籽粒莧與青貯玉米混貯品質(zhì)及微生物特性研究

陶雅，李峰，高鳳芹，徐春城，孫啟忠*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

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籽粒莧與青貯玉米混貯品質(zhì)及微生物特性研究

陶雅1,2，李峰1，高鳳芹1，徐春城2，孫啟忠1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

以籽粒莧和全株玉米為原料，按不同比例10∶0(T1)、7∶3(T2)、5∶5(T3)、3∶7(T4)、0∶10(T5)混合青貯， 60 d后，檢測(cè)青貯材料的發(fā)酵品質(zhì)以及青貯前、后營(yíng)養(yǎng)成分、微生物種類、數(shù)量變化，并分析乳酸菌多樣性，以明確添加玉米對(duì)改善籽粒莧青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物特性的作用，為籽粒莧青貯飼料的開發(fā)利用提供有效途徑。結(jié)果表明，籽粒莧單獨(dú)青貯品質(zhì)不佳，通過(guò)添加玉米可顯著降低青貯材料pH和氨態(tài)氮/總氮的值，提高干物質(zhì)和總有機(jī)酸含量，當(dāng)玉米添加比例超過(guò)50%時(shí)，青貯品質(zhì)良好。在青貯發(fā)酵乳酸菌群演替過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量決定青貯飼料的乳酸/乙酸，是影響發(fā)酵品質(zhì)的主要因素之一。乳酸球菌中的腸球菌、乳球菌和類腸膜明串珠菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)，是青貯發(fā)酵的啟動(dòng)菌株，乳桿菌則是青貯穩(wěn)定期的主要菌群。

籽粒莧；玉米；青貯品質(zhì)；微生物特性

籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)又名千穗谷，為一年生草本植物，起源于中美洲和東南亞的熱帶和亞熱帶地區(qū)，中國(guó)也是籽粒莧的原產(chǎn)地之一。其適應(yīng)性強(qiáng)、種植范圍廣，在我國(guó)主要栽培于云南、四川、江西、黑龍江、內(nèi)蒙古、河北等省(自治區(qū))，面積達(dá)20多萬(wàn)hm2[1]，是一種糧飼兼用型的牧草。籽粒莧產(chǎn)量高、抗病力強(qiáng)、適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2-3]、分枝再生能力強(qiáng)，適于多次刈割，且由于富含蛋白質(zhì)和氨基酸，莖葉和籽實(shí)中粗蛋白質(zhì)含量分別為17.7%～27.1%和30%以上[4]，可視為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料資源，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

籽粒莧可以青飼，也可調(diào)制干草或制作成青貯飼料，通過(guò)青貯加工，能夠改善籽粒莧的營(yíng)養(yǎng)成分和適口性，提高消化吸收率，延長(zhǎng)保存期，緩解飼草季節(jié)性短缺的問(wèn)題。目前，籽粒莧青貯的系統(tǒng)研究報(bào)道較少，僅限于一些基礎(chǔ)性的試驗(yàn)研究[5-7]，籽粒莧蛋白含量高，難以單獨(dú)青貯，通過(guò)混合青貯改善其青貯品質(zhì)研究也鮮有報(bào)道。玉米(Zeamays)是最為常見(jiàn)的青貯原料，含糖量高，青貯成功率及青貯品質(zhì)較高[8]，因此探討添加玉米對(duì)改善籽粒莧青貯品質(zhì)的影響，對(duì)籽粒莧資源的開發(fā)利用具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)旨在研究籽粒莧與全株玉米按不同比例混貯的效果以及青貯前后微生物特性及乳酸菌多樣性，為籽粒莧青貯飼料的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市達(dá)拉特旗樹林召鎮(zhèn)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所鄂爾多斯沙地改良試驗(yàn)站(N 40°19′、E 109°59′、海拔1030～1060 m)，屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，干旱，多風(fēng)沙，年均氣溫6.5 ℃，最低氣溫-32.3 ℃，最高氣溫38.3 ℃，無(wú)霜期156 d，年降水量240～360 mm，全年蒸發(fā)量2130.2 mm。試驗(yàn)地土壤為沙壤土，有灌溉條件。

