灰團(tuán)網(wǎng)菌的生活史

史立平，李 玉

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034；

2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所，吉林 長(zhǎng)春 130118）

灰團(tuán)網(wǎng)菌的生活史

史立平1，李 玉2

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034；

2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所，吉林 長(zhǎng)春 130118）

采用基物培養(yǎng)、燕麥－瓊脂培養(yǎng)技術(shù)及掃描電鏡技術(shù)對(duì)灰團(tuán)網(wǎng)菌的個(gè)體發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了研究，在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上完成了從孢子到孢子的生活史.結(jié)果表明：灰團(tuán)網(wǎng)菌生活史包括單核的黏變形體或游動(dòng)胞、多核的營(yíng)養(yǎng)體原質(zhì)團(tuán)以及孢子形成階段.孢子球形，表面具疣突；孢子萌發(fā)為孔式，一個(gè)孢子可釋放一個(gè)黏變形體.黏變形體常行變形運(yùn)動(dòng)，在有水的條件下，可轉(zhuǎn)變?yōu)橛蝿?dòng)胞并具有游動(dòng)的特性.合子形成原質(zhì)團(tuán).成熟原質(zhì)團(tuán)白色，類(lèi)型為顯型，具有扇形網(wǎng)絡(luò)狀菌脈.瓊脂培養(yǎng)基上獲得的灰團(tuán)網(wǎng)菌孢子與野生型相似，并具有可育性.

黏菌；燕麥瓊脂培養(yǎng)；孢子形成；原質(zhì)團(tuán)

黏菌的生活史對(duì)于研究其營(yíng)養(yǎng)方式的多樣性以及系統(tǒng)發(fā)育等具有重要價(jià)值.目前國(guó)際上有近100個(gè)品種的黏菌已在培養(yǎng)基上完成了其生活史［1－4］，而國(guó)內(nèi)有關(guān)黏菌生活史的報(bào)道很少［5－11］.灰團(tuán)網(wǎng)菌屬團(tuán)網(wǎng)菌目、團(tuán)網(wǎng)菌科、團(tuán)網(wǎng)菌屬.子實(shí)體為孢囊，散生、群生或2～20個(gè)柄相連成束，亞圓柱形或卵圓形，少為寬卵形；徑可達(dá)0.8mm，高0.3～4.0mm.孢囊淺灰、黃褐至赭色；囊被薄、凋落，但常有殘片附著在伸展的孢網(wǎng)上；柄細(xì)，同色或稍暗，有時(shí)近黑色，柄長(zhǎng)0.2～2.0mm，常聯(lián)合成束；孢絲同色，連著牢固，網(wǎng)眼密（見(jiàn)圖1A）.資料記載分布全球，原質(zhì)團(tuán)白色.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試菌種為2002年8月在吉林蛟河、長(zhǎng)白山二道白河、吉林敦化采集到的灰團(tuán)網(wǎng)菌的原質(zhì)團(tuán)及子實(shí)體.依據(jù)子實(shí)體及孢子等特征進(jìn)行鑒定.

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)、醫(yī)用蒸汽消毒鍋、離心機(jī)、真空干燥箱、人工氣候箱；顯微成像系統(tǒng)，日本Hitachis-570掃描電鏡等.

1.2 方法

采用基物培養(yǎng)技術(shù)［12－14］、燕麥瓊脂培養(yǎng)技術(shù)［6，15－16］及掃描電鏡技術(shù)（SEM）.

電鏡觀察：先在樣臺(tái)上粘貼雙面膠，然后將成兩個(gè)熟子實(shí)體牢固置于雙面膠上.其中的一個(gè)子實(shí)體在解剖鏡下剝開(kāi)上半部囊被使孢子暴露，經(jīng)離子濺射儀噴金后上鏡觀察，同時(shí)拍照.應(yīng)用顯微測(cè)微尺測(cè)量黏變形體和游動(dòng)胞大小，測(cè)100個(gè)，計(jì)算其平均值.

2.1 孢子及其萌發(fā)

孢子成堆時(shí)呈淺灰或淺黃色，光鏡下無(wú)色，球形.電鏡下觀察，囊被薄，孢子凹陷，直徑6～8μm，有細(xì)小疣點(diǎn)和少量較大疣點(diǎn)（見(jiàn)圖1B）；孢絲細(xì)線形，成網(wǎng)狀，具刺.孢子干燥時(shí)稍凹陷，遇水或營(yíng)養(yǎng)提取液立即變?yōu)榍驁A形（見(jiàn)圖1C）.懸滴培養(yǎng)的孢子即將萌發(fā)時(shí)其原生質(zhì)稍增大，并緩慢地運(yùn)動(dòng).孢子懸浮6d后開(kāi)裂，萌發(fā)類(lèi)型為孔式.灰團(tuán)網(wǎng)菌孢子萌發(fā)率很低，約30%.

