HPLC法測(cè)定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚的含量

丁曉彥，劉青，賈元印，趙渤年

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東省中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014)

?

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

HPLC法測(cè)定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚的含量

丁曉彥，劉青，賈元印，趙渤年*

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東省中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014)

建立了高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚含量的方法。采用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸水(82：18，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為289 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃。測(cè)得大黃素在0.019～0.19 μg(R=0.999 9，n=5)、大黃素甲醚在0.021～0.21 μg(R=1.000 0，n=5)線性關(guān)系良好；大黃素和大黃素甲醚的平均回收率分別為98.58%、100.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.66%、1.15%。研究表明,該方法專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為同時(shí)測(cè)定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚含量的方法。

首烏益智膠囊；大黃素；大黃素甲醚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

首烏益智膠囊主要由制何首烏、益智、黃芪等10種中藥組成，具有補(bǔ)腎填精、化瘀通竅的功效，主要用于治療腎精虧虛、瘀血阻絡(luò)型血管性癡呆。制何首烏為方中君藥，而大黃素和大黃素甲醚是何首烏的主要成分，也是《中國(guó)藥典》[1]規(guī)定的制何首烏的含量測(cè)定檢測(cè)項(xiàng)之一。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明，何首烏中蒽醌類成分(AGPMT)具有抗腫瘤和提高免疫功能的作用[2]。其中，大黃素的藥理作用有抑制胰酶活性、抑菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、清除自由基、抗氧化、降低血液粘度、抑制血小板聚集、抗腫瘤及治療急性胰腺炎等[3-5]。

國(guó)內(nèi)有大量關(guān)于大黃素含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道，但采用高效液相色譜法測(cè)定大黃素和大黃素甲醚含量[6-7]的文獻(xiàn)并不多，該類報(bào)道中以測(cè)定中藥成方制劑中二者含量方法為多[8-11]，但因組方、劑型等不同，其測(cè)定方法也稍有不同。為了控制首烏益智膠囊的質(zhì)量，使其在臨床使用中更加安全有效，本文采用高效液相色譜法對(duì)首烏益智膠囊中的大黃素和大黃素甲醚含量的測(cè)定方法進(jìn)行研究，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為控制本制劑質(zhì)量提供了一種快速、便捷的科學(xué)方法。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國(guó)Waters， Waters e2695 )；Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；電子天平(德國(guó)Sartorius，BP211D)。

1.2 試劑

鹽酸、磷酸、甲醇(提取用)、三氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉為分析純，甲醇(HPLC測(cè)定用)均為色譜純，水為超純水。

1.3 試藥

大黃素對(duì)照品(批號(hào)110756-200110)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)110758-201415)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。制何首烏、益智、黃芪等中藥飲片購(gòu)自山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司中藥飲片廠，首烏益智膠囊樣品為自制3批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)289 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。以甲醇-0.1%磷酸水溶液(82:18，V/V)為流動(dòng)相，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于2 500。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

分別稱取大黃素及大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含大黃素、大黃素甲醚10 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

稱取裝量差異項(xiàng)下本膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，加硅藻土2 g，拌勻，置索氏提取器中，加甲醇100 mL，加熱回流3 h。將提取液蒸干，加8%鹽酸溶液40 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加三氯甲烷40 mL，水浴回流2 h，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，分出三氯甲烷層，酸水液層用三氯甲烷提取2次，每次40 mL，合并三氯甲烷液，用水80 mL洗滌一次，三氯甲烷液加無(wú)水硫酸鈉15 g，振搖5 min，靜置30 min，濾過(guò)。用少量三氯甲烷洗滌殘?jiān)盀V器，合并濾液、洗液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取該溶液1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

按處方組成及比例，剔除制何首烏，稱取方中其他藥味，按首烏益智膠囊的制備工藝和供試品溶液的制備方法，制得不含制何首烏的陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL,采用高效液相色譜法，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性樣品在大黃素和大黃素甲醚相同保留時(shí)間處無(wú)干擾，見圖1。

a 大黃素和大黃素甲醚混合對(duì)照品；b 首烏益智膠囊樣品；c 陰性樣品圖1 對(duì)照品、首烏益智膠囊、陰性樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Shouwuyizhi capsule，control and negative samples

2.6 線性關(guān)系考察

取大黃素濃度為9.58 μg/mL、大黃素甲醚濃度為10.26 μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量分別為 2、5、10、15、20 μL,按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果，大黃素進(jìn)樣量在0.019～0.19 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為，Y=6×106X-16 562，R=0.999 9；大黃素甲醚進(jìn)樣量在0.021～0.21μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為，Y=8×10-7X+0.008 7，R=1.000 0。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

吸取混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定大黃素和大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.46%和1.47%。

2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批(批號(hào)1)膠囊內(nèi)容物，取樣6份，分別制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。計(jì)算得到樣品中大黃素的平均含量為0.301 5毫克/粒，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.87%；大黃素甲醚的平均含量為0.474 9毫克/粒，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)(批號(hào)1)膠囊內(nèi)容物制成的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定大黃素和大黃素甲醚的峰面積值，共測(cè)5次。結(jié)果，大黃素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.33%，大黃素甲醚的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%，這表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已測(cè)定含量的供試品(批號(hào)1)適量，研細(xì)，稱取約0.5 g，精密稱定，共取6份，精密加入分別含大黃素0.41mg/mL、大黃素甲醚0.40 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果大黃素的平均回收率為98.58%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.66%(n=6)；大黃素甲醚的平均回收率為100.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.15%(n=6)，測(cè)定結(jié)果見表1～2。