1.2 試驗(yàn)材料

青貯原料收獲于2013年8月28日，試驗(yàn)所用材料為先玉696全株玉米(播種期2013年5月13日)，于蠟熟期自試驗(yàn)田取樣。籽粒莧采自試驗(yàn)地邊緣，于結(jié)實(shí)期取樣，青貯原料營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 籽粒莧與玉米青貯原料營(yíng)養(yǎng)成分

Table 1 Nutrition content compositions ofA.hypochondriacusand corn

青貯原料Ensilagematerials干物質(zhì)Drymatter(DM,%)粗蛋白Crudeprotein(CP,%DM)可溶性碳水化合物Watersolublecarbohydrate(WSC,%DM)酸性洗滌纖維Aciddetergentfiber(ADF,%DM)中性洗滌纖維Neutraldetergentfiber(NDF,%DM)籽粒莧A.hypochondriacus28.3915.443.6334.6856.18玉米Corn30.247.266.8125.0450.35

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)(表2)。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 2 Experimental design

處理TreatmentsT1T2T3T4T5籽粒莧∶玉米A.hypochondriacus∶Corn10∶07∶35∶53∶70∶10

1.4 青貯調(diào)制

將玉米和籽粒莧切短至2～3 cm，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的重量比充分混合均勻，裝入聚乙烯袋，每袋約300 g，設(shè)3次重復(fù)，用真空包裝機(jī)抽成真空并封口，室溫條件下貯藏60 d后開封取樣分析。

1.5 營(yíng)養(yǎng)成分及青貯品質(zhì)分析

稱取20 g青貯樣品，加入180 mL去離子水，充分?jǐn)嚢柚辆鶆?，置? ℃冰箱，24 h后取出，依次用4層紗布和定性濾紙過(guò)濾，取浸提液，用于pH、有機(jī)酸和氨態(tài)氮的測(cè)定。用雷磁PHS-3C pH計(jì)測(cè)定pH[9]；用高效液相色譜儀[SHIMADZU LC-10A 型；色譜柱：Shodex Rspak KC-811S-DVB gel Column(8 mm×300 mm)；檢測(cè)器：SPD-M10AVP；流動(dòng)相：3 mmol/L高氯酸；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：50 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm]測(cè)定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[10]；采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮含量[11]。

剩余青貯樣品于60 ℃烘干48 h，測(cè)定初水分含量，將烘干樣品粉碎并過(guò)1 mm篩備用。干物質(zhì)測(cè)定采用常規(guī)烘箱烘干法[12]；可溶性碳水化合物測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[13]；粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法(GB/T6432-94KDY-9820)；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維測(cè)定采用范氏(Van Soest)法。

1.6 微生物菌群分析

采用稀釋平板涂布法對(duì)各處理新鮮材料和青貯材料中微生物菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)，乳酸菌分離選用MRS培養(yǎng)基，大腸桿菌分離選用BLB培養(yǎng)基，好養(yǎng)細(xì)菌分離選用NA培養(yǎng)基，酵母菌和霉菌分離選用PDA培養(yǎng)基。稱取5 g待測(cè)樣品，放入裝有45 mL無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)，置于搖床振蕩30 min，將得到的溶液繼續(xù)用無(wú)菌水稀釋，并吸取10-1、10-3和10-5三個(gè)稀釋度涂平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，其中MRS培養(yǎng)基上的菌落于厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，48 h后對(duì)各平板上的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)測(cè)。MRS、NA和PDA培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，BLB培養(yǎng)基購(gòu)自日水制藥株式會(huì)社。

