喹烯酮對小新月菱形藻、等鞭金藻3011的毒性效應(yīng)

劉慧慧，黃會，韓典峰，薛敬林，任傳博，張華威，羅晶晶，張秀珍

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006 )

喹烯酮對小新月菱形藻、等鞭金藻3011的毒性效應(yīng)

劉慧慧，黃會，韓典峰，薛敬林，任傳博，張華威，羅晶晶，張秀珍*

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006 )

通過分析喹烯酮對小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)和等鞭金藻(IsochrysisgalbanaParke 3011)的生長抑制、葉綠素a含量、總超氧岐化酶(T-SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量的影響，研究了喹烯酮對兩種微藻的毒性效應(yīng)。實驗結(jié)果如下：1)喹烯酮對微藻的生長抑制作用隨濃度的增大而增大。喹烯酮對小新月菱形藻的24 h-EC50為1.85 mg/L。喹烯酮對等鞭金藻3011的24 h-EC50為0.41 mg/L，表明喹烯酮對等鞭金藻3011的生長抑制作用較小新月菱形藻更敏感。2)暴露24 h后，隨著喹烯酮濃度的增大，小新月菱形藻葉綠素a含量下降；而等鞭金藻3011葉綠素a的含量基本不受影響。3)暴露24 h后，兩種海洋微藻的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性隨著喹烯酮濃度的升高均顯著增加(P<0.05)，各實驗組丙二醛(MDA)含量也高于對照組，其中等鞭金藻3011對喹烯酮更敏感，說明喹烯酮對兩種微藻均能造成氧化脅迫，對細胞造成氧化損傷。研究表明，喹烯酮對兩種微藻均具有顯著急性毒性效應(yīng)，對兩種微藻而言，喹烯酮屬于高毒物質(zhì)，等鞭金藻3011對喹烯酮更敏感。本研究可為正確評價獸藥喹烯酮的使用安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(4):17-22]

喹烯酮；小新月菱形藻；等鞭金藻3011；毒性效應(yīng)；葉綠素a；T-SOD活性

獸用藥物是以抑制動物體內(nèi)病原菌生長為主要目的而進行研發(fā)生產(chǎn)的，因此，這些藥物對存在于環(huán)境中的其他微生物同樣具有潛在危害[1]。獸藥進入水環(huán)境后會影響水生動植物及微生物的正常生理活動[2]。通過對226種抗生素的水生態(tài)毒理性進行的相關(guān)研究表明，大部分抗生素對水生生物均有不同程度的毒害作用，其中約有20%的抗生素對藻類極毒[3]。

喹烯酮是新型喹噁啉類藥物，具有良好的抗菌作用[4]；由于水溶性低，其用藥方式主要為添加到飼料中投喂。研究表明，喹烯酮的生物利用度低，90%以上以原藥形式由動物消化道排出[5]，因而會大量地隨排水進入海洋環(huán)境，然而目前尚未見關(guān)于該藥物水生態(tài)毒理方面的研究報道。

微藻作為水體的初級生產(chǎn)者，其種類多樣性和初級生產(chǎn)量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，且具有個體小、繁殖快、對毒物敏感等特點，成為監(jiān)測評價水環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[6-7]。小新月菱形藻、等鞭金藻3011是水產(chǎn)育苗生產(chǎn)中常用的餌料生物。本實驗主要研究了喹烯酮對小新月菱形藻、等鞭金藻3011的毒性效應(yīng)，旨在為正確評價獸藥喹烯酮的使用安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

LRH-250光照培養(yǎng)箱(廣州醫(yī)療器械廠)、DM500生物顯微鏡(德國徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)、U-2900紫外可見分光光度計(日立儀器(上海)有限公司)、TDL-40C離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)、JY92-2D型超聲波細胞破碎儀(寧波新芝科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗材料

小新月菱形藻(Nitzschiaclosteriumf.minutissima)和等鞭金藻3011(Isochrysisgalbana)由山東省海洋資源與環(huán)境研究院藻種室提供。喹烯酮(含量≥98%，黃色粉末)購于山東康樂動物保健有限公司?？偝趸锲缁?SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 藻種的培養(yǎng)

