檳榔堿對(duì)小鼠體內(nèi)致突變的研究

摘 要：通過(guò)小鼠骨髓細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討檳榔堿對(duì)DNA的損傷機(jī)制。采用AO探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，激光共聚焦顯微鏡觀(guān)測(cè)檳榔堿對(duì)骨髓細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA的影響；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)檳榔堿對(duì)骨髓細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)證明檳榔堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的DNA有一定的損傷作用，具有一定的遺傳毒性。

關(guān)鍵詞：檳榔堿；DNA；RNA；細(xì)胞周期

檳榔（Arecacatechu）是棕櫚科檳榔屬植物。檳榔中含有多種生物堿，其中主要有檳榔堿、檳榔次堿、次甲基檳榔次堿。

檳榔堿為擬膽堿藥，是M、N受體激動(dòng)劑，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有擬膽堿作用，能使瞳孔縮小、眼內(nèi)壓下降，并且可以促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮，增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)及消化液分泌，興奮子宮平滑肌。

1 藥理作用

由于檳榔中包含生物堿、多酚、植物油等化學(xué)成分，其藥理作用主要有：驅(qū)蟲(chóng)、抗抑郁、降低膽固醇、抗疲勞、對(duì)消化系統(tǒng)的作用等。

1.1 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用

據(jù)研究資料顯示，中樞性M受體拮抗劑東莨菪堿具有拮抗檳榔堿的自主活動(dòng)的作用[1]；另一種M受體拮抗劑甲基東莨菪堿以及煙堿受體（N受體）拮抗劑卻不能拮抗檳榔堿的自主活動(dòng)作用[2]。說(shuō)明檳榔堿對(duì)神經(jīng)中樞有非常顯著的抑制作用。

1.2 檳榔提取物對(duì)小鼠抗疲勞作用

疲勞是指機(jī)體生理過(guò)程不能維持其機(jī)能在一個(gè)特定水平上或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。檳榔提取物能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，顯著增加小鼠體內(nèi)肝糖原含量，明細(xì)降低血清乳酸水平及小鼠血尿素氮含量，具有較強(qiáng)緩解機(jī)體疲勞的作用。

2 毒理作用

檳榔的毒理作用主要有致癌、致突變，生殖毒性，神經(jīng)系統(tǒng)毒性等。

2.1 致癌、致突變

世界衛(wèi)生組織在全世界范圍內(nèi)做過(guò)一個(gè)調(diào)查，在存在嚼食檳榔習(xí)慣的地區(qū)，口腔癌的發(fā)病率高于其他地區(qū)，在東南亞地區(qū)最為嚴(yán)重。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明檳榔及其提取物可導(dǎo)致口腔癌及各種口腔疾病的發(fā)生。因此，檳榔被世界衛(wèi)生組織確定為第一類(lèi)致癌物。

2.2 生殖毒性

研究檳榔煎煮液對(duì)小鼠生育能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著煎煮液劑量的增加，小鼠的受孕率逐漸降低趨勢(shì)，并且新生小鼠體重較正常要輕。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明檳榔會(huì)影響小鼠的生育及發(fā)育能力，因此可以推測(cè)檳榔對(duì)機(jī)體的生殖系統(tǒng)具有一定的毒性作用。

2.3 神經(jīng)系統(tǒng)毒性

檳榔嚼塊中的檳榔堿能夠產(chǎn)生一定的神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，檳榔嚼塊中的主要成分檳榔堿能增強(qiáng)小鼠嗎啡誘導(dǎo)的急性高活動(dòng)性和嗎啡行為敏化的形成。檳榔嚼塊如果與嗎啡共同使用，則可以增強(qiáng)嗎啡的成癮性，如果合用還有可能造成多藥濫用的危險(xiǎn)。

3 檳榔堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)DNA的影響

3.1 實(shí)驗(yàn)方法

（1）試驗(yàn)動(dòng)物的分組及染毒：把小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，雌雄各半。再分別給小鼠染毒。染毒劑量分為1/4 LD50、1/8 LD50、1/16 LD50，設(shè)空白對(duì)照組用生理鹽水重復(fù)上述操作。每個(gè)檳榔堿染毒組分別染毒14d，固定每天上午9時(shí)染毒一次。第14d染毒后要禁食、自由飲水24h之后用于實(shí)驗(yàn)。

（2）激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定檳榔堿對(duì)骨髓細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA

的影響：取小鼠股骨的骨髓細(xì)胞，進(jìn)行過(guò)濾，離心，制備人工貼壁細(xì)胞，使用熒光探針AO染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察，使用488nm氬離子激光激發(fā)熒光染料AO。選取10個(gè)細(xì)胞作為標(biāo)本，并去標(biāo)本若干。激光掃描共聚自動(dòng)處理得出RNA/DNA的像素比值，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（如表1）

（3）流式細(xì)胞儀測(cè)定檳榔堿對(duì)骨髓細(xì)胞周期的影響：取小鼠股骨的骨髓細(xì)胞，進(jìn)行過(guò)濾，離心，制備細(xì)胞懸液，用PI染色，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定骨髓細(xì)胞的周期，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)大于630nm。每份樣品選取10000個(gè)細(xì)胞，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（如表2）

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：給予檳榔堿1/4 LD50、1/8 LD50、1/16 LD50劑量的染毒組RNA/DNA的熒光像素比值明顯高于空白對(duì)照組，結(jié)果表明，檳榔堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞DNA、RNA有明顯的損壞作用。

流式細(xì)胞儀測(cè)定檳榔堿對(duì)骨髓細(xì)胞周期的影響：結(jié)果顯示，染毒組小鼠骨髓細(xì)胞周期與空白對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比率非常顯著增加，S期細(xì)胞比率非常顯著降低，隨著染毒劑量的增加，1/4 LD50、1/8 LD50、1/16 LD50染毒劑量組的RNA與DNA比值與空白對(duì)照組相比均有顯著上升，RNA的量明顯增加，DNA的量明顯降低，提示可能是檳榔堿干擾DNA的模板功能，與DNA共價(jià)結(jié)合引起復(fù)制期間核苷酸錯(cuò)配，或是與DNA發(fā)生交聯(lián)，還可能是引起DNA斷裂，從而阻斷DNA復(fù)制，提示檳榔堿對(duì)DNA合成有一定的抑制作用。

1/4 LD50、1/8 LD50、1/16 LD50劑量組染毒的小鼠，骨髓細(xì)胞在G1期細(xì)胞比率有明顯增加，G2/M期細(xì)胞比率有明顯降低，證明檳榔堿可使骨髓細(xì)胞增長(zhǎng)阻滯在G1期，從而影響S期DNA的合成，進(jìn)而減少進(jìn)入G2/M期細(xì)胞數(shù)。綜上所述，檳榔堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的DNA有一定的損傷作用，具有一定的遺傳毒性。

參考文獻(xiàn)

[1]Pradhan SN，Dutta SN.Behavioral effects of arecoline inrats[J]. Psychopharmacologia，2010，17（1）：49-58.

[2]Molinengo L，F(xiàn)undaro AM，Cassone MC.Actionof a chronic arecoline administration onmouse motility and on acetylcholine concentrations in the CNS[J]. J Pharm Pharmacol，1988，40（11）：821-823.

作者簡(jiǎn)介：李連闖（1980-），男，黑龍江省哈爾濱市人，講師，碩士，從事藥劑學(xué)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。