表1 大黃素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of emondin recovery rate

表2 大黃素甲醚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of emondin monomenthyl ether recovery rate

2.11 樣品的測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算各樣品中大黃素和大黃素甲醚的含量，樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果表Table 3 Determination results of samples

3 討論

供試品溶液制備方法的確定既參考了《中國(guó)藥典》何首烏總蒽醌含量測(cè)定的制備方法，又結(jié)合本樣品自身的特點(diǎn)，樣品前處理方法在完全提取目標(biāo)成分的同時(shí)，盡量排除制劑輔料及其他成分，使樣品測(cè)定時(shí)免受雜質(zhì)峰干擾。

在供試品溶液制備方法中，有研究采用不同濃度甲醇或乙醇提取的方法,該方法操作簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)前期，也曾考慮采用甲醇回流提取方法制備供試液，但結(jié)果顯示，沒經(jīng)過(guò)水解得到樣品的大黃素和大黃素甲醚提取率低，且測(cè)定圖譜中其他與測(cè)定無(wú)關(guān)成分較多，故最終采用2.3所述方法制備供試液。

實(shí)驗(yàn)對(duì)大黃素和大黃素甲醚水解時(shí)間及溫度進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，沸水浴回流2 h可實(shí)現(xiàn)結(jié)合蒽醌完全水解，提取出大黃素和大黃素甲醚。實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品檢測(cè)進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)大黃素和大黃素甲醚在289 nm附近有最大吸收，故選擇波長(zhǎng)289 nm作為大黃素和大黃素甲醚含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本方法測(cè)定首烏益智膠囊中大黃素和大黃素甲醚的含量，結(jié)果可靠，且處理方法簡(jiǎn)便，流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，可用于控制其質(zhì)量。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：176-177.

[2]劉凱，鄭海生，李應(yīng)東．大黃酸的藥理作用研究述略[J]．中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(9):1732-1734．

[3]董東，董順福，韓麗琴，等．何首烏中總黃酮與微量元素含量分析及其藥效機(jī)理研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(9): 2218-2219．

[4]樓招歡，呂圭源，俞靜靜．何首烏成分、藥理及毒副作用相關(guān)的研究進(jìn)展[J]．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)[J]．2014，38(4) : 495-500.

[5]楊紅莉，葛珍珍，孫震曉．何首烏藥理研究新進(jìn)展[J]．中藥材，2013， 36(10) : 1713-1717.

[6]高燃，任愛農(nóng)，許珍珍，等．RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定五味首烏片中淫羊藿苷、大黃素和大黃素甲醚的含量[J]．藥物分析雜志，2009，29(9): 1454-1457．

[7]曾亮，趙文靜，羅展遠(yuǎn)，等．HPLC法測(cè)定人參首烏首烏膠囊中大黃素、大黃素甲醚的含量[J]．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，31(1): 46-49．

[8]畢云生，范云飛，王英萍，等．HPLC法同時(shí)測(cè)定消氮顆粒中蘆薈大黃素大黃酸大黃素大黃酚和大黃素甲醚五種成分的含量[J]．解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30(4)：324-326.

[9]程茜菲，常青，劉琦，等．高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定維血寧中虎杖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的含量[J]．中南藥學(xué)，2013，11(9)：686-689.

[10]方既明, 章懷奮．高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定麻仁丸中大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的含量[J]．中南藥學(xué)，2011，9(5)：342-346.

[11]喬立業(yè)，方李，曹燕麗，等．高效液相色譜法測(cè)定新保腎片中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[J]．藥學(xué)實(shí)踐雜志，2015，33(5)：438-440.

HPLC based content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule

DING Xiao-yan, LIU Qing, JIA Yuan-yin, ZHAO Bo-nian

(Shandong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Quality Standard Research, Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China)

∶We constructed a HPLC based content determination method for emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule. Samples were separated by C18(250 nm×4.6 nm, 5 μm) column with methanol-0.1% phosphoric acid water (82:18,V/V) as mobile phase. Determination conditions were determination wavelength of 289 nm, flow rate of 1.0 mL/min, and column temperature of 30 ℃. Better linear relationship exists in the range 0.019～0.19 μg(R=0.999 9,n=5) for emodin, and in the range 0.021～0.21 μg(R=1.000 0，n=5)for emodin monomenthyl ether. Their average recovery rates are respectively 98.58% and 100.01%, and RSDs are 2.66% and 1.15%. Results show that the method has strong specificity and accuracy, so it can be applied to simultaneous content determination of emodin and emodin monomenthyl ether from Shouwuyizhi capsule.

∶Shouwuyizhi capsule; emodin; emodin monomenthyl ether; HPLC; content determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.006

2016-04-01

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(20140ZZCX2303)

丁曉彥(1983—)，女，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。Email:kate-66@163.com

*通信作者，趙渤年，男，研究員，博士生導(dǎo)師。Email:bonianzh@163.com

R284.1

A