實驗藻種的培養(yǎng)采用f/2培養(yǎng)液(經(jīng)高溫滅菌備用)，培養(yǎng)溫度(22±1)℃，光照強度3 000 lx，光暗比為12 h ∶12 h。預(yù)培養(yǎng)3代，鏡檢細胞正常，進入對數(shù)生長期進行實驗。

1.3.2 微藻生長抑制實驗

實驗設(shè)計參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)藻類生長抑制試驗方法(No. 201)、美國國家環(huán)境保護局(US EPA)藻類毒性試驗方法(OPPTS 850.4500)[8]、中國環(huán)境保護部《化學(xué)品測試方法》(第二版)。以二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑，預(yù)實驗證明DMSO對微藻生長無影響；同時在微藻培養(yǎng)體系中6 h即可消除95%以上的喹烯酮。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)不同濃度組，同時設(shè)不添加喹烯酮和DMSO的對照組，每組3個平行。參照養(yǎng)殖生產(chǎn)中每天早、晚兩次投餌的經(jīng)驗，于8:30、16:30向微藻培養(yǎng)體系中添加藥物，分別于藥物暴露0、24 h取樣，于680 nm測吸光值，計算抑制率，用SPSS 13.0軟件計算半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)。喹烯酮對小新月菱形藻的生長抑制實驗的質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mg/L，對等鞭金藻3011的生長抑制實驗的質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。1.3.3 喹烯酮對微藻葉綠素a、T-SOD酶活性及MDA含量的影響

根據(jù)EC50選擇高、中、低3個濃度，以24 h-EC50為中濃度，小新月菱形藻培養(yǎng)體系中喹烯酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、4.0 mg/L；等鞭金藻3011培養(yǎng)體系中喹烯酮質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0 mg/L，同時設(shè)對照組，每組3個平行，藥物暴露24 h后取樣測OD680，計算細胞密度；離心收集藻細胞，分別測葉綠素a含量、T-SOD活性及MDA含量。

1.4 指標(biāo)測定1.4.1 藻液的光密度(OD680)與藻細胞密度的相關(guān)性

取處于對數(shù)生長期的藻液，將其稀釋成7個不同的吸光度梯度(OD680= 0.010～0.500)，每個梯度3個平行，分別用分光光度計測OD680、用血球計數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計藻細胞密度，利用Excel計算OD680與細胞密度之間的線性回歸方程。

1.4.2 葉綠素a含量測定

量取藻液20 mL，4 000 r/min離心10 min，收集藻細胞，加入90%丙酮5 mL，漩渦1 min，提取色素，4 ℃避光靜置24 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液，參照GB 17378.7—2007[9]中分光光度法，依次在664、647、630、750 nm下測定OD值，按式(1)計算葉綠素a含量。

ρchl-a= [11.85(OD664-OD750)-1.54(OD647-OD750)-0.08(OD630-OD750)]×v/N

式(1)

式(1)中，ρchl-a為樣品中葉綠素a含量(μg/106cell)；v為提取液定容體積(mL)；N為收集到的藻細胞數(shù)量(106cell)。

1.4.3 T-SOD活性及MDA含量測定

粗酶液的提取：將藻液于4 000 r/min離心，收集藻細胞，重新懸浮于適量預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，冰浴下超聲破碎細胞，超聲功率150 W，超聲時間30 min，鏡檢細胞破碎完全，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

T-SOD活性測定、MDA含量測定：參照黃嘌呤氧化酶法[10]測定T-SOD活力，參照硫代巴比妥酸法[11]測定MDA含量。實驗均采用南京建成生物工程研究所的總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，按照說明書中步驟進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1EC50的計算[12]

比生長率(μ)的計算見式(2)。

μ=(lnNt―lnN0)/(t―t0)

式(2)

式(2)中，Nt和N0分別為t時刻(t)和開始時(t0)的細胞密度。

抑制率的計算公式見式(3)。

抑制率(%)=(μ對照組―μ處理組)/μ對照組×100%

式(3)

式(3)中，μ對照組和μ處理組分別為對照組比生長率和處理組比生長率。

用SPSS 13.0軟件經(jīng)概率單位-濃度對數(shù)法計算各時間點喹烯酮對微藻的半數(shù)有效劑量EC50。

1.5.2 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)的形式表示。所有的實驗數(shù)據(jù)均進行單因素方差分析(One-Way-ANOVA)，若差異顯著(P< 0.05)，則進行Duncan多重比較，并用小寫字母標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹烯酮對微藻生長的影響及EC50

