異煙肼對斑馬魚幼魚發(fā)育毒性及運(yùn)動行為學(xué)的影響

鄒玉，張?jiān)?，韓利文，何秋霞，李智平, 3，侯海榮，韓建，王希敏，李娟娟, 3，岑娟，劉可春*

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2.河南大學(xué)，河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封 475001；3山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030000)

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【藥理與毒理】

異煙肼對斑馬魚幼魚發(fā)育毒性及運(yùn)動行為學(xué)的影響

鄒玉1, 2，張?jiān)?，韓利文1，何秋霞1，李智平1, 3，侯海榮1，韓建1，王希敏1，李娟娟1, 3，岑娟2*，劉可春1*

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2.河南大學(xué)，河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封 475001；3山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030000)

以斑馬魚幼魚為研究對象，研究異煙肼對幼魚發(fā)育毒性和行為學(xué)的影響。 用不同濃度的異煙肼分別處理發(fā)育至72 hpf的斑馬魚幼魚，觀察幼魚的死亡率、畸形率及形態(tài)變化，分析幼魚行為學(xué)軌跡。 異煙肼(≥4 mmol/L)對斑馬魚幼魚有致死作用，隨著濃度的增加和作用時間延長而增強(qiáng)。異煙肼對斑馬魚幼魚的發(fā)育過程有致畸作用，表現(xiàn)為脊柱彎曲、卵黃囊吸收延滯、心包水腫、魚鰾缺失、體長發(fā)育延遲和器官空泡化等。隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，異煙肼組幼魚行為軌跡減少，運(yùn)動次數(shù)和運(yùn)動速度顯著降低。結(jié)果表明，異煙肼(≥4 mmol/L)對斑馬魚幼魚具有致死和致畸作用，對幼魚的運(yùn)動行為有抑制作用，并且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。

異煙肼；斑馬魚；發(fā)育毒性；行為學(xué)

結(jié)核病是一種由結(jié)核桿菌引起的常見致命傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年結(jié)核病患者新增人數(shù)達(dá)到900萬，已成為威脅人類健康的主要疾病之一，而且我國屬于結(jié)核病高發(fā)地區(qū)[1-2]。1952年首次合成的抗生素異煙肼(Isonicotinic acid hydrazide，INH)，因其對結(jié)核分枝桿菌具有高度選擇性，開始用于抗結(jié)核病的治療。INH的性質(zhì)穩(wěn)定，抗菌力強(qiáng)，療效高、口服方便且價廉，已成為目前一線臨床治療結(jié)核病的藥物[3-4]。

斑馬魚是一種小型熱帶脊椎動物，不僅具有與人類基因組約87%的同源性[5]，而且有個體小、產(chǎn)卵多、發(fā)育快、體外受精、胚胎透明、易于觀察以及飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點(diǎn)[6]。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)動物大、小鼠相比，斑馬魚實(shí)驗(yàn)操作簡便、節(jié)省受試藥物的用量、減少培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動物的時間和成本，從而有助于研究疾病的發(fā)生和藥物的毒理機(jī)制[7]。斑馬魚作為一種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼游铮陌l(fā)育在心血管、體節(jié)、肌肉、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)方面與哺乳動物具有高度相似性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥物的發(fā)育毒性篩選和機(jī)制研究中。

臨床發(fā)現(xiàn)，INH在持續(xù)使用過程中，具有一定的毒副作用[8]，可引起病人產(chǎn)生各種不良反應(yīng)，如肝毒性、周圍神經(jīng)炎、胃腸道反應(yīng)、內(nèi)分泌失調(diào)、過敏和中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等[9-10]。INH可通過胎盤使胎兒血藥濃度高于母體，但I(xiàn)NH對胎兒和新生兒的發(fā)育毒性并未見報道。因此，本研究以斑馬魚幼魚為發(fā)育毒性評價模型，探討INH對斑馬魚幼魚發(fā)育和運(yùn)動行為學(xué)的影響，科學(xué)評價INH對幼魚的發(fā)育毒性，為指導(dǎo)孕產(chǎn)婦及新生兒臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 試劑

INH(Fluka公司)使用斑馬魚養(yǎng)殖水溶解稀釋。斑馬魚養(yǎng)殖水的配方為5 mmol /L NaCl、0. 17 mmol /L KCl、0. 4 mmol /L CaCl2和0. 16 mmol /L MgSO4。三卡因(Sigma公司)使用純凈水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.16%的溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

zebrabox斑馬魚行為分析儀(Viewpoint公司)；體視熒光顯微鏡SZX16(Olympus公司)；DP2-BSW圖像軟件(Olympus公司)；斑馬魚飼養(yǎng)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)；Forma 3111型水套式CO2培養(yǎng)箱(Forma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