1.7 乳酸菌多樣性分析

1.7.1 乳酸菌的分離與純化 挑取MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型菌落，在MRS平板上反復(fù)劃線分離，直到獲得該菌的純培養(yǎng)。對(duì)獲得的各菌株進(jìn)行革蘭氏染色[14]和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)[15]。凡是呈革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株，均認(rèn)為是疑似乳酸菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 乳酸菌的生理生化特征 在不同溫度(10、15、40、45 ℃)、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5、8.0)和NaCl濃度(3.0%和6.5%)條件下生長(zhǎng)試驗(yàn)參照Pang等[16]的方法進(jìn)行。乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)參照凌代文等[15]的方法進(jìn)行。

1.7.3 乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析 乳酸菌DNA的提取按照天根細(xì)菌全基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。以提取菌株的DNA為模板，對(duì)菌株16S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用引物序列27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′，由上海桑尼生物科技有限公司提供。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物27f和1492r(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，變性50 s；55 ℃，退火50 s；72 ℃，延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增片段約為1500 bp，將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作單因素方差分析，并作Duncan多重比較。利用Blast檢索系統(tǒng)在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)和EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)測(cè)序獲得的所有菌株序列信息進(jìn)行比對(duì)，選擇適當(dāng)數(shù)量與目的基因序列同源性相對(duì)較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA序列，與測(cè)定菌株的16S rDNA序列共同用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加玉米對(duì)改善籽粒莧青貯營(yíng)養(yǎng)成分的效果

經(jīng)60 d 青貯發(fā)酵后，籽粒莧單貯(T1)的DM和WSC顯著低于玉米單貯(P<0.05)，二者按不同比例混貯(T2、T3、T4)中,隨著玉米添加量的提高，DM和WSC的含量顯著升高(P<0.05)，T2與T3組WSC含量差異不顯著。籽粒莧單貯(T1)的CP和ADF含量顯著高于玉米單貯(T5)(P<0.05)，CP的含量隨玉米在混貯中的比例增加而降低，其中T2組CP含量顯著高于其他混貯處理組(P<0.05)，ADF和NDF含量在各比例的混貯處理組中沒(méi)有顯著差異(表3)。

2.2 添加玉米對(duì)籽粒莧青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

不同比例添加玉米對(duì)籽粒莧青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響見(jiàn)表4，T2、T3組乳酸含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，T1組乳酸含量最低。籽粒莧單貯(T1)、玉米單貯(T5)以及T4組乙酸含量顯著高于其他混貯處理組(P<0.05)，而T2和T3組間乙酸含量無(wú)顯著差異。添加玉米顯著降低了籽粒莧青貯發(fā)酵后的pH 值(P<0.05)，且隨玉米添入量的增加，pH 值呈下降趨勢(shì)。籽粒莧單貯(T1)中氨態(tài)氮/總氮顯著高于其他處理組(P<0.05)，為6.60%，隨玉米在青貯中的比例增加，氨態(tài)氮占總氮的百分比顯著降低(P<0.05)。除籽粒莧單貯(T1)中檢測(cè)出少量丙酸外，其他處理組中均未檢測(cè)到丙酸和丁酸。

表3 籽粒莧與玉米不同比例混貯營(yíng)養(yǎng)成分

Table 3 Nutrition content compositions ofA.hypochondriacusand corn mixed silage in different proportions

處理Treatments干物質(zhì)DM(%)粗蛋白CP(%DM)可溶性碳水化合物WSC(%DM)酸性洗滌纖維ADF(%DM)中性洗滌纖維NDF(%DM)T121.52±0.61e16.01±0.52a2.37±0.08d34.04±0.30a50.79±1.03abT225.61±0.40d12.36±0.39b3.91±0.09c29.58±0.78b51.86±0.48aT326.55±0.28c10.43±0.22c4.19±0.03c28.46±0.86b50.83±0.89abT427.46±0.08b9.81±0.41c5.11±0.02b28.88±0.11b50.80±0.52abT529.94±0.07a7.04±0.37d6.05±0.35a26.31±1.31c50.00±0.16b

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Note: Means with different letters in the same column are significantly different(P<0.05). The same below.