不同濃度喹烯酮對兩種微藻的生長抑制作用分別見圖1。與對照組相比，喹烯酮各實驗組中藻細胞的生長均受到不同程度的抑制，DMSO對微藻的生長沒有影響。喹烯酮對微藻的生長抑制作用隨濃度的增大而增大。

圖1 喹烯酮對小新月菱形藻(A)和等鞭金藻3011(B)長的抑制率Fig.1 The inhibition rate of quinocetone to Nitzschia closterium f. minutissima (A) and Isochrysis galbana Parke 3011 (B)

在24 h暴露實驗中，低濃度喹烯酮(0.1 mg/L)對小新月菱形藻的生長抑制不明顯(P> 0.05)，隨著喹烯酮濃度的增大，生長抑制作用增強，高濃度的喹烯酮(≥ 4 mg/L)幾乎完全抑制了藻細胞的生長。喹烯酮對小新月菱形藻的24 h-EC50為1.85 mg/L。

喹烯酮對等鞭金藻3011的生長抑制規(guī)律與小新月菱形藻相似，抑制率隨著喹烯酮濃度的增大和暴露時間的延長而增強。0.1 mg/L喹烯酮已顯著抑制生長(P< 0.05)；喹烯酮濃度≥1 mg/L時，則幾乎完全抑制了該藻的生長。喹烯酮對等鞭金藻3011的24 h-EC50為0.41 mg/L，表明喹烯酮對等鞭金藻3011的生長抑制作用較小新月菱形藻更敏感。

2.2 喹烯酮對微藻葉綠素a含量的影響

喹烯酮能影響小新月菱形藻的光合作用色素，隨著喹烯酮質(zhì)量濃度的增大，藻體葉綠素a含量下降。結(jié)果見表1。

表1 喹烯酮對小新月菱形藻葉綠素a含量、T-SOD活性、MDA含量的影響

Tab.1 Effects of quinocetone on contents of chlorophyll a, activities of T-SOD and contents of MDA inNitzschiaclosteriumf.minutissima

指標(biāo)Index喹烯酮質(zhì)量濃度/(mg·L-1)Massconcentrationofquinocetone01．02．04．0ρchl-a/(μg·10-6cell)0．26±0．03a0．23±0．03ab0．22±0．02ab0．19±0．02bT-SOD/(U·10-6cell)0．123±0．009a0．159±0．011b0．164±0．008b0．187±0．007cMDA/(nmol·10-6cell)3．38±0．31a4．06±0．41a5．73±0．27b6．58±0．48c

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

喹烯酮基本不影響等鞭金藻3011的光合作用色素，不同質(zhì)量濃度喹烯酮實驗組，藻體葉綠素a含量沒有差異，結(jié)果見表2。

2.3 喹烯酮對微藻T-SOD活性的影響

喹烯酮能導(dǎo)致小新月菱形藻、等鞭金藻3011體內(nèi)T-SOD活性增加，暴露24 h后各組T-SOD活性見表1和表2。

由表1可見，喹烯酮暴露24 h后，小新月菱形藻各實驗組T-SOD活性顯著高于對照組，中、低濃度組T-SOD活性差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，高濃度(4 mg/L)組T-SOD活性最高，與其他組差異顯著(P< 0.05)。由表2可見，喹烯酮暴露24 h后，等鞭金藻3011各實驗組T-SOD活性高于對照組，但只有高濃度(1 mg/L)組具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P< 0.05)。

2.4 喹烯酮對微藻MDA含量的影響

喹烯酮能導(dǎo)致小新月菱形藻、等鞭金藻3011體內(nèi)MDA含量增加，暴露24 h后各組MDA含量如表1和表2所示。

由表1可見，喹烯酮暴露24 h后，小新月菱形藻各實驗組MDA含量高于對照組，低濃度(1 mg/L)組與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，中、高濃度組差異顯著(P<0.05)。由表2可見，喹烯酮暴露24 h后，等鞭金藻3011各實驗組MDA含量高于對照組，隨著喹烯酮質(zhì)量濃度增大，MDA含量出現(xiàn)先升高、后略有降低的趨勢，與T-SOD的變化趨勢相對應(yīng)。