AB野生型斑馬魚由山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺提供，斑馬魚的飼養(yǎng)和繁殖參照文獻(xiàn)中已有的成熟方法[11]。斑馬魚的培養(yǎng)在光循環(huán)為14 h 光照和10 h 黑暗、pH為7.0左右、溫度為28 ℃左右的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)前一天16：00，將健康的斑馬魚放在缸內(nèi)交配，雌雄比例為1∶1或1∶2，次日8：30抽取隔板，0.5 h后收集受精卵。用養(yǎng)殖水對受精卵清洗3遍，然后用亞甲基藍(lán)溶液對受精卵進(jìn)行消毒，后移入干凈的斑馬魚養(yǎng)殖水中28 ℃左右控光培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 INH與斑馬魚幼魚共孵育

將受精后72 hpf(hours post fertilization)的斑馬魚放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常的幼魚于6孔板中，每孔30尾幼魚。實(shí)驗(yàn)中INH的濃度分別設(shè)置為1、2、4、6、8、16 mmol/L(養(yǎng)殖水配制)和空白對照組(養(yǎng)殖水)，每孔給予不同濃度的INH暴露液5 mL，每個濃度組分別設(shè)置3個重復(fù)孔，給藥后放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)控光培養(yǎng)。連續(xù)藥液暴露3 d，每24 h更換藥液，并去除死亡幼魚。

2.2 斑馬魚幼魚發(fā)育觀察和記錄

分別在給藥24、48、72 hpe(hours post exposure)時記錄斑馬魚死亡數(shù)和畸形數(shù)，然后計算其死亡率、畸形率。使用三卡因麻醉幼魚后，在體視熒光顯微鏡下拍照觀察，并記錄斑馬魚形態(tài)變化。

2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

方成的多幅作品，為中國美術(shù)館收藏，并出版有《方成漫畫選》《方成連環(huán)漫畫集》《幽默漫畫》，以及文集《漫畫入門》《笑的藝術(shù)》《幽默·諷刺·漫畫》等著作。人們公認(rèn)，鮮明的思想性，是他作品的重要特點(diǎn)。

斑馬魚幼魚行為學(xué)實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[12]，將INH(1、2、4、6、8、16 mmol/L)不同濃度組和空白對照組，分別放在48孔板中，每孔一尾發(fā)育至72 hpf的幼魚，每孔加入相應(yīng)濃度藥液和養(yǎng)殖水500 μL，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6尾幼魚，將48孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)控光培養(yǎng)，于24、48、72 hpe放入斑馬魚行為學(xué)分析系統(tǒng)的暗箱中，使用zeblab 軟件分別采集 10 min內(nèi)各組幼魚的運(yùn)動軌跡，利用軟件導(dǎo)出總游行距離和游行時間，然后計算每組魚游行平均速度、平均距離、快中慢運(yùn)動對應(yīng)時間和次數(shù)，各數(shù)值分別計入統(tǒng)計。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 INH對斑馬魚幼魚死亡率的影響

觀察斑馬魚幼魚的死亡情況，空白對照組和1 mmol/L組在給藥3 d內(nèi)均無死亡現(xiàn)象。給藥24 h后，各給藥組與對照組相比，死亡率未見顯著性差異(P>0.05)；給藥48 h后，6、8、16 mmol/L組死亡率開始明顯升高；給藥 72 h后，6、8、16 mmol/L組幼魚發(fā)生顯著性死亡，16 mmol/L組死亡率達(dá)到80 % 以上，見圖1。

3.2 INH對斑馬魚幼魚發(fā)育畸形的影響

給藥24 h后，與空白對照組相比，6、8、16 mmol/L組均出現(xiàn)畸形；給藥48 h后，較高濃度(≥4 mmol/L)組畸形率升高明顯；給藥72 h后，2 mmol/L組幼魚也出現(xiàn)畸形，8、16 mmol/L組的致畸作用顯著，見圖2。

圖1 INH對斑馬魚幼魚劑量-時間-死亡率的影響。Fig.1 Impact of INH on dose-time-death rate of zebrafish larvae

圖2 INH對斑馬魚幼魚劑量-時間-畸形率的影響。Fig.2 Impact of INH on dose-time-malformation rate of zebrafish larvae

3.3 各暴露階段的斑馬魚圖像記錄

顯微鏡下記錄各個劑量、各個時間段INH對斑馬魚幼魚形態(tài)的影響。正常發(fā)育斑馬魚幼魚如圖3所示，靜止?fàn)顟B(tài)下，從頭至尾呈現(xiàn)一條直線，各臟器形狀完整，魚鰾發(fā)育正常，體節(jié)清晰可見，色素沉淀均勻。

UJ 前顎； B 腦； SB 魚鰾； NC 脊索； S 體節(jié)； T 尾； LJ 下鄂 ； H 心臟； L 肝臟； ST 胃； Y 卵黃； I 腸； E 眼； ALJ 前端下鄂； H 心臟； PF 胸鰭圖3 正常斑馬魚側(cè)面和腹面形態(tài)圖(5 dpf )。Fig.3 Lateral and ventral view of a normal 5 dpf zebrafish.

