培育蟬花改善小鼠睡眠功能的試驗(yàn)研究

張忠亮，王玉芹，樊美珍

(1.浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江 嘉興 314200; 2. 浙江泛亞生命科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314200)

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培育蟬花改善小鼠睡眠功能的試驗(yàn)研究

張忠亮1,2，王玉芹1,2，樊美珍1,2

(1.浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江 嘉興 314200; 2. 浙江泛亞生命科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314200)

觀察不同劑量的人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體及菌絲體對小鼠睡眠的改善作用，健康昆明小鼠，隨機(jī)分成8組，每組10只.每天經(jīng)口灌胃給予不同劑量的人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體及蟬花菌絲體，連續(xù)給予受試物30 d后進(jìn)行直接睡眠作用試驗(yàn)、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏實(shí)驗(yàn)測定小鼠直接睡眠時間、戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時間及閾下劑量的睡眠發(fā)生率、巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏時間.結(jié)果表明，與空白對照組比較人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體300 mg/kg、900mg/kg及菌絲體900 mg/kg對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠一定的促進(jìn)作用(P<0.05)，且沒有明顯的劑量依賴關(guān)系；與空白對照比較，300 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和900 mg/kg蟬花菌絲體對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間有明顯的延長作用，但不同劑量的兩種受試藥物對巴比妥鈉睡眠潛伏期基本無影響，且均無直接至眠作用.人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對小鼠睡眠有一定的改善作用.

蟬花；蟲草；子實(shí)體；菌絲體；睡眠

蟬花(Isaria cicadae)是一種傳統(tǒng)的中藥材，與冬蟲夏草同屬于蟲草屬，為麥角菌科大蟬草(Cordyceps cicadae Shing)寄生在蟬科昆蟲山蟬、竹蟬、草蟬的若蟲上形成的子座及若蟲尸體的復(fù)合體.其藥用功效始載于南北朝劉宋時代的《雷公炮炙論》，具有透疹、疏散風(fēng)熱、熄風(fēng)止痙之功效.明代醫(yī)藥學(xué)家李時珍《本草綱目》中記載“功同蟬蛻，又止瘧.”天然蟬花其藥用部分是子座及寄主昆蟲的尸體(菌核).隨著自然環(huán)境的變化，蟬花失去了它應(yīng)有的生長環(huán)境，加之過度釆挖等使得野生蟬花資源迅速減少，資源稀缺，也成為蟬花制劑走向世界的一大障礙.目前，在微生物學(xué)及分子生物學(xué)的指導(dǎo)下，在中藥現(xiàn)代化的觀念和現(xiàn)代的制藥技術(shù)的基礎(chǔ)上蟬花人工培育及規(guī)?；a(chǎn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，彌補(bǔ)了野生資源不足的缺陷.

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)蟬花與野生蟬花有著相似的活性及營養(yǎng)成分，其中多種活性成分在體內(nèi)脂質(zhì)的運(yùn)輸與轉(zhuǎn)化代謝[1]，降血糖[2]、抗感染[3]等方面作用明顯.所以人工培養(yǎng)蟬花在醫(yī)藥學(xué)上的地位也開始被重視.然而，目前國內(nèi)外對人工培養(yǎng)蟬花改善睡眠功能的研究尚未見報(bào)道.因此，本文主要采用建立戊巴比妥鈉睡眠等動物模型來研究人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對睡眠的改善作用，為其保健功能評價、促進(jìn)蟬花蟲草系列產(chǎn)品的開發(fā)提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步解釋蟬花蟲草的改善睡眠的機(jī)制提供科研數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體(批號FY2012B05)和蟬花菌絲體(批號FY2012A02)，均由浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司提供；巴比妥鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，(批號：F20100126)；戊巴比妥鈉，上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝，(批號：F20080915)；安神補(bǔ)腦液，吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司出品，(批號：111015)；生理鹽水(KB)，自配.

1.2 動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心.