圖1 灰團(tuán)網(wǎng)菌掃描電鏡觀察及野生子實(shí)體

2.2 黏變形體與游動(dòng)胞

孢子壁開(kāi)裂后可釋放1～2個(gè)原生質(zhì).原生質(zhì)在2%水瓊脂表面形成黏變形體，近于無(wú)色透明，梨形；黏變形體中央?yún)^(qū)域有一較大的細(xì)胞核，核仁大，色深、明顯.周?chē)糠值脑|(zhì)膜從不定區(qū)域向外突出，均質(zhì)狀原生質(zhì)流入其中，形成偽足，其余部分的原生質(zhì)隨著細(xì)胞形態(tài)的改變不停流動(dòng).黏變形體連續(xù)分裂使細(xì)胞數(shù)目增至數(shù)十或上百個(gè).在有水的條件下，黏變形體轉(zhuǎn)變?yōu)橛蝿?dòng)胞.游動(dòng)胞為逗點(diǎn)狀、梨狀至具鞭毛的變形蟲(chóng)狀，前端尖后端鈍圓，長(zhǎng)14.3～18.2μm （平均16.5μm，n＝100），寬5.2～7.8μm （平均6.5μm，n＝100個(gè)），以旋轉(zhuǎn)的方式并結(jié)合變形體的收縮運(yùn)動(dòng)快速游動(dòng).

2.3 合子及原質(zhì)團(tuán)的發(fā)育

黏變形體兩兩結(jié)合形成合子.合子比黏變形體大，為一圓形或近圓形結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞質(zhì)濃厚，以此可區(qū)分單細(xì)胞的黏變形體與合子.在合子內(nèi)部可觀察到原生質(zhì)的流動(dòng).合子經(jīng)過(guò)核分裂后具有2核，再通過(guò)連續(xù)的核分裂很快發(fā)育為多核的變形體結(jié)構(gòu)——幼原質(zhì)團(tuán).灰團(tuán)網(wǎng)菌原質(zhì)團(tuán)發(fā)育初期結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的針箍菌等絨泡菌目真菌的原質(zhì)團(tuán)［6］不同，未見(jiàn)蛞蝓形原質(zhì)團(tuán)，而是呈現(xiàn)不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，非常薄，菌脈細(xì).幼原質(zhì)團(tuán)之間互相融合成為較大的極性原質(zhì)團(tuán)，且原質(zhì)團(tuán)在遷移的過(guò)程中始終保持這種極性.

當(dāng)原質(zhì)團(tuán)達(dá)1mm大小時(shí)，肉眼仔細(xì)觀察可見(jiàn).從接種到出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的原質(zhì)團(tuán)約需10d.小原質(zhì)團(tuán)繼續(xù)生長(zhǎng)，并融合為幾個(gè)較大的原質(zhì)團(tuán)，最終培養(yǎng)皿中的原質(zhì)團(tuán)完全融合為一個(gè)大原質(zhì)團(tuán).原質(zhì)團(tuán)可依靠燕麥粉和水生長(zhǎng)發(fā)育，大約10d左右，白色的原質(zhì)團(tuán)可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿（見(jiàn)圖2A—C）.

圖2 灰團(tuán)網(wǎng)菌原質(zhì)團(tuán)

2.4 原質(zhì)團(tuán)

營(yíng)養(yǎng)體原質(zhì)團(tuán)成熟時(shí)具有較大的扇形結(jié)構(gòu)，白色片狀，很薄，存在于培養(yǎng)皿的表面，類(lèi)似于顯性原質(zhì)團(tuán)，具有遷移、融合和吞噬等特征.但原質(zhì)團(tuán)達(dá)不到顯性原質(zhì)團(tuán)的厚度，原質(zhì)團(tuán)內(nèi)部的顆粒物質(zhì)不明顯；芳香氣味不明顯，觸摸時(shí)會(huì)變成不定型的斑塊狀，且易于黏著.菌脈比顯性原質(zhì)團(tuán)菌脈細(xì)，直徑不超過(guò)0.5mm.低倍顯微鏡下觀察生長(zhǎng)旺盛的原質(zhì)團(tuán)菌脈，可見(jiàn)菌脈內(nèi)有許多的顆粒相互碰撞著并快速地向一個(gè)方向流動(dòng)，單向流動(dòng)時(shí)間為2～3min；接下來(lái)原生質(zhì)的流動(dòng)減慢，暫停片刻，然后開(kāi)始向反方向流動(dòng).這種往返流動(dòng)以一定的時(shí)間間隔重復(fù)進(jìn)行，間隔時(shí)間為1～3s.