表4 籽粒莧與玉米不同比例混貯發(fā)酵品質(zhì)

Table 4 Fermentation quality ofA.hypochondriacusand corn mixed silage in different proportions

處理TreatmentspH乳酸Lacticacid(%DM)乙酸Acetic(%DM)丙酸Propionicacid(%DM)丁酸Butyricacid(%DM)氨態(tài)氮/總氮NH3-N/TN(%)T14.40±0.14a6.11±0.04c1.77±0.14a0.02±0.02-6.60±0.03aT24.11±0.01b7.68±0.00a1.17±0.13b--5.71±0.13bT33.96±0.02bc7.30±0.11a1.15±0.08b--5.91±0.04bcT43.93±0.01c6.74±0.33b1.74±0.06a--5.45±0.16cdT53.88±0.01c6.64±0.01b1.75±0.01a--5.48±0.06d

2.3 籽粒莧與玉米不同比例混貯可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)

籽粒莧與玉米按不同比例混合，新鮮樣品中可培養(yǎng)微生物種類和數(shù)量見(jiàn)圖1，新鮮樣品上附著的乳酸菌數(shù)量為2.10×105～1.05×107cfu/g FM，大腸桿菌的數(shù)量為7.00×106～5.10×107cfu/g FM，好氧細(xì)菌的數(shù)量為3.85×107～7.45×107cfu/g FM，酵母菌的數(shù)量為6.50×106～2.70×107cfu/g FM，霉菌的數(shù)量為0～2.00×104cfu/g FM。附著微生物中數(shù)量最多的是好氧細(xì)菌，其次是大腸桿菌和酵母菌，之后是乳酸菌，霉菌數(shù)量最少。玉米表面附著的微生物總數(shù)及乳酸菌數(shù)量均高于籽粒莧，隨著玉米混入比例的增加，各處理樣品中乳酸菌數(shù)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。

經(jīng)過(guò)青貯發(fā)酵后，乳酸菌數(shù)量達(dá)到4.40×107～2.90×109cfu/g FM，好氧細(xì)菌和酵母菌的數(shù)量變化較小，分別為1.13×106～2.2×109cfu/g FM和1.63×106～2.50×108cfu/g FM，大腸桿菌和霉菌在各處理中均未檢出。青貯樣品中乳酸菌、好氧細(xì)菌和酵母菌的數(shù)量較多，大腸桿菌和霉菌消失。籽粒莧經(jīng)青貯發(fā)酵后，乳酸菌大量繁殖，由105cfu/g FM，上升到107cfu/g FM，玉米單貯和其他混貯處理中乳酸菌數(shù)量均為107cfu/g FM左右(圖2)。

2.4 添加玉米對(duì)籽粒莧青貯中乳酸菌生物多樣性的影響

2.4.1 乳酸菌的生理生化特征 從籽粒莧與玉米不同比例混合青貯新鮮樣品中分離出乳酸菌6株，分別命名為YM1～YM6，從青貯樣品中分離出乳酸菌10株，分別命名為YMS1～YMS10，各菌株生理生化特征見(jiàn)表5。所有菌株均表現(xiàn)為革蘭氏陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶陰性，其中菌株YMS1、YMS2、YMS3、YMS5、YMS8、YMS9、YMS10為桿菌，其余菌株為球菌。菌株YM1、YMS1、YMS2、YMS3、YMS5、YMS8、YMS9、YMS10發(fā)酵葡萄糖會(huì)產(chǎn)生CO2，為異型發(fā)酵乳酸菌，而YM2、YM3、YM4、YM5、YM6、YMS4、YMS6、YMS7為同型發(fā)酵乳酸菌。大部分菌株能夠在10和40 ℃的環(huán)境條件下生長(zhǎng)，菌株YM6、YMS2、YMS8、YMS10可以在溫度為5 ℃的環(huán)境條件下正常生長(zhǎng)，在45 ℃下，僅有菌株YM1不能生長(zhǎng)。在含3.0% NaCl 的環(huán)境中，菌株YM1生長(zhǎng)微弱，其他菌株均可正常生長(zhǎng)，而在含6.5% NaCl 的環(huán)境中僅有YMS3和YMS10能夠正常生長(zhǎng)。多數(shù)菌株可在pH 值為5.0～8.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但不能在pH值為3.0的環(huán)境中生長(zhǎng)。