1.3 方法

1.3.1 小鼠直接睡眠實(shí)驗(yàn)

昆明種小鼠隨機(jī)分為空白對照組、陽性藥(安神補(bǔ)腦液5 mL/kg)組、人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體250、500、1 000 mg/kg 三個劑量組及蟬花菌絲體250、500、1 000 mg/kg三個劑量組，共8組，每組10只，雌雄各半.每天上午灌胃給藥(ig，0.3 mL/10g體重)，連續(xù)30 d.觀察末次給藥(Am9:00 ～10:00)1 h內(nèi)入睡小鼠數(shù)和睡眠持續(xù)時間，以翻正反射消失超過30 s為睡眠指標(biāo).

1.3.2 小鼠戊巴比妥鈉閾下催眠劑量試驗(yàn)

昆明種小鼠隨機(jī)分為對照組、陽性藥(安神補(bǔ)腦液5 mL/kg)組、人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體100、300、900 mg/kg 三個劑量組及蟬花菌絲體100、300、900 mg/kg三個劑量組，共8組，每組10只，雌雄各半.每天上午灌胃給藥，連續(xù)30 d.末次給藥2 h，小鼠腹腔注射(ip)閾下劑量戊巴比妥鈉30 mg/kg(預(yù)試表明可使10 ～20%正常小鼠翻正反射消失)，觀察記錄各組入睡小鼠數(shù)(翻正反射消失達(dá)1 min以上者).

1.3.3 小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

小鼠分組、給藥同上.末次給藥l h后，小鼠腹腔注射巴比妥鈉(240 mg/kg，預(yù)試表明可100%使正常小鼠翻正反射消失)，觀察各組小鼠巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期的變化.

1.3.4 延長小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)

小鼠分組、給藥同上.末次給藥l h后，小鼠腹腔戊巴比妥鈉(60 mg/kg，預(yù)試表明可使正常小鼠翻正反射消失達(dá)100%)，觀察小鼠戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時間有無延長.

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

計(jì)時實(shí)驗(yàn)資料(min)用方差分析，方差齊者，計(jì)算F值，不齊者，進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化(lg min)后再進(jìn)行方差分析，結(jié)果用表示.計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)資料用X2檢驗(yàn).統(tǒng)計(jì)處理以P<0.05為有顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 對小鼠直接睡眠的影響

如表1 所示，各劑量人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對小鼠的直接睡眠均無明顯作用.

組別劑量(/kg)n組別代碼直接睡眠睡眠小鼠只數(shù)睡眠持續(xù)時間/min空白對照—10KB00.0±0.0安神補(bǔ)腦液5mL10YD00.0±0.0250mg10ZST10000.0±0.0蟬花子實(shí)體500mg10ZST30000.0±0.01000mg10ZST90000.0±0.0250mg10JS10000.0±0.0蟬花菌絲體500mg10JS30000.0±0.01000mg10JS90000.0±0.0

2.2 對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的影響

結(jié)果如表2所示，與空白對照組比較，300 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體組及900 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體組和蟬花菌絲體組的小鼠睡眠只數(shù)有明顯的增加，見圖1.提示人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠一定的促進(jìn)作用.

組別劑量(/kg)組別代碼n睡眠小鼠只數(shù)睡眠小鼠百分率/%空白對照—KB1000安神補(bǔ)腦液5mLYD106**60蟬花子實(shí)體100mgZST10010220300mgZST300105**50900mgZST900104*40蟬花菌絲體100mgJS10010110300mgJS30010330900mgJS900104*40

圖1 人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的影響

2.3 對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

結(jié)果如表3，圖2所示，與空白對照組比較，各劑量的人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體或蟬花菌絲體對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期無明顯的影響.

圖2 人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

表3 人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

2.4 對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間的影響

結(jié)果如表4 ，圖3所示，與空白對照組比較，300 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和900 mg/kg蟬花菌絲體對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間有明顯的延長作用.