如圖4所示，暴露至24 hpe時,與空白對照組相比，6、8、16 mmol/L組均出現(xiàn)畸形，表現(xiàn)大多為心包水腫、身體脊柱彎曲、尾部變形、身體側(cè)傾和發(fā)育遲緩，且隨著給藥劑量增加，致畸作用更加明顯。暴露至48 hpe時，對照組斑馬魚形態(tài)正常，游動活躍；較高濃度組(≥6 mmol/L)畸形現(xiàn)象加劇，斑馬魚較不活躍，多側(cè)躺于培養(yǎng)板底部，尤其是16 mmol/L組斑馬魚不游動，沉于板底；≥6 mmol/L組幼魚發(fā)育畸形主要表現(xiàn)為心腹水腫、魚鰾未發(fā)育、體軸不對稱、和脊柱彎曲嚴(yán)重，體長與對照組相比也較短。暴露至72 hpe時，對照組斑馬魚形態(tài)正常，游動活躍；2 mmol/L組也出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，4 mmol/L組斑馬魚出現(xiàn)脊柱彎曲、水腫現(xiàn)象，魚鰾縮小，16 mmol/L組甚至出現(xiàn)尾巴畸形、魚唇和鰭不發(fā)育以及體節(jié)形成遲滯等，且隨著給藥劑量增加，斑馬魚身體扭曲程度加劇，心腹水腫加劇，見圖5。

圖4 INH對斑馬魚幼魚發(fā)育形態(tài)學(xué)的影響Fig.4 Impact of INH on morphology variation of zebrafish larvae

圖5 暴露于不同濃度INH的斑馬魚幼魚形態(tài)圖(72 hpe)。Fig.5 Morphology variation of zebrafish larvae exposed to different concentrations of isonizid (72 hpe)

3.4 INH對斑馬魚運(yùn)動行為的影響

連續(xù)暴露INH 3 d，實(shí)驗(yàn)記錄斑馬魚幼魚的行為軌跡，軌跡時間設(shè)定為10 min。結(jié)果如圖6所示，低劑量(1～4 mmol/L)暴露組幼魚與空白對照組幼魚相比，自發(fā)運(yùn)動軌跡無顯著性差異。隨著給藥濃度的增加和給藥時間的延長，高劑量組(≥6 mmol/L)幼魚越來越不活潑，觸壁反射活動減少，行為軌跡變短，說明高劑量INH組對斑馬魚幼魚的運(yùn)動行為有明顯的抑制作用。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究參數(shù)包括每條魚自發(fā)運(yùn)動總距離，每組魚平均自發(fā)運(yùn)動總距離和平均速度，快速、中速、慢速運(yùn)動次數(shù)以及快速、中速、慢速運(yùn)動時間，自發(fā)運(yùn)動參數(shù)分析(10 min)如圖7所示。與空白對照組比，1 mmol/L組在暴露時間內(nèi)，各研究參數(shù)無差異性，幼魚運(yùn)動活潑，主要以慢速和快速游動； 2 mmol/L組主要以慢速游動，慢速運(yùn)動時間和頻率無差異性，中速運(yùn)動時間和次數(shù)稍微減少； 4 mmol/L組在給藥48 h內(nèi)行為學(xué)參數(shù)無差異性，在給藥72 h時，運(yùn)動總距離和平均速度、慢速運(yùn)動速度和次數(shù)都有顯著差異； 6 mmol/L組在給藥24 h內(nèi)行為學(xué)參數(shù)無差異性，48 h、72 h時，運(yùn)動參數(shù)出現(xiàn)差異性；高劑量組(≥8 mmol/L)低速運(yùn)動，運(yùn)動距離、運(yùn)動時間和運(yùn)動次數(shù)顯著降低，說明幼魚活動減少，行為受抑制。

圖6 暴露于不同濃度INH的斑馬魚行為軌跡圖Fig.6 Behavior trajectory of zebrafish larvae exposed to different concentrations of isonizid.

