基于生物傳感器的發(fā)酵過程在線分析系統(tǒng)研制

朱思榮，周萬里，畢春元，張利群，楊艷，張金玲，趙曉華

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

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【生物傳感器】

基于生物傳感器的發(fā)酵過程在線分析系統(tǒng)研制

朱思榮，周萬里，畢春元，張利群，楊艷，張金玲，趙曉華

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

基于發(fā)酵過程自動(dòng)優(yōu)化控制的需求，研制了發(fā)酵過程生物傳感器在線自動(dòng)取樣分析系統(tǒng)。給出了在線分析系統(tǒng)的分析原理及其結(jié)構(gòu)組成，詳細(xì)介紹了自動(dòng)取樣、樣品稀釋及生物傳感器信號(hào)處理的方法。系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖、乳酸和谷氨酸等重要生化參數(shù)的自動(dòng)取樣分析，并把分析結(jié)果通過485接口或4～20 mA模擬接口發(fā)送到發(fā)酵控制器，為發(fā)酵控制提供生化分析數(shù)據(jù)。用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品作為發(fā)酵液對(duì)實(shí)驗(yàn)樣機(jī)進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明在線分析系統(tǒng)具有較高的分析精度，可以滿足發(fā)酵過程分析的需求。

生物傳感器；自動(dòng)分析儀；在線分析；葡萄糖分析；乳酸分析；發(fā)酵罐自動(dòng)取樣

在微生物發(fā)酵工藝過程中，反應(yīng)物質(zhì)的濃度是發(fā)酵控制決策的重要依據(jù)[1]，要實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程自動(dòng)優(yōu)化控制必需對(duì)一些重要生化參數(shù)實(shí)現(xiàn)在線分析。多年來在生化參數(shù)的在線自動(dòng)分析上已有不少研究[2-10]，但至今國內(nèi)未見有成熟的產(chǎn)品。鑒于生化參數(shù)檢測(cè)對(duì)發(fā)酵控制的重要意義，國外的一些生化分析儀廠商為全自動(dòng)生化分析儀提供了在線自動(dòng)取樣模塊，用于發(fā)酵過程分析。如Nova的Bioprofile系列[11]、YSI的2700系列[12-13]生化分析儀均可配備在線取樣模塊，快速分析發(fā)酵過程生化參數(shù)。美國Flownamics公司研發(fā)了一款專用于發(fā)酵罐內(nèi)取樣的自動(dòng)取樣系統(tǒng)SEGFLOW 4800[14]，可以與YSI和Nova公司的生化分析儀及Waters Acquity超高效液相色譜聯(lián)機(jī)，從發(fā)酵罐內(nèi)獲取樣品，經(jīng)稀釋處理后提供給生化分析儀或高效色譜分析儀，并從后者獲得分析結(jié)果，系統(tǒng)可以與數(shù)款監(jiān)控和數(shù)據(jù)采集平臺(tái)(SCADA)軟件實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)通訊，從而獲得在線分析系統(tǒng)的效果。

基于國內(nèi)發(fā)酵過程在線分析的現(xiàn)狀，我們將在線取樣控制、樣品的稀釋處理和生化參數(shù)分析系統(tǒng)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)，研制了基于生物傳感器的發(fā)酵過程在線自動(dòng)分析系統(tǒng)。系統(tǒng)可以安裝3個(gè)酶電極生物傳感器，每次取樣最多可以測(cè)定3個(gè)生化指標(biāo)，分析測(cè)定結(jié)果能夠以4～20 mA模擬量或串口數(shù)據(jù)方式發(fā)送到發(fā)酵控制系統(tǒng)，為發(fā)酵過程的優(yōu)化控制提供生化參數(shù)數(shù)據(jù)。

1 分析原理

生化參數(shù)的檢測(cè)采用酶電極生物傳感器方法，酶電極是由過氧化氫電極表面緊貼安裝固定化酶膜組成。結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 固定化酶膜剖面圖Fig.1 Sectional view of immobilized enzyme membrane