原質(zhì)團(tuán)的生長(zhǎng)受酸度的影響.在pH＝4～7的范圍內(nèi)，原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)良好，顏色正常；在pH＜3時(shí)也能夠生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)緩慢.當(dāng)pH＝8時(shí)原質(zhì)團(tuán)可維持生存；當(dāng)pH＞9時(shí)，原質(zhì)團(tuán)變?yōu)闇\棕色而死亡.通過(guò)燕麥水瓊脂遷移技術(shù)，在水瓊脂培養(yǎng)基上保存的營(yíng)養(yǎng)體原質(zhì)團(tuán)達(dá)270d，原質(zhì)團(tuán)仍生長(zhǎng)良好.

2.5 子實(shí)體形成

原質(zhì)團(tuán)經(jīng)過(guò)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，積累達(dá)到一定的量，才能形成子實(shí)體.若原質(zhì)團(tuán)量很少，例如在瓊脂表面上的面積小于1cm2，則不能形成子實(shí)體.足夠量的原質(zhì)團(tuán)經(jīng)過(guò)光照和饑餓，于4～7d后開(kāi)始在培養(yǎng)皿的瓊脂表面、側(cè)壁等處形成子實(shí)體.成熟的原質(zhì)團(tuán)不經(jīng)過(guò)光照則不形成子實(shí)體.

成熟的原質(zhì)團(tuán)作為一個(gè)整體，全部參與子實(shí)體的形成.首先，培養(yǎng)皿中的原質(zhì)團(tuán)沿著原質(zhì)團(tuán)前緣和一些粗大的菌脈開(kāi)始聚集，形成一些間距比較固定、沿菌脈分布的小團(tuán)塊.團(tuán)塊開(kāi)始形成時(shí)比較扁平，形態(tài)不規(guī)則，團(tuán)塊與團(tuán)塊之間有菌脈相連，光鏡下觀察可見(jiàn)到菌脈內(nèi)有原生質(zhì)流動(dòng).接下來(lái)團(tuán)塊逐漸向上隆起，形成規(guī)則的白色球圓形突起（見(jiàn)圖3A），直徑0.5～0.8mm，突起間彼此距離為1～10mm.此時(shí)圓形突起之間的菌脈退化，菌脈內(nèi)已無(wú)原生質(zhì)流動(dòng)，直至菌脈完全消失，圓形突起間彼此獨(dú)立.此過(guò)程需要3～3.5h.多數(shù)圓球形突起繼續(xù)向上生長(zhǎng)，突起的上部由橢圓形變成圓柱狀或卵圓狀，下部逐漸變細(xì)長(zhǎng)，發(fā)育成為菌柄.最終形成圓柱狀具柄的白色幼子實(shí)體（見(jiàn)圖3B），全高3～4mm.少數(shù)圓球形突起形成的菌柄很短，或2～10個(gè)菌柄融合在一起.此過(guò)程大約需要4h.孢囊的白色外表可一直保持4～6h，后逐漸變成黃色、棕黃、棕紅、深棕至成熟的灰色（見(jiàn)圖3C—F）.菌柄最終變?yōu)闇\黃色，內(nèi)部有石灰質(zhì)沉積.從原質(zhì)團(tuán)到子實(shí)體形成至少需要14h（見(jiàn)表1）.

圖3 灰團(tuán)網(wǎng)菌子實(shí)體的形成過(guò)程

表1 灰團(tuán)網(wǎng)菌子實(shí)體的形成過(guò)程

3 討論

黏菌從孢子到孢子的培養(yǎng)由Lister在1901年首次報(bào)道，目前已有98個(gè)品種用培養(yǎng)的方法完成了其生活史［17］.然而，“盡管有許多關(guān)于黏菌的研究，但只有一些種的全部生活史的詳細(xì)情況是清楚的.普遍的生活史通常是建立在對(duì)多頭絨泡菌PhysarumpolicephalumSchwein研究的基礎(chǔ)之上的”［18］.20世紀(jì)80年代國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)始采用基物培養(yǎng)的方法獲得了一些黏菌［19］，劉樸及王琦等用基物培養(yǎng)和燕麥－瓊脂培養(yǎng)的方法對(duì)團(tuán)毛菌目Trichales黏菌的主要屬種及絨泡菌目Physarales的細(xì)弱絨泡菌Physarum tenerumRex的個(gè)體發(fā)育進(jìn)行了初步研究［20－21］，但關(guān)于灰團(tuán)網(wǎng)菌的個(gè)體發(fā)育研究尚屬首次.［22］