圖1 籽粒莧與玉米按不同比例混合新鮮樣品中微生物計(jì)數(shù)Fig.1 Microbiological analysis of fresh sample of A. hypochondriacus and corn mixed silage in different proportions

圖2 籽粒莧與玉米按不同比例混貯樣品中微生物計(jì)數(shù)Fig.2 Microbiological analysis of silage sample of A. hypochondriacus and corn mixed silage in different proportions

2.4.2 乳酸菌16S rDNA 序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將各菌株測(cè)序獲得的16S rDNA 序列信息在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)和EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Blast相似性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表6。所有序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高序列的相似性均高于99.0%。

由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，16株乳酸菌隸屬于Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus和Leuconostoc4個(gè)屬。Enterococcus包括菌株YM2、YM5、YM6和YMS7，其中YM6與Enterococcusmundtii構(gòu)成一個(gè)分支，相似度達(dá)99.79%；菌株YM2、YM5和YMS7與Enterococcuscasseliflavus的系統(tǒng)進(jìn)化位置最接近，處于同一進(jìn)化分支上，相似度均高于99.50%。菌株YM3、YM4、YMS4和YMS6隸屬于Lactococcus，并共同與Lactococcuslactissubsp.lactis構(gòu)成一個(gè)進(jìn)化分支，相似度均在99.00%以上。16S rDNA 基因序列同源性比對(duì)顯示，有7個(gè)菌株隸屬于Lactobacillus，分屬于4個(gè)種或亞種，其中YMS1和Lactobacillusrossiae構(gòu)成一個(gè)分支，序列相似度為99.93%；YMS2、YMS8、YMS9與Lactobacillusbrevis處于同一進(jìn)化分支上，相似度均在99.90%以上；YMS5和Lactobacilluspentosus構(gòu)成一個(gè)分支，序列相似度達(dá)到100.00%；YMS3和YMS10與Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum的系統(tǒng)進(jìn)化位置最接近，相似度均達(dá)100.00%。Leuconostoc僅包含菌株YM1，與Leuconostocpseudomesenteroides處于同一進(jìn)化分支上，相似度為99.93%。

經(jīng)過(guò)青貯發(fā)酵過(guò)程，各處理乳酸菌在種類和數(shù)量上均產(chǎn)生了變化(表6、圖3)，新鮮樣品上附著的基本都是乳酸球菌，包括Enterococcus、Lactococcus和Leuconostoc，而存在于青貯樣品中的既有乳酸球菌，也有乳酸桿菌，在青貯材料中，T1組僅存在Lactobacillus的兩個(gè)種，其中Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum的數(shù)量多于Lactobacillusbrevis，為該組的優(yōu)勢(shì)種；T2組存在Enterococcus、Lactococcus和Lactobacillus，其中Enterococcuscasseliflavus和Lactobacillusbrevis在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，是該組的優(yōu)勢(shì)種；Lactococcus和Lactobacillus均存在于T3組中，其中Lactobacilluspentosus為該組的優(yōu)勢(shì)種；T4和T5中僅存在Lactobacillus一個(gè)屬的乳酸菌，綜合可見(jiàn)在青貯樣品中乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)種類。