固定化酶膜是一個(gè)三層膜結(jié)構(gòu)，粘接在一個(gè)支撐橡膠圈上。緊貼電極為內(nèi)膜層，僅允許H2O2等小分子通過，用于排除一些分子量較大的氧化還原物質(zhì)對(duì)電極信號(hào)的干擾。內(nèi)膜之外為固定化酶層，是傳感器的信號(hào)源，由待測(cè)底物的氧化酶經(jīng)戊二醛交聯(lián)固定制成。固定化酶膜的最外層為支撐膜，膜孔徑在10 μm以下，可以自由透過待測(cè)物。待測(cè)定底物在固定化酶層經(jīng)底物氧化酶催化，產(chǎn)生過氧化氫。反應(yīng)如下：

式中底物為待測(cè)定物，如底物為葡萄糖或L-乳酸，相應(yīng)的底物氧化酶就是葡萄糖氧化酶或L-乳酸氧化酶，產(chǎn)物為葡萄糖酸或丙酮酸。

酶反應(yīng)生成H2O2的速度與底物濃度符合酶反應(yīng)的米氏公式，在一定的底物濃度內(nèi)可以視為線性關(guān)系。在測(cè)定系統(tǒng)中，因?yàn)槊阜磻?yīng)為電極表面的局部反應(yīng)，生成的H2O2在電極表面還原，形成電極電流，反應(yīng)池中H2O2濃度極低，所以可以在反應(yīng)池中放置多個(gè)電極，同時(shí)測(cè)定多個(gè)生化參數(shù)而不會(huì)互相干擾。

H2O2電極把酶反應(yīng)生成的H2O2轉(zhuǎn)換為電極電流，電極電流與H2O2的濃度成正比，而H2O2的濃度與酶反應(yīng)的底物濃度成正比，所以電極電流與電極上的待測(cè)物濃度成正比關(guān)系。酶是一種有催化活性的蛋白質(zhì)，酶的催化活性與本身結(jié)構(gòu)、環(huán)境溫度和pH等因素有關(guān)，在環(huán)境不變的條件下，酶活在一定時(shí)間內(nèi)可以看作穩(wěn)定不變，用標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)傳感器進(jìn)行標(biāo)定可以獲得待測(cè)物濃度與電極電流的比例關(guān)系，根據(jù)這個(gè)關(guān)系和測(cè)定時(shí)的響應(yīng)電流即可計(jì)算出待測(cè)物的實(shí)際濃度。

2 分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)

在線分析系統(tǒng)從發(fā)酵罐內(nèi)采集發(fā)酵樣品，再把樣品進(jìn)行稀釋處理，使樣品能在測(cè)定過程中獲得最佳分析精度，再根據(jù)測(cè)定結(jié)果和稀釋狀態(tài)計(jì)算出發(fā)酵原液中待測(cè)物含量，最終把分析結(jié)果通過數(shù)據(jù)接口輸出到發(fā)酵控制系統(tǒng)，為發(fā)酵控制器提供生化參數(shù)數(shù)據(jù)。整個(gè)系統(tǒng)的組成如圖2所示：

圖2 在線分析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure diagram of online analysis system

2.1 在線自動(dòng)取樣設(shè)計(jì)

由于發(fā)酵罐種類多，大小差異極大，對(duì)取樣系統(tǒng)也要求不一，小罐要求取樣量要少，大罐更強(qiáng)調(diào)取樣要安全可靠。為保證在線分析系統(tǒng)的通用性，本系統(tǒng)設(shè)計(jì)支持從發(fā)酵罐內(nèi)直接取樣和先把樣品放到U型管內(nèi)暫存，再從U型管內(nèi)取樣兩種方式。前者取樣量少，適用于小型發(fā)酵罐；后者模擬手動(dòng)取樣流程，取樣量較多，但安全性和可靠性均較高，適合大型發(fā)酵罐使用。因?yàn)榉治鱿到y(tǒng)與發(fā)酵罐之間有一定的距離，所以把取樣器分為罐旁控制裝置和儀器端控制裝置兩部分，在線分析系統(tǒng)通過連接電纜控制罐旁控制裝置上的泵和閥。圖3為罐內(nèi)直接取樣示意圖，圖4是U形管間接取樣示意圖，中間虛線表示連接罐旁控制裝置和儀器端控制裝置的硅膠取樣軟管。