Gilbert曾對(duì)不同科黏菌的孢子萌發(fā)進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)黏菌的萌發(fā)能力在不同的種屬之間是有區(qū)別的；同期的Smith對(duì)5～25a的黏菌孢子進(jìn)行了萌發(fā)實(shí)驗(yàn)研究，指出所用實(shí)驗(yàn)材料的年齡與萌發(fā)率之間并無(wú)相關(guān)性.后來(lái)Elliott利用膽鹽的方法來(lái)促進(jìn)孢子萌發(fā)，取得了很好的效果.本研究將膽鹽的方法和純水培養(yǎng)進(jìn)行了比較，孢子萌發(fā)率并無(wú)明顯差別，可能是由于灰團(tuán)網(wǎng)菌孢子的萌發(fā)能力均比較弱所致.

早期的一些研究者已經(jīng)注意到黏菌營(yíng)養(yǎng)體階段（原質(zhì)團(tuán)）發(fā)生在遮陰或光線暗的地方，而子實(shí)體通常發(fā)生在暴露的地方，這似乎表明了光對(duì)黏菌子實(shí)體形成的影響.其他影響?zhàn)ぞ訉?shí)體形成的可能的重要因素包括濕度、pH和營(yíng)養(yǎng).光能誘導(dǎo)子實(shí)體的形成，原質(zhì)團(tuán)產(chǎn)孢能力依賴(lài)于被照射的原質(zhì)團(tuán)的大小，即原質(zhì)團(tuán)必須有足夠的尺寸才能產(chǎn)孢.小原質(zhì)團(tuán)不論在黑暗中饑餓多久都不形成子實(shí)體［16］.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光照饑餓技術(shù)對(duì)灰團(tuán)網(wǎng)菌限制光照及營(yíng)養(yǎng)，在純培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)形成了子實(shí)體.與已經(jīng)純培養(yǎng)成功的針箍菌Physarellaoblonga等相同，灰團(tuán)網(wǎng)菌原質(zhì)團(tuán)對(duì)光照敏感，這與William的觀察一致.［23］

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)光照饑餓技術(shù)誘導(dǎo)形成子實(shí)體，共在30個(gè)培養(yǎng)皿中成功地誘導(dǎo)得到了灰團(tuán)網(wǎng)菌子實(shí)體.生長(zhǎng)在2%水瓊脂表面的灰團(tuán)網(wǎng)菌原質(zhì)團(tuán)，在一個(gè)培養(yǎng)皿中最多可形成100多個(gè)子實(shí)體.在子實(shí)體成熟3～5d后接種孢子即可萌發(fā)并能夠長(zhǎng)成原質(zhì)團(tuán)，表明在瓊脂上培養(yǎng)成熟的灰團(tuán)網(wǎng)菌孢子具有可育性.完成從孢子到孢子的過(guò)程至少需要20d.

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Life cycle ofArcyriacinerea

SHI Li-ping1，LI Yu2
（1.Experimental Centre，Shengyang Normal University，Shenyang 110034，China；
2.Mycological Institute，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The life history of myxomycetes is of importance to study diversity of nutritive modes and phylogenesis of these organisms.Until now the reports concered were few.Moist chamber culture method，oat-agar culture method and scanning electron microscopy were used to study the process of the individual development ofArcyriacinerea.The life cycle of spore-to-spore were completed in agar culture in petridish.The result shows that the life cycle ofArcyriacinereacomprises a unicellular amoeboid or swarm cell stage，a multinucleate plasmodium stage and a sporulation stage.The spore ofArcyriacinereais globular and the spore surface is spiny.The spore germinates by means of a poriform open and releases a single myxamoeba.The myxamoeba can move by amoeboid motion.When free water is available，myxamoebae can transform into swarm cells and swim in the water.Zygote forms into plasmodium.The mature plasmodium is white.The plasmodial type is the phaneroplasmodium which appears as a fan-shaped network of veins.Spores developed on agar are fertile and resemble those on natural substrate.

Myxomycetes；oat-agar culture；sporulation；plasmodium

Q 949.32

180·6140

A

1000-1832（2012）01-0118-05

2011-08-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30770005）.

史立平（1964—），女，博士，教授，主要從事菌物發(fā)育學(xué)研究；通訊作者：李玉（1944—），男，教授，博士研究生導(dǎo)師，中國(guó)工程院院士，主要從事真菌學(xué)研究.

方 林）