表2 喹烯酮對等鞭金藻3011葉綠素a含量、T-SOD活性、MDA含量的影響

Tab.2 Effects of quinocetone on contents of chlorophyll a, activities of T-SOD and contents of MDA inIsochrysisgalbanaParke 3011

指標(biāo)Index喹烯酮質(zhì)量濃度/(mg·L-1)Massconcentrationofquinocetone00．20．51．0ρchl-a/(μg·10-6cell)0．65±0．070．66±0．060．62±0．080．63±0．08T-SOD/(U·10-6cell)0．159±0．010a0．193±0．014a0．196±0．022a0．240b±0．027MDA/(nmol·10-6cell)3．38±0．314．06±0．41a5．73±0．27b6．58±0．48c

3 討論

3.1 喹烯酮對微藻的急性毒性效應(yīng)

目前關(guān)于喹烯酮的急性毒性研究常見于大鼠[13]、小鼠[14]、豬[15]等，對水生生物的毒性研究報道較少。本研究探討了喹烯酮對小新月菱形藻、等鞭金藻3011兩種常見的海洋微藻的急性毒性效應(yīng)，為喹烯酮的生態(tài)風(fēng)險評價提供依據(jù)。本研究結(jié)果喹烯酮對小新月菱形藻的24 h-EC50為1.85 mg/L；對等鞭金藻3011的24 h-EC50為0.41 mg/L。根據(jù)HJ/T 154—2004《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》[16]中的評判標(biāo)準(zhǔn)(LC50/EC50(mg/L)≤1為極高毒性，1

3.2 喹烯酮對微藻光合作用的影響

光合作用是植物、藻類賴以生存的、最基礎(chǔ)的生化過程，是利用光合色素將水和CO2轉(zhuǎn)化為氧氣和維持藻類正常生長的有機物的過程。藻類常見的3種葉綠素是葉綠素a、b和c，葉綠素a在一切浮游藻類里大約占有機物干質(zhì)量的l%～2%[18]。葉綠素a作為主要光合色素，參與光合作用中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，因此，葉綠素含量變化很大程度上決定藻類光合作用強度，在植物光合作用中起著關(guān)鍵性的作用[19]。劉霞等[20]、Megharaj等[21]、Ebenezer等[22]研究發(fā)現(xiàn)壬基酚、西維因、除草劑等均可對海洋微藻光合作用產(chǎn)生不利影響。研究污染物對海洋微藻光合作用的影響，是研究污染物海洋生態(tài)效應(yīng)的基礎(chǔ)工作之一，然而，目前尚未見喹烯酮對海洋微藻光合作用影響的研究報道。本研究結(jié)果表明，喹烯酮對小新月菱形藻葉綠素a含量有影響，暴露24 h后，隨著喹烯酮濃度的增大，小新月菱形藻葉綠素a含量下降，但是沒有統(tǒng)計學(xué)差異，推測喹烯酮對小新月菱形藻的生長抑制可能與抑制葉綠素的形成、進而抑制光合作用有關(guān)；而等鞭金藻3011葉綠素a的含量基本不受喹烯酮濃度的影響，說明喹烯酮對兩種微藻生長抑制的機理可能不同。

3.3 喹烯酮對微藻的氧化脅迫

抗氧化防御系統(tǒng)是需氧生物長期進化過程中發(fā)展起來的防御過氧化損傷的系統(tǒng)，是生物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)[23]。SOD是抗氧化防御系統(tǒng)中重要的酶，能催化生物體內(nèi)的超氧自由基(O2·-)發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2與O2，是機體內(nèi)O2·-的天然消除劑[24]。喹烯酮在動物體內(nèi)的代謝主要是通過脫氧等氧化還原反應(yīng)[25]，會對動物造成氧化脅迫，使SOD活性增強，然而目前尚未見到喹烯酮對植物或藻類SOD活性影響的研究報道。本實驗研究了喹烯酮對兩種海洋微藻T-SOD活性的影響，結(jié)果表明，暴露24 h，各實驗組微藻的T-SOD活性均顯著高于對照組，說明喹烯酮對海洋微藻造成了不同程度的氧化脅迫，這與文獻[26]報道的喹烯酮對海參造成氧化損傷相一致。