采用直接取樣方式，可以選用陶瓷膜過濾式取樣器[15]從發(fā)酵罐內(nèi)取樣，也可以通過直管直接從發(fā)酵罐內(nèi)取樣。前者因?yàn)樘沾赡さ目讖侥茏钃跫?xì)菌通過，安全性高，但也容易因?yàn)檫^濾器阻塞導(dǎo)致取樣失?。缓笳咭?yàn)槿庸芘c發(fā)酵罐直接相通，對(duì)操作要求較高，取樣管在發(fā)酵前必需徹底滅菌，吹氣必須使用無菌空氣，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵最好定時(shí)對(duì)取樣管路進(jìn)行化學(xué)滅菌處理。

圖3 發(fā)酵罐內(nèi)直接取樣示意圖Fig.3 Illustration of direct sampling in fermentation tank

圖4 U型管間接取樣示意圖Fig.4 Illustration of indirect sampling with U-type tube

取樣時(shí)先開啟取樣泵、管路閥和取樣閥，樣品經(jīng)取樣器，通過取樣閥和管路閥流向樣品池，當(dāng)管路的液體傳感器檢測(cè)到樣品后，延時(shí)一定時(shí)間，控制取樣量，然后關(guān)閉取樣閥，開啟吹氣泵和吹氣閥，由無菌空氣推送管路內(nèi)的樣品到達(dá)樣品池。當(dāng)樣品池的液位傳感器檢測(cè)到樣品后關(guān)閉取樣泵，開啟廢液閥，把管路內(nèi)多余樣品排放到廢液瓶?jī)?nèi)，完成一次取樣。樣品池樣品可以通過開啟廢液閥和反轉(zhuǎn)取樣泵排入廢液瓶。在線分析系統(tǒng)對(duì)樣品的需求量小于1 mL，在取樣周期較長(zhǎng)時(shí)，為了去除上次取樣管壁殘留樣品對(duì)分析測(cè)定的影響，通常需要取樣2～3次。前幾次取樣用于清洗管路和樣品池，最后一次取樣用于分析測(cè)定。

圖3左側(cè)所示消毒清洗液接口，用于手動(dòng)對(duì)取樣管路進(jìn)行化學(xué)滅菌，取樣閥和吹氣閥都是帶常開和常閉的雙路壓管閥，在取樣閥吹氣閥均關(guān)閉時(shí)，手動(dòng)開啟管路閥和取樣泵即可吸取消毒清洗液填充取樣管，對(duì)取樣管路進(jìn)行化學(xué)滅菌處理。圖3右側(cè)的消毒清洗液用于封堵取樣管路，在直管直接罐內(nèi)取樣狀態(tài)下，最后一次取樣完成后，開啟取樣泵和清洗液閥數(shù)秒，讓消毒清洗液進(jìn)入管路內(nèi)，可以防止環(huán)境雜菌通過樣品池污染取樣管。

間接取樣方式通過預(yù)取樣，先把樣品保存在一段U型管內(nèi)，然后從U型管的底部取樣，后續(xù)取樣過程同直接取樣。在取樣完成后通過開啟蒸汽閥完成對(duì)U型管的排液和滅菌，取樣安全性高， 發(fā)酵樣品在U型管內(nèi)，還能排除發(fā)酵液中的氣泡。這種方式一次取樣量大，通常為100 mL以上。

2.2 樣品稀釋方法

發(fā)酵樣品通常需要經(jīng)過稀釋處理才能分析測(cè)定，對(duì)于高糖發(fā)酵，通常要有200倍以上的稀釋才能保證正常分析。樣品稀釋通過高精度注射泵配合二維移動(dòng)的進(jìn)樣針和樣品稀釋池實(shí)現(xiàn)，圖1結(jié)構(gòu)圖中的樣品池、標(biāo)樣池、稀釋池和生物傳感器反應(yīng)池呈直線排列，二維定位取樣針能移動(dòng)到這些液體池內(nèi)吸取或釋放樣品。稀釋過程先在樣品池中吸取一定量的樣品，再在稀釋池中放出樣品和緩沖液。通過調(diào)整取樣量和放液總量來調(diào)整稀釋倍數(shù)，樣品注入反應(yīng)池的測(cè)定過程也是一個(gè)稀釋過程，為簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)，我們把2倍和5倍稀釋放在反應(yīng)池池內(nèi)，通過控制進(jìn)樣量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣量的1/2和1/5實(shí)現(xiàn)。在稀釋池內(nèi)實(shí)現(xiàn)10倍、20倍和50倍稀釋。總稀釋最高可達(dá)250倍，可以滿足生物傳感器對(duì)高濃度樣品測(cè)定的需求。