組別劑量/kg組別代碼n睡眠持續(xù)時間/lgminKB對照—KB101.161±0.188安神補(bǔ)腦液5mLYD101.335±0.095*蟬花子實(shí)體100mgZST100101.296±0.120300mgZST300101.494±0.216**900mgZST900101.207±0.246蟬花菌絲體100mgJS100101.188±0.462300mgJS300101.265±0.153900mgJS900101.431±0.191**

圖3 人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，人體通過充分睡眠可使疲勞神經(jīng)細(xì)胞的生理功能恢復(fù)正常，精神和體力得到恢復(fù)[4].同時，睡眠過程中垂體前葉的生長激素分泌增高，對機(jī)體生長有顯著的促進(jìn)作用， 激素調(diào)節(jié)過程中核蛋白合成增加，有利于記憶力改善[5].睡眠不佳或不足會導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，免疫系統(tǒng)紊亂，使患病機(jī)率明顯增加[6-8].西藥如安定等在改善睡眠的研究較為集中，雖然在一定程度上效果明顯，但長期服用的依賴性與成癮性很難克服.蟬花為蟲生真菌，是一種傳統(tǒng)的中藥材，服用無依賴性.在宋代唐慎微所著的《經(jīng)史證類備急本草》就有記載：“蟬花味甘寒，無毒，主小兒天吊，驚癇，夜啼，瘛疭，心悸”，從安全性及有效性兩個角度對蟬花給予肯定.因此，對人工蟬花培養(yǎng)物的深入研究及科學(xué)開發(fā)改善睡眠的藥品及保健品不僅是宏揚(yáng)中醫(yī)中藥養(yǎng)生保健的重要課題，而且有一定的社會意義.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)給予受試物30 d后，與空白對照組比較人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體300 mg/kg、900 mg/kg及菌絲體900 mg/kg對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠一定的促進(jìn)作用(P< 0.05)，且沒有明顯的劑量依賴關(guān)系；與空白對照組比較，300 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和900 mg/kg蟬花菌絲體對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間有明顯的延長作用；但不同劑量的兩種受試藥物對巴比妥鈉睡眠潛伏期基本無影響，且均無直接至眠作用.表明人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和蟬花菌絲體對小鼠睡眠有一定的改善作用.

γ-氨基丁酸(簡稱GABA)是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，也哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，在睡眠調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[9-10].γ-氨基丁酸GABA通過增強(qiáng) GABAA受體的功能從而延長戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間[11].本研究結(jié)果表明，與空白對照組比較，300 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和900 mg/kg蟬花菌絲體對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間有明顯的延長作用，推測蟬花蟲草系列產(chǎn)品可能是通過 GABAA受體的特殊結(jié)合位點(diǎn)(BZD 位點(diǎn))與受體相結(jié)合[12-13]進(jìn)而發(fā)揮到治療作用.由此，可間接推測蟬花蟲草的某些化學(xué)成分也可能通過對BZD 位點(diǎn)的作用，進(jìn)而增強(qiáng) GABA 與 GABAA受體的結(jié)合，發(fā)揮改善睡眠作用.因此，采用 ELISA法測定與BZD受體拮抗劑協(xié)同給藥后小鼠頭部 GABA 含量也是本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步關(guān)注的重點(diǎn).