表6 乳酸菌株 16S rDNA 序列Blast比對(duì)結(jié)果

Table 6 Blast results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

來(lái)源Source處理Treat-ment菌株Strain數(shù)量Count(cfu/gFM)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Phyleticevolution近緣種Closestrelativespecies相似度Identity(%)基因庫(kù)存取號(hào)GenBankaccessionNo.新鮮樣品FreshsampleT1YM62.10×105EnterococcusmundtiiCECT97299.79AJ420806T2YM44.00×105Lactococcuslactissubsp.lactisJCM580599.00BALX01000047T2YM56.50×105EnterococcuscasseliflavusATCC4999699.79AJAM01000006T3YM34.00×106Lactococcuslactissubsp.lactisJCM580599.00BALX01000047T4YM21.50×106EnterococcuscasseliflavusATCC4999699.93AJAM01000006T5YM11.05×107LeuconostocpseudomesenteroidesKCTC365299.93AEOQ01000906青貯樣品SilagesampleT1YMS95.50×108LactobacillusbrevisATCC14869100.00KI271266T1YMS102.35×109Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917100.00ACGZ01000098T2YMS61.00×106Lactococcuslactissubsp.lactisJCM580599.00BALX01000047T2YMS74.05×107EnterococcuscasseliflavusATCC4999699.79AJAM01000006T2YMS85.00×107LactobacillusbrevisATCC1486999.93KI271266T3YMS44.50×106Lactococcuslactissubsp.lactisJCM580599.00BALX01000047T3YMS53.95×107LactobacilluspentosusJCM1558100.00D79211T4YMS22.05×107LactobacillusbrevisATCC1486999.93KI271266T4YMS33.95×107Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917100.00ACGZ01000098T5YMS16.90×107LactobacillusrossiaeDSM1581499.93AKZK01000036

圖3 基于 16S rDNA 序列分析結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences

3 討論

青貯成功與否受原料水分、糖分、附著微生物以及制作時(shí)壓實(shí)程度等因素的影響[17]，高水分且蛋白質(zhì)含量高的飼草青貯成功率較低，一般需通過(guò)混貯、低水分青貯或添加劑改善青貯品質(zhì)[18-20]。本試驗(yàn)以不同比例籽粒莧和全株玉米進(jìn)行青貯調(diào)制，與玉米混貯后青貯體系的pH和氨態(tài)氮/總氮含量顯著降低，且隨著玉米添加量增加，pH和氨態(tài)氮/總氮含量逐漸下降，當(dāng)玉米添加量大于50%時(shí)，青貯體系pH 值降低到4.0以下，發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)良。這是由于籽粒莧WSC含量低，水分含量高，發(fā)酵底物缺乏，不利于乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，添加玉米可有效提高WSC的含量，促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，快速形成理想的酸性環(huán)境，有效抑制有害微生物的活動(dòng)，減少不良發(fā)酵產(chǎn)物的形成。

莊益芬等[21-22]分別將象草和水葫蘆與玉米混貯，通過(guò)提高WSC含量使青貯品質(zhì)得到有效提高，其中乳酸含量隨著混貯中玉米比例的增加而顯著增加，但乙酸含量則顯著減少。乳酸和乙酸都是乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物，同型發(fā)酵乳酸菌經(jīng)糖代謝產(chǎn)生單一乳酸，異型發(fā)酵乳酸菌除產(chǎn)生乳酸外還會(huì)產(chǎn)生部分乙酸，由于乳酸除了可作為乳酸發(fā)酵的產(chǎn)物外，當(dāng)氧氣進(jìn)入發(fā)酵體系，它也可以被酵母菌和霉菌所利用，促進(jìn)該菌的繁殖引起霉變或二次發(fā)酵[23]，但是如果體系中存在一定的乙酸，通過(guò)維持體系的酸性環(huán)境，可以抑制二次發(fā)酵，防止青貯飼料腐敗變質(zhì)[24]。本試驗(yàn)中籽粒莧單貯(T1組)乳酸含量顯著低于其他處理組，但是T2和T3組中的乳酸含量卻顯著高于T4和T5組，且T2和T3組中的乙酸含量顯著低于T1、T4和T5組，這是因?yàn)門1、T4和T5組青貯材料中僅檢測(cè)到Lactobacillus一個(gè)屬的乳酸菌，這些乳酸菌均屬于異型發(fā)酵乳酸菌，發(fā)酵產(chǎn)物除了形成乳酸外還會(huì)形成乙酸，Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)全株玉米青貯，接種L.buchneri后乳酸含量降低，乙酸含量升高。T2和T3組中除檢測(cè)到Lactobacillus外還檢測(cè)到了Enterococcus和Lactococcus的3個(gè)種，這3種乳酸菌屬于同型發(fā)酵乳酸菌，碳源發(fā)酵產(chǎn)物只有乳酸，由此可見(jiàn)青貯體系中的乳酸和乙酸含量不僅與WSC的含量密切相關(guān)，也與青貯發(fā)酵過(guò)程乳酸菌菌群演替中優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量密不可分。