本設(shè)計(jì)中注射泵總?cè)萘繛? mL，生物傳感器的進(jìn)樣量40 μL左右，進(jìn)樣過程實(shí)現(xiàn)5倍稀釋時(shí)進(jìn)樣量?jī)H為8 μL左右，為保證測(cè)定的重復(fù)性，注射泵每次取樣時(shí)定位在一個(gè)固定位置。由于進(jìn)樣量少，注射泵的非線性、進(jìn)樣針壁的殘液以及進(jìn)樣針口的擴(kuò)散等因素對(duì)稀釋有較大的影響。表1是按理論進(jìn)樣量重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)結(jié)果，不稀釋進(jìn)樣量為200步(0.208 333 微升/步)，2倍稀釋進(jìn)樣量100步，5倍稀釋進(jìn)樣量40步，5倍稀釋的測(cè)定結(jié)果顯著偏高。我們通過對(duì)3個(gè)稀釋比例的進(jìn)樣量進(jìn)行微調(diào)，降低了因注射泵非線性等因素帶來的誤差。表2是微調(diào)進(jìn)樣量后的重復(fù)10次測(cè)定結(jié)果，不稀釋進(jìn)樣量為218步，2倍稀釋進(jìn)樣量108步，5倍稀釋進(jìn)樣量40步。

表1 按理論進(jìn)樣量測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)果Table 1 Determination results of standard glucose based on theoretical sample volume

表2 按補(bǔ)償進(jìn)樣量測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)果Table 2 Determination results of standard glucose based on compensation sample volume

在稀釋池內(nèi)稀釋的精度與高精度注射泵的取樣和放樣精度有關(guān)，也與樣品稀釋池的殘液有關(guān)，上一樣品測(cè)定完成，樣品池清洗后會(huì)留下一定量的殘液，最好的辦法是對(duì)稀釋池進(jìn)行干燥處理，但這會(huì)增加系統(tǒng)的復(fù)雜程度，也要增加分析處理的時(shí)間，我們通過合理的設(shè)計(jì)，把稀釋誤差控制在允許的范圍內(nèi)。首先把對(duì)稀釋池的清洗設(shè)置在每次稀釋之前，減少稀釋池殘留水份揮發(fā)不一造成的誤差；其次在稀釋池內(nèi)涂疏水膜，盡量減少殘留水量；最后稀釋池的攪拌混勻采用空氣氣泡攪拌，去除攪拌捧對(duì)殘留水的影響。經(jīng)以上處理，樣品稀釋具有較好的重復(fù)性，表3是濃度為10、20和50 g/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖樣品經(jīng)10倍、20倍和50倍稀釋后的重復(fù)10次測(cè)定結(jié)果。

表3 稀釋池不同稀釋倍數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of different dilution in diluted pool

2.3 酶電極反應(yīng)池

生物傳感器分析核心部件為安裝酶電極的反應(yīng)池系統(tǒng)，基本結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 酶電極反應(yīng)池系統(tǒng)Fig. 5 Reaction cell system of enzyme electrode

為減少蠕動(dòng)泵數(shù)量，反應(yīng)池僅安裝排空泵，雙泵管結(jié)構(gòu)，用于排除反池腔和溢流腔內(nèi)的廢液，反應(yīng)腔清洗過程緩沖液由注射泵通過進(jìn)樣針注入。反應(yīng)池溢流帽限制反應(yīng)腔的容積為一固定的體積，清洗過程多余的緩沖液通過溢流帽排入溢流腔內(nèi)，定量樣品注入反應(yīng)腔內(nèi)，稀釋倍數(shù)固定不變。反應(yīng)腔內(nèi)的攪拌子用于快速混勻分析樣品。每次測(cè)定后開啟排空泵，排除反應(yīng)腔和溢流腔內(nèi)的廢液，然后用新鮮緩沖液注滿反應(yīng)腔，等待下次測(cè)定。在反應(yīng)池側(cè)面可安裝1～3個(gè)酶電極生物傳感器，分別測(cè)定1～3個(gè)分析目標(biāo)。