圖7-1 INH對斑馬魚行為學(xué)的影響。Fig.7-1 Impact of isonizid on the behavior of zebrafish larvae

圖7-2 INH對斑馬魚行為學(xué)的影響。Fig.7-2 Impact of isonizid on the behavior of zebrafish larvae

4 討論

INH作為重要的一線抗結(jié)核藥，對細(xì)胞內(nèi)外的結(jié)核分枝桿菌都有顯著的抑制作用，但是，在結(jié)核病的治療過程中，患者易出現(xiàn)INH造成的不良反應(yīng)或者耐藥性，從而影響了結(jié)核病的治療[13]。INH的毒性作用機(jī)制至今尚不明確，有研究認(rèn)為INH導(dǎo)致機(jī)體損傷的機(jī)理可能與線粒體氧化損傷有關(guān)，其代謝產(chǎn)物形成氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起線粒體中的酶失活，造成線粒體損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常能量代謝，造成細(xì)胞的大量凋亡，形成機(jī)體損傷[14]。

斑馬魚胚胎及其幼魚用于研究藥物的發(fā)育毒性具有獨(dú)特優(yōu)勢，其具有體外受精、繁殖周期快、易于飼養(yǎng)和前期胚胎整體透明等優(yōu)點(diǎn)[15-16]。斑馬魚幼魚運(yùn)動行為測定方便、快捷和經(jīng)濟(jì)，比起器官質(zhì)變后病理學(xué)的檢查，能更直觀地反應(yīng)幼魚的行為狀態(tài)和發(fā)育的健康程度，行為活動是評價藥物毒性最敏感的指標(biāo)[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度組INH(0、1、2、4、6、8、16 mmol/L)，對斑馬魚幼魚持續(xù)暴露72 h，并記錄幼魚的死亡率、畸形率和運(yùn)動行為學(xué)軌跡。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下，INH 的最大無毒性劑量為2 mmol/L，低劑量(1～4 mmol/L)的 INH 對斑馬魚幼魚發(fā)育毒性較低，隨著給藥劑量的增加和給藥時間的延遲，幼魚的死亡率和畸形率呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，造成脊柱彎曲和心腹水腫等多種毒性效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)分析了10 min斑馬魚幼魚行為軌跡，根據(jù)行為軌跡的運(yùn)動速度劃分為3個速度范圍：低速(<1.0 cm/s)、中速(1.0 ～6.0 cm/s)和高速(>6.0 cm/s)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著INH濃度的增高， 斑馬魚幼魚的運(yùn)動軌跡、運(yùn)動速度和運(yùn)動次數(shù)逐漸減少，高劑量(≥6 mmol/L)INH對斑馬魚幼魚的運(yùn)動行為有明顯抑制作用。

目前，關(guān)于INH的發(fā)育毒性及其作用機(jī)制研究仍處于初步探索階段。本研究初步探討了INH對斑馬魚幼魚發(fā)育和運(yùn)動行為學(xué)的影響，為進(jìn)一步闡明其發(fā)育毒性作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為指導(dǎo)臨床合理用藥、促進(jìn)其發(fā)揮疾病治療作用起著重要作用。

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Impact of isoniazid on developmental toxicity and behavior of zebrafish larvae

ZOU Yu1,2,ZHANG Yun1,HAN Li-wen1,HE Qiu-xia1，LI Zhi-ping1,3，HOU Hai-rong1，HAN Jian1，WANG Xi-min1，LI Juan-juan1,3，CEN Juan2*，LIU Ke-chun1*

(1.Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Shandong Provincial Key laboratory of Biosensors,Key Laboratory for Drug Screening Technotogy of Shandong Academy of Sciences, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 2. Henan Provincial Key Laboratory of Natural Medicine and Immune-Engineering,Henan University, Kaifeng 475001, China;3. Shanxi Medical University, Shanxi 030000, China)

∶We investigated the impact of isonizid on developmental toxicity and behavior of zebrafish larvae. Zebrafish larvae of 72 hpf growth were processed with different concentrations isonizid. We then observed their mortality, malformation rate, morphology variation and analyzed their behavior trajectory. Higher concentration isoniazid (≥4 mmol/L) has lethal effect to zebrafish larvae, which is strengthened with the increase of isoniazid concentration and action time. Isoniazid has abnormal effect on their developmental process, including spinal curvature, increased yolk sac area, pericardial edema, swim bladder loss, developmental delay of body length and organ vacuolation. The larva of isoniazid group have less behavior trajectory, lower movement number and velocity with the increase of drug concentration and action time. Results demonstrate that isoniazid (≥4 mmol/L) has lethal and abnormal effect on zebrafish larvae, and inhibiting effect on their movement behavior, dependent on dose and time.

∶ isoniazid; zebrafish larvae; developmental toxicity; behavior

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.008

2016-07-13

山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金(ZR2015YL010)；山東省科學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2013QN001)；山東省自主創(chuàng)新重大專項(xiàng)(2014ZZCX0215)；國家自然科學(xué)基金(U1204830)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目資助計劃(13A310064)

鄒玉(1991—)，女，碩士，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)。Email:15069177320@163.com

*通信作者，岑娟， Email: cenjuan@henu.edu.cn；劉可春， Email: hliukch@sdas.org

R965.1

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