青貯發(fā)酵過(guò)程是各種微生物共同作用的結(jié)果，在整個(gè)青貯過(guò)程中微生物的種類和數(shù)量發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[26]。通常青貯原料中大腸桿菌、好氧細(xì)菌、酵母菌、霉菌等好氧性微生物數(shù)量較多，經(jīng)青貯發(fā)酵，隨著厭氧和酸性環(huán)境的形成，好養(yǎng)的和不耐酸的微生物逐漸減少，乳酸菌占優(yōu)勢(shì)。蔣慧等[27]研究駱駝刺與苜?；熨A前后乳酸菌和酵母菌的變化，發(fā)現(xiàn)與青貯原料相比，青貯后乳酸菌數(shù)量升高，酵母菌數(shù)量降低，與苜蓿單貯相比混貯處理乳酸菌含量高，酵母菌含量低。本試驗(yàn)中，經(jīng)青貯發(fā)酵乳酸菌數(shù)量增加，大腸桿菌和霉菌消失，而酵母菌數(shù)量變化較小。這可能是因?yàn)榻湍妇趨捬鯒l件下好氧種類逐漸被厭氧種類所取代，酵母菌能通過(guò)發(fā)酵糖獲取能量[28]，且酵母菌耐酸性也較強(qiáng)[29]，因此厭氧和酸性環(huán)境并沒(méi)有抑制其生長(zhǎng)。玉米上附著的乳酸菌數(shù)量高于籽粒莧，但是籽粒莧單貯后乳酸菌數(shù)量卻高于玉米單貯及混貯處理，這可能是由于乳酸菌本身也會(huì)受到酸性條件的抑制，當(dāng)乳酸菌發(fā)酵時(shí)乳酸濃度不斷積累，環(huán)境中pH降低到一定范圍，對(duì)乳酸菌造成酸脅迫，乳酸菌數(shù)量和活性都會(huì)降低[30]，籽粒莧單貯pH沒(méi)有降到理想范圍，乳酸菌生活力高于各混貯處理組。