2.4 生物傳感器信號(hào)處理

生物傳感器的信號(hào)采樣方式采用二點(diǎn)法分析，在進(jìn)樣前等待酶電極信號(hào)電流穩(wěn)定，進(jìn)樣時(shí)記錄電極的零點(diǎn)電流值，當(dāng)達(dá)到設(shè)定的反應(yīng)時(shí)間后記錄即時(shí)電極電流，二者的差值即為酶電極對(duì)測(cè)定樣品的響應(yīng)電流。生物傳感器具有較快的樣品響應(yīng)速度，通常20 s即可達(dá)到最大響應(yīng)值的90%以上，采用二點(diǎn)法進(jìn)行分析，因?yàn)闇y(cè)定結(jié)束時(shí)接近反應(yīng)終點(diǎn)，可以獲得較高的測(cè)定精度。

酶生物傳感器分析測(cè)定是在酶催化活性穩(wěn)定狀態(tài)下，通過對(duì)比待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品在同一電極上的響應(yīng)電流實(shí)現(xiàn)。用標(biāo)樣標(biāo)定時(shí)根據(jù)標(biāo)樣濃度和響應(yīng)電流，計(jì)算出單位響應(yīng)電流的樣品濃度，即標(biāo)定系數(shù)，在測(cè)定樣品時(shí)，根據(jù)樣品的響應(yīng)電流和標(biāo)定系數(shù)，計(jì)算出樣品濃度。由于酶的催化活性會(huì)隨時(shí)間和環(huán)境溫度而改變，而發(fā)酵過程在線分析間隔時(shí)間需要根據(jù)發(fā)酵狀態(tài)和要求調(diào)整，通常為20～60 min，所以在每次分析前需先對(duì)酶催化活性用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行標(biāo)定，整個(gè)標(biāo)定過程也是酶活性的穩(wěn)定過程。

酶電極傳感器在使用一定時(shí)間后，對(duì)于底物的響應(yīng)有可能偏離線性關(guān)系,對(duì)傳感器作線性校正可以延長(zhǎng)傳感器的使用壽命。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)表明酶電極經(jīng)標(biāo)定后測(cè)得的底物濃度，其結(jié)果與底物實(shí)際濃度的關(guān)系基本符合酶反應(yīng)的米氏方程：

3.3.1 積極營(yíng)造適合中職生學(xué)習(xí)的課堂環(huán)境 良好的環(huán)境對(duì)心理調(diào)節(jié)和行為規(guī)范有積極作用，包括物質(zhì)環(huán)境和心理環(huán)境。物質(zhì)環(huán)境：主要是指教室布置。應(yīng)按照專業(yè)特點(diǎn)合理規(guī)劃，設(shè)計(jì)與專業(yè)有關(guān)的內(nèi)容，保持教室的整潔，從而增強(qiáng)學(xué)生的責(zé)任感。心理環(huán)境：和諧的課堂氛圍對(duì)于學(xué)生良好行為習(xí)慣的養(yǎng)成具有重要影響。課堂氣氛和諧融洽，教師講課心情愉悅，學(xué)生就容易受到感染，不僅課堂問題行為很少，還能促進(jìn)其學(xué)習(xí)與交流。

Y=aX/(b+X) ，

(1)

式中,a和b為校正系數(shù)，X表示實(shí)際底物濃度，Y為測(cè)定底物濃度。在標(biāo)樣濃度范圍內(nèi)，1/2標(biāo)樣濃度時(shí)具有最大偏差值。所以在設(shè)計(jì)中以2倍稀釋標(biāo)樣對(duì)傳感器進(jìn)行線性校正。根據(jù)(1)式，在定標(biāo)點(diǎn)測(cè)定濃度與實(shí)際濃度一致，即X=Y=V(V為標(biāo)樣濃度)，代入(1)得：

V=aV/(b+V) 。

(2)

在校線性點(diǎn)，X=0.5V，Y=VL(L為校線性點(diǎn)測(cè)定結(jié)果)，代入(1)得：

VL=0.5aV/(b+0.5V) 。

(3)

