±7.5338.62±6.2862.35±7.21術(shù)后1周②96.52±3.2751.05±3.7074.04±6.89術(shù)后4周③100.39±11.9453.73±5.2678.38±5.85t1-2,P值-7.977,0.000-10.785,0.000-7.414,0.000t1-3,P值-6.385,0.000-11.666,0.000-10.919,0.000

3 討論

針對PHC的基礎(chǔ)和臨床研究一直是腫瘤學(xué)科研究的重點和熱點。加強(qiáng)對機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測，對于肝癌患者病情評估、臨床診療方案的制定、完善肝癌治療模式和提高療效具有重要作用[4]。機(jī)體免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，其中T細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中起著舉足輕重的作用[5]。

CD3+細(xì)胞代表成熟的T淋巴細(xì)胞，是細(xì)胞免疫中主要的活性細(xì)胞?？煞譃镃D4+和CD8+T細(xì)胞2個亞群。在正常情況下，淋巴細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞處于一個相對穩(wěn)定平衡狀態(tài)，維持機(jī)體免疫功能。但在癌癥患者，機(jī)體免疫力常遭到不同程度的破壞，表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值下降[6]，抗腫瘤作用減弱，以致有利于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Treg細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的非常重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)性細(xì)胞[7]，能抑制抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的活化和增殖，與腫瘤免疫逃逸有關(guān)[8]。Yang等[9]分析25例肝細(xì)胞肝癌的肝組織，觀察到癌旁組織的Treg細(xì)胞比例高于癌遠(yuǎn)端組織。研究[10，11]顯示肝癌患者Treg細(xì)胞比例明顯高于正常人群，而淋巴細(xì)胞總數(shù)偏低，同樣提示肝癌患者存在不同程度的免疫抑制。因此，通過測定這些淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目可從側(cè)面反映腫瘤患者免疫狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，肝癌患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂，表現(xiàn)為外周血CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，Treg細(xì)胞明顯升高，提示肝癌患者的細(xì)胞免疫功能穩(wěn)態(tài)處于明顯抑制水平。40例原發(fā)性肝癌患者射頻消融治療4周后，T細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞產(chǎn)生了明顯和積極的變化，與治療前相比，均有顯著性差異，一定程度上說明射頻消融治療可以在短時間內(nèi)使機(jī)體細(xì)胞免疫功能有所改善，在抗腫瘤治療中對肝癌患者是有益的。

癌變過程中，CD4+T細(xì)胞被激活并向4種方向發(fā)生極化，即Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞。多數(shù)研究[12～14]認(rèn)為機(jī)體的抗腫瘤作用以Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，其與抗腫瘤免疫效果有關(guān)，而Treg細(xì)胞則發(fā)揮相反的抑制作用，特別是在腫瘤晚期，Treg細(xì)胞在腫瘤局部富集，加速腫瘤的進(jìn)展。因此，對于腫瘤的預(yù)防和治療，原則上應(yīng)優(yōu)先考慮應(yīng)用多種手段促進(jìn)Th1細(xì)胞極化和功能激活。RFA治療后可以導(dǎo)致Th1型細(xì)胞因子明顯增多，促進(jìn)Th0向Th1偏移，從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫功能。本研究結(jié)果顯示RFA后1周Th1型細(xì)胞因子分泌明顯增多，說明RFA可以在短期內(nèi)激活Th1型免疫，并持續(xù)至術(shù)后4周。

本研究結(jié)果顯示，RFA在改善腫瘤患者的免疫抑制狀態(tài)上發(fā)揮了積極有益的作用，不但促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分化和殺傷作用，而且抑制Treg細(xì)胞導(dǎo)致的免疫抑制狀態(tài)，以產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫。

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(修回日期：2016-03-22)

(責(zé)任編輯：王惠群)

Influence of Radio Frequency Ablation on T Lymphocyte Subsets in Patients with Primary Liver Cancer

MiaoTongguo,WangLijing,MaLiwei,etal.

DepartmentofInterventionalRadiology,FifthHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050021,China

MuYongxu,E-mail:myx6738@sohu.com

Objective To investigate changes of T lymphocyte subsets in patients with primary hepatocellular carcinoma (PHC) after radio frequency ablation (RFA). Methods A total of 40 patients with pathologically-proved PHC (study group) were enrolled in our study during the period from January 2011 to June 2013. Peripheral blood CD3+, CD4+and CD8+T cells as well as CD4+/CD8+, CD4+CD25+Treg cells were determined 24 h before RFA and at 1 and 4 weeks after RFA in all the patients by using flow cytometry assay. Serum Th1 type cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α) were analyzed by ELISA assay. Another 40 healthy volunteers were collected and used as the control group. Results As compared to the control group, the CD3+, CD4+T cells, CD4+/CD8+, IL-2, IFN-γ and TNF-α in the study group were significantly lower while CD8+T cells and CD4+CD25+Treg cells were higher (P<0.01) 24 h before RFA. As compared to 24 h before RFA, the peripheral T lymphocyte subsets CD3+, CD8+T cells and CD4+/CD8+at 1 week after RFA had no statistically changes in the study group (P>0.05), while after 4 weeks CD3+, CD4+T cells were significantly increased and CD8+T cells significantly decreased (P<0.05). The Treg cells were obviously reduced at 1 week and 4 weeks after RFA (P<0.01). Additionally, serum IL-2, IFN-γ and TNF-α levels in the study group raised significantly after 1 week and 4 weeks (P<0.01). Conclusion RFA can improve immune functions of T lymphocytes and promote secretion of Th1 type cytokines, which benefits the immune functions against primary hepatocellular carcinoma.

Primary hepatocellular carcinoma; Radio frequency ablation; T lymphocyte subsets; Th1 type cytokines; Cellular immune function

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(ZD20140284)

A

1009-6604(2016)06-0538-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.06.017

2015-12-22)

**通訊作者，E-mail：myx6738@sohu.com

①(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院介入科，包頭 014010)