從籽粒莧與玉米不同比例混合青貯新鮮樣品中分離出乳酸菌6株，鑒定為L(zhǎng)euconostocpseudomesenteroides、Enterococcuscasseliflavus、Lactococcuslactissubsp.lactis、Lactococcuslactissubsp.hordniae和Enterococcusmundtii5個(gè)種。從青貯樣品中分離出乳酸菌10株，鑒定為L(zhǎng)actobacillusrossiae、Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum、Lactobacillusbrevis、Lactococcuslactissubsp.lactis、Lactobacilluspentosus、Lactococcuslactissubsp.hordniae、Enterococcuscasseliflavus7個(gè)種。由各處理乳酸菌種類及數(shù)量可以看出，在青貯新鮮樣品中乳酸球菌為優(yōu)勢(shì)種類，經(jīng)過(guò)青貯發(fā)酵后，乳酸桿菌演替為優(yōu)勢(shì)菌群，且青貯前是同型發(fā)酵乳酸菌占優(yōu)勢(shì)，而到青貯發(fā)酵后期，以異型發(fā)酵乳酸菌為主。在青貯前期產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的乳酸球菌包括腸球菌、片球菌、乳球菌、明串珠菌等往往作為發(fā)酵啟動(dòng)菌株[31]，在青貯的發(fā)酵期及穩(wěn)定期，乳桿菌逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì), 成為最后發(fā)酵的主要菌群[32]。詹發(fā)強(qiáng)等[33]研究玉米青貯乳酸菌動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和片球菌屬在發(fā)酵前期一直存在,都是青貯玉米發(fā)酵的啟動(dòng)菌, 但發(fā)酵后期乳桿菌屬成為主要菌群，本試驗(yàn)結(jié)果與此基本一致。

4 結(jié)論

青貯發(fā)酵過(guò)程是各種微生物共同作用的結(jié)果，乳酸菌群演替過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量決定了青貯飼料的乳酸/乙酸，是影響發(fā)酵品質(zhì)的主要因素之一。乳酸球菌中的腸球菌、乳球菌和類腸膜明串珠菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)，為青貯發(fā)酵的啟動(dòng)菌株，乳桿菌則為青貯穩(wěn)定期的主要菌群?；谀壳把芯?，籽粒莧單獨(dú)青貯品質(zhì)不佳，當(dāng)與青貯玉米混貯，且青貯玉米比例不低于50%時(shí)，效果良好，可作為籽粒莧青貯利用的有效途徑。

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Fermentation quality and microbial characteristics ofAmaranthushypochondriacus-corn mixed silage

TAO Ya1,2, LI Feng1, GAO Feng-Qin1, XU Chun-Cheng2, SUN Qi-Zhong1*

1.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Huhhot010010,China; 2.CollegeofEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China

The fermentation quality and microbial characteristics of mixed silage made fromAmaranthushypochondriacusand corn were evaluated in this study. The two components (A.hypochondriacusand corn) were mixed at five different ratios: 10∶0 (T1), 7∶3 (T2), 5∶5 (T3), 3∶7 (T4), and 0∶10 (T5). After 60 days of fermentation, the silage quality was evaluated, and its nutritional composition, microbial community structure, quantity of lactic acid bacteria, and proportion of fresh material and silage were analyzed. The overall aim was to find a practical use forA.hypochondriacusmaterials. The results showed that the fermentation quality ofA.hypochondriacuswas poor. With the addition of corn, the pH value and NH3-N to total nitrogen ratio decreased significantly, and the dry matter (DM) and total acid content increased. When the proportion of corn in the mixture exceeded 50%, the fermentation quality was significantly improved. The lactic acid to acetic acid ratio, which is one of the main factors affecting fermentation quality, was affected by the succession of dominant lactic acid bacteria species and their quantities in silage.Enterococcus,Lactococcus, andLeuconostocspecies, which have a strong ability to produce acids, were the main species at the start of fermentation, andLactobacilluswas the main group of lactic acid bacteria in the stable phase.

Amaranthushypochondriacus; corn; fermentation quality; microbial characteristics

10.11686/cyxb2016187

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-05-09；改回日期：2016-08-04

中央公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203042)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-IGR 2015-02)資助。

陶雅(1982-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，助理研究員，碩士。E-mail: taoya2001@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail: sunqz@126.com

陶雅， 李峰， 高鳳芹， 徐春城， 孫啟忠. 籽粒莧與青貯玉米混貯品質(zhì)及微生物特性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(12): 119-129.

TAO Ya, LI Feng, GAO Feng-Qin, XU Chun-Cheng, SUN Qi-Zhong. Fermentation quality and microbial characteristics ofAmaranthushypochondriacus-corn mixed silage. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 119-129.