從式(2)和式(3)可求出線性校正系數(shù)a和b，完成線性校正。

從式(1)變換得：

X=bY/(a-Y) 。

(4)

在分析過程中，標(biāo)定完成后再根據(jù)式(4)求出實(shí)際底物濃度。傳感器的線性變化緩慢，線性校正操作每隔1～2 d做一次即可。

2.5 在線分析自動(dòng)稀釋處理

生物傳感器分析的樣品分析精度與樣品的濃度有關(guān)，當(dāng)樣品濃度接近標(biāo)準(zhǔn)樣時(shí)具有最高的分析精度，過高濃度的樣品超出傳感器的檢測(cè)范圍，并可能影響傳感器的性能，而濃度太低會(huì)增加測(cè)定誤差，所以合適的樣品稀釋也是提高分析精度的重要手段。在某些發(fā)酵中，因?yàn)楦蓴_物質(zhì)的存在，必須對(duì)樣品進(jìn)行一定的稀釋才能獲得較高的分析精度。為解決上述問題，本設(shè)計(jì)中加入了最低稀釋倍數(shù)限定和稀釋倍數(shù)自適應(yīng)，當(dāng)稀釋后測(cè)定結(jié)果超過標(biāo)樣濃度1.5倍，則自動(dòng)增加一級(jí)稀釋，重新測(cè)定，當(dāng)測(cè)定結(jié)果低于標(biāo)樣濃度的40%，如當(dāng)前稀釋大于最低稀釋的限制，則減少一級(jí)稀釋，重新測(cè)定。如果有多個(gè)生物傳感器，稀釋以濃度最高的檢測(cè)對(duì)象作為自動(dòng)調(diào)整的判斷基準(zhǔn)。樣品測(cè)定完成后把結(jié)果乘以測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù)，得到實(shí)際樣品濃度。

在線分析系統(tǒng)的目標(biāo)是為發(fā)酵過程控制提供生化參數(shù)數(shù)據(jù)，便于發(fā)酵控制系統(tǒng)根據(jù)生化參數(shù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)生物發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)控。為適合不同控制系統(tǒng)的要求，在線分析系統(tǒng)在設(shè)計(jì)中使用3種接口方式：(1)通過485總線，以專用指令從系統(tǒng)的結(jié)果數(shù)據(jù)中直接讀數(shù)，這種方式不僅可以讀出數(shù)據(jù)，還能實(shí)現(xiàn)對(duì)分析系統(tǒng)的各種操作；(2) 通過485數(shù)據(jù)接口以文本方式直接發(fā)送分析結(jié)果；(3) 以3路4～20 mA模擬量形式輸出3個(gè)傳感器的結(jié)果數(shù)據(jù)，這種方式下，可以定義20 mA電流對(duì)應(yīng)各個(gè)傳感器測(cè)定結(jié)果值。除了結(jié)果數(shù)據(jù)接口，儀器還提供電平控制接口和反饋輸出，電平控制可以使發(fā)酵控制器通過開關(guān)信號(hào)控制取樣測(cè)定，反饋輸出則可以使在線分析系統(tǒng)用于控制發(fā)酵生化指標(biāo)。反饋輸出可以選用其中一個(gè)生物傳感器的分析結(jié)果，設(shè)定控制目標(biāo)和控制方式，根據(jù)分析結(jié)果輸出反饋信號(hào)，反饋信號(hào)為周期和占空比可調(diào)節(jié)的開關(guān)信號(hào)。電平控制和反饋輸出信號(hào)均通過光電隔離。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 10 g/L標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試

用測(cè)試樣機(jī)，對(duì)10 g/L葡萄糖標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中用設(shè)定最低稀釋倍數(shù)的方法強(qiáng)制對(duì)標(biāo)樣進(jìn)行10倍、20倍和50倍稀釋。重復(fù)10次測(cè)試結(jié)果見表4。

表4 10 g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖不同稀釋實(shí)測(cè)結(jié)果比較Table 4 Practical results comparison of 10 g/L standard glucose with different dilution