MDA是生物膜中的多種不飽和脂肪酸在活性氧自由基的攻擊下形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低基本反映了藻細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接地反映出細胞氧化損傷的程度[10]。本研究結(jié)果表明，喹烯酮暴露24 h后，各實驗組MDA含量均高于對照組，其中等鞭金藻3011實驗組MDA含量隨著喹烯酮濃度的增大出現(xiàn)先升高、后略有下降的趨勢，與T-SOD活性的變化趨勢相對應(yīng)，體現(xiàn)了等鞭金藻3011對喹烯酮氧化脅迫的響應(yīng)。

雖然各實驗組T-SOD活性顯著高于對照組，但是各實驗組MDA含量仍高于對照組，說明微藻體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗氧化酶不足以及時清除喹烯酮造成的活性氧自由基，細胞脂質(zhì)過氧化作用加劇。推測喹烯酮對微藻的毒性可能因為氧化產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物積累，造成細胞氧化損傷。

4 結(jié)論

喹烯酮對小新月菱形藻、等鞭金藻3011生長抑制作用隨濃度增大而增大，喹烯酮對小新月菱形藻的24 h-EC50為1.85 mg/L，對等鞭金藻3011的24 h-EC50為0.41 mg/L，表明喹烯酮對等鞭金藻3011的生長抑制作用較小新月菱形藻更敏感。其中，對小新月菱形藻而言，喹烯酮屬于高毒物質(zhì)，對等鞭金藻3011而言，其屬于極高毒物質(zhì)。暴露24 h后，隨著喹烯酮濃度的增大，小新月菱形藻葉綠素a含量下降；而等鞭金藻3011葉綠素a的含量基本不受影響。喹烯酮對兩種微藻均能造成氧化脅迫，對細胞造成氧化損傷，暴露24 h后，兩種海洋微藻的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性隨著喹烯酮濃度的升高均顯著增加，各實驗組丙二醛(MDA)含量也高于對照組，其中等鞭金藻3011對喹烯酮更敏感。

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Toxic effects of quinocetone onNitzschiaclosteriumf.minutissimaandIsochrysisgalbanaParke 3011

LIU Huihui, HUANG Hui, HAN Dianfeng, XUE Jinglin, REN Chuanbo, ZHANG Huawei, LUO Jingjing, ZHANG Xiuzhen*

(Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Shandong Province Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China)

Toxic effects of quinocetone onNitzschiaclosteriumf.minutissimaandIsochrysisgalbanaParke 3011 were studied through the following indexes: growth inhibition, contents of chlorophyll a, activities of the total superoxide dismutase (T-SOD) and contents of malondialdehyde (MDA). The results showed thatIsochrysisgalbanaParke 3011 was more sensitive to the growth inhibition effect of quinocetone thanNitzschiaclosteriumf.minutissima. After 24 h exposure to quinocetone, contents of the chlorophyll a ofNitzschiaclosteriumf.minutissimadecreased significantly with the increase of quinocetone concentration, whereas the contents of the chlorophyll a ofIsochrysisgalbanaParke 3011 remain unchanged. The activities of T-SOD increased significantly in tandem with quinocetone concentration; the contents of MDA in all the experimental groups were higher than that of the control group. It showed that the oxidative stress and the oxidative damage emerged with exposure to quinocetone. The purpose of the study is to provide basic data for the safety evaluation of quinocetone. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(4):17-22]

quinocetone；Nitzschiaclosteriumf.minutissima;IsochrysisgalbanaParke 3011; toxic effects; chlorophyll a; T-SOD activity

ZHANG Xiuzhen，zxz0535501@126.com

2016-03-04；接收日期：2016-04-23

山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃項目(2012GHY11517)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貝類產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊、藻類產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊(SDAIT-14-08，SDAIT-26-05)；山東省水生動物營養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位資助項目

劉慧慧(1981-)，女，副研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)化，liuhh615@163.com 通信作者：張秀珍，研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)化，zxz0535501@126.com

S94；X171.1

A

2095-1833(2016)04-00017-06