5-HT 是機(jī)體調(diào)節(jié)睡眠及覺醒周期的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于松果體和下丘腦[14].5-HT 的合成過程中色氨酸羥化酶及5-HTP 脫羧酶起著重要的作用.當(dāng)兩種酶的活性受到抑制時，5-HT 在腦內(nèi)的合成量減低，表現(xiàn)出失眠.藥理學(xué)而言，睡眠作用與 5-HT 具有相關(guān)性主要體現(xiàn)在兩個角度，戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期縮短、睡眠時間延長，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明300 mg/kg人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體和900 mg/kg蟬花菌絲體對戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間有明顯的延長作用，但不同劑量的兩種受試藥物對巴比妥鈉睡眠潛伏期基本無影響，說明蟬花蟲草人工培養(yǎng)物可能與 5-HTP 產(chǎn)生協(xié)同作用并使小鼠腦內(nèi) 5-HT 含量變化從而延長了睡眠時間.另一方面，5-HT在動物體內(nèi)與不同的受體結(jié)合可產(chǎn)生不同的作用.影響睡眠時間而不影響睡眠潛伏期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是蟬花蟲草人工培養(yǎng)物同時激活和關(guān)閉了5-HT的不同受體而致.具體機(jī)制有待于深入研究.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，各給藥組別均未發(fā)現(xiàn)有直接睡眠現(xiàn)象.在巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)中與空白對照組比較人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體300 mg/kg和900 mg/kg及蟬花菌絲體900 mg/kg，小鼠入睡率呈顯著性差異.300 mg/kg劑量組的作用效果與陽性對照組相當(dāng)，表明人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體及蟬花菌絲體對注射閾下劑量巴比妥鈉小鼠的入睡率的提高具有促進(jìn)作用，且該作用在一定程度上呈正相關(guān)趨勢；對小鼠睡眠潛伏期的影響實(shí)驗(yàn)，各給藥組別低、中、高劑量與空白對照組比較小鼠睡眠潛伏期未見顯著差異，說明蟬花人工培養(yǎng)物改善睡眠過程并不影響睡眠的潛伏期；對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響，人工培養(yǎng)蟬花子實(shí)體300 mg/kg和及菌絲體900 mg/kg對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間有顯著延長作用，各與空白對照組比較均存在顯著差異，且未見明顯的劑量依賴關(guān)系.根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》對改善睡眠保健食品的判定標(biāo)準(zhǔn)可知，延長戊巴比妥鈉睡眠時間、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠和巴比妥鈉睡眠潛伏期三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中二項(xiàng)陽性，且無明顯直接睡眠作用，可判定該受試樣品具有改善睡眠功能作用.本研究結(jié)果不僅為蟬花蟲草培養(yǎng)物功能食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，也將為蟬花蟲草改善睡眠機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ).

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Experimental study of effect for synnema and mycelial of Isaria cicadae on sleeping

ZHANG Zhong-liang1,2, WANG Yu-qin1,2,FAN Mei-zhen1,2

(1.ZheJiang Bioasia Pharmaceutical Co.,Ltd , Jiaxing 314200, China; 2.Zhe Jiang Bioasia Life Science Research Institute , Jiaxing 314200, China)

To observe the effects of synnema and mycelial of Isaria cicadae improve the role of sleep in mice, Kunming mice were randomly divided into 8 groups, 10 for every group. Per day orally given different doses of synnema and mycelial of Isaria cicadae, after continuous administration of the test substance of 30 days, the experiments were performed, incliding direct effects of sleep test, extend pentobarbital sleep time experiment, direct sleep threshold dose of pentobarbital sodium pentobarbital sodium hypnotic sleep latency test and mice experimentally determined time, pentobarbital sodium-induced sleep time subthreshold dose of sleep and the incidence of sodium pentobarbital-induced sleep latency. Results indicated that compared with control group, the group synnema of Isaria cicadae (300 mg/kg; 900 mg/kg) and mycelial of Isaria cicadae (900 mg/kg) certain role for subthreshold dose of pentobarbital sodium-induced sleep in mice (P<0.05) and no clear dose-dependent manner. The control compared with control group, the group of synnema of Isaria cicadae (300 mg/kg; 900 mg/kg) and mycelial of Isaria cicadae (900 mg/kg) pentobarbital induced sleep time in mice significantly prolonged action. However, two different doses of the test drug sodium pentobarbital no effect on sleep latency, and there were no direct role to sleep. The synnema and mycelial of Isaria cicadae have some improvement on mice sleep.

Isaria cicadae; cordyceps; synnema; mycelial; sleeping

2015-06-25.

張忠亮 (1983-)，男 ，博士，研究方向：藥物的新劑型與質(zhì)量評價.

樊美珍 (1944-)，女 ，博士，博士生導(dǎo)師 ，研究方向：蟲生真菌的產(chǎn)業(yè)化培育及健康食品研發(fā).

R285

A

1672-0946(2016)06-0663-05