由表4結(jié)果可見，當(dāng)稀釋50倍時(shí)，結(jié)果誤差顯著增大，誤差增大的原因是測(cè)定濃度偏低。

3.2 模擬發(fā)酵測(cè)試

利用研制的測(cè)試樣機(jī)安裝葡萄糖酶電極，用1 L三角燒瓶作發(fā)酵罐模擬實(shí)驗(yàn)。在三角燒瓶?jī)?nèi)注入蒸餾水400 mL，NaCl 0.5 g， 200 g/L葡萄糖樣品10 mL，在線分析系統(tǒng)設(shè)置最低稀釋為不稀釋，自動(dòng)取樣周期為10 min，取樣重復(fù)次數(shù)為5次，開始自動(dòng)取樣測(cè)定。為保持總體積基本不變，取樣測(cè)定完的樣品回排到三角燒瓶?jī)?nèi)。每測(cè)定完1個(gè)樣品，向瓶?jī)?nèi)補(bǔ)加200 g/L葡萄糖10 mL，并搖勻，20次自動(dòng)取樣測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 不斷添加葡萄糖的模擬發(fā)酵測(cè)試結(jié)果Table 5 Simulated fermentation test results of continuous addition of glucose

由表5結(jié)果可見，自動(dòng)分析結(jié)果與理論計(jì)算值基本吻合，測(cè)定值誤差小于5%。

3.3 工程菌發(fā)酵實(shí)測(cè)

在工程菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，用樣機(jī)連接發(fā)酵罐，自動(dòng)取樣測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖、L-乳酸和L-谷氨酸含量，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。整個(gè)發(fā)酵過程中，谷氨酸含量一直維持在一個(gè)較低的水平，基本不變，波動(dòng)應(yīng)為測(cè)量誤差。葡萄糖初期下降較慢，約6 h后加快，至28 h基本耗盡，而乳酸含量則不斷上升，到葡萄糖耗盡后也不再變化。自動(dòng)測(cè)定結(jié)果與發(fā)酵過程應(yīng)有的反應(yīng)吻合良好。

圖6 工程菌發(fā)酵過程在線檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Online detection results of engineering strain fermentation process

4 結(jié)語

基于生物傳感器的在線分析系統(tǒng)檢測(cè)速度快，從開始取樣到得出最終結(jié)果，分析時(shí)間通常在10 min以內(nèi)，包括稀釋誤差和分析誤差，總誤差小于5%，基本能夠滿足發(fā)酵過程自動(dòng)優(yōu)化控制對(duì)生化參數(shù)檢測(cè)的要求。隨著我國發(fā)酵工業(yè)對(duì)自動(dòng)、優(yōu)化控制需求的持續(xù)增長(zhǎng)，發(fā)酵在線分析系統(tǒng)具有較好的應(yīng)用前景。從最后工程菌發(fā)酵實(shí)際測(cè)試數(shù)據(jù)看，在線分析系統(tǒng)還存在偶爾測(cè)定誤差偏大的情況，導(dǎo)致發(fā)酵曲線波動(dòng)，尚需繼續(xù)研究，進(jìn)一步提高稀釋和測(cè)定過程的穩(wěn)定性，完善酶?jìng)鞲衅餍阅?，降低測(cè)定誤差。

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Development of biosensors based online analysis system for fermentation process

ZHU Si-rong, ZHOU Wan-li, BI Chun-yuan, ZHANG Li-qun, YANG Yan,ZHANG Jin-ling, ZHAO Xiao-hua

(Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors, Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014,China)

∶We developed a biosensors based online automatic sampling and analysis system in fermentation process for the requirements of automatic optimization control in fermentation process. We presented its analytical principle and structure components and detailed its automatic sampling, sample dilution and biosensor signal processing. It can automatically analyze such important biochemical parameters as glucose, lactic acid and glutamic acid, and send analytical results to fermentation controller through a 485 interface or a 4～20 mA analog interface. It can therefore provide biochemical analytical data for fermentation control. We further tested experiment prototype with glucose standard sample as fermentation broth. Results show that it has higher analytical accuracy and can satisfy the requirements of fermentation process analysis.

∶ biosensor; automatic analyzer; online analysis; glucose analysis; lactic acid analysis; automatic sampling from fermentation tank

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.015

2016-07-29

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2015AA021005)

朱思榮(1963—)男，碩士，研究員，研究方向?yàn)樯飩鞲衅餮芯亢彤a(chǎn)品開發(fā)。Email:yanzhi@sdas.org

Q815； TP216

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