RP—HPLC法測定薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷及茶多酚的含量

摘要：建立了反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定薈酚殺菌防腐劑中有效成分蘆薈苷、茶多酚的含量測定的方法。采用ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相分別為乙腈-水、0.1%磷酸水溶液-甲醇，流速為0.70 mL/min、檢測波長分別為355、279 nm，柱溫35 ℃。結果表明，蘆薈苷在0.044～0.264 mg/mL（r=0.999 2）、茶多酚在0.081 6～2.937 6 mg/mL（r=0.999 1）范圍內，其質量濃度與峰面積呈良好的線性關系；蘆薈苷的平均加樣回收率為98.25%，相對標準偏差RSD為2.07%、茶多酚的平均加樣回收率為100.31%，相對標準偏差RSD為1.42%（n=5），3個不同批次的薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷、茶多酚的平均含量分別為0.095、0.090 mg/mL。該方法操作簡便、準確度高、重現(xiàn)性好，可作為薈酚殺菌防腐劑中有效成分蘆薈苷及茶多酚的含量測定方法。

關鍵詞：薈酚殺菌防腐劑；蘆薈苷；茶多酚；反相高效液相色譜

中圖分類號：S482.2+94 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3737-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.050

Abstract： A reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC） method for determination of the content of effective components of aloin and tea polyphenols in the Hui Fen preservatives. The chromatographic conditions were as follow： ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） was used， the mobile phase was acetonitrile water，0.1% phosphoric acid-methanol and the flow rate was 0.70 mL/min， at the detection wavelength of 294 nm，and the column temperature was 35 centigrade. The results showed that there was a good linear relationship between the concentration and peak area of aloin and tea polyphenols in the range of 0.044～0.264 mg/mL（r=0.999 2） and 0.081 6～2.937 6 mg/mL（r=0.999 1）. The average recoveries of aloin was 98.25%，relative standard deviation（RSD） was 2.07% and the average recovery rate of Tea polyphenols was 100.31%，relative standard deviation（RSD） was 1.42%（n=5）. The average content of 5 different batches of aloin in AI Jie preservatives was 0.095 mg/mL，the tea polyphenols was 0.090 mg/mL. The method is simple， accurate and reproducible， can be used to control the content of active ingredient of aloin and tea polyphenol in Hui Fen preservatives.

Key words： Hui Fen preservatives； aloin； tea polyphenols； RP-HPLC

薈酚殺菌防腐劑是由湖北省藥用植物研發(fā)中心研發(fā)的一種微乳劑，主要用于由純天然植物制成的洗臉撲的殺菌及防腐。該制劑加入植物中兼具抑菌與美容作用的有效成分，既能抑制洗臉撲中細菌的生長，還能起到美容的作用。其中最主要的有效成分為蘆薈提取物中的蘆薈苷及綠茶提取物中的茶多酚。蘆薈苷能保護和營養(yǎng)皮膚、除皺祛斑、恢復細胞活力、促進細胞再生、延緩皮膚衰老，有十分明顯的美容作用[1]。蘆薈苷屬于蒽醌類成分，具有殺菌、抑菌、消炎、解毒、促進傷口愈合等作用，蘆薈的殺菌、消炎作用能有效地消除粉刺、痤瘡[2]。茶多酚因具有優(yōu)異的抗菌、抗氧化、抗癌等作用已被廣泛的用于食品、醫(yī)療、日用化工等多方面[3]。茶多酚具有廣譜的抑菌作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、部分霉菌等具有明顯的抑制作用[4]。茶多酚還是一種理想的天然抗氧化劑，具有延緩衰老和抵抗紫外線輻射等多種功效[5]。本研究利用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對復方制劑中蘆薈苷及茶多酚的含量進行測定，為建立該制劑的質量檢測標準提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

DIONEXUltimate 3000分析型液相色譜儀（戴安中國有限公司），Starsorius BSI型分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；蘆薈苷與茶多酚中的（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標準品（成都普思生物科技有限公司，批號分別為ps14082901、ps14110401，純度均大于98%），薈酚殺菌防腐劑（湖北省藥用植物研發(fā)中心自制，批號分別為150322、150323、150324、150325、150326，以蘆薈苷、EGCG計均不得少于0.08 mg/mL），薈酚殺菌防腐劑陰性對照微乳（湖北省藥用植物研發(fā)中心自制），乙腈、甲醇（色譜純，美國天地公司），其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相分別為：乙腈∶水=25∶75、0.1%磷酸水溶液∶甲醇=68∶32；流速0.7 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長分別為355、279 nm，進樣量5 μL，理論板數(shù)按蘆薈苷峰計算應不低于2 000，按（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）峰計算應不低于10 000。

1.2.2 溶液的制備

1）標準品溶液的制備。準確稱取蘆薈苷標準品0.22 mg，置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解、定容、密塞搖勻，配制成質量濃度為0.11 mg/mL的蘆薈苷標準溶液；?。?）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品1 mg，精密稱定，加甲醇溶液制成每1 mL含（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯0.1 mg的溶液備用。

2）供試品溶液的制備。精密量取25 mL樣品，過D101型大孔吸附樹脂，先用12倍量柱體積的水洗脫后，再用4倍柱體積的70%乙醇洗脫，洗脫流速為3.0 mL/min，合并洗脫液，濃縮蒸干，殘渣加甲醇溶解，過濾，定容到2 mL，密塞、搖勻，配制成供試品溶液，臨用前以0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

3）陰性對照溶液的制備。按確定的處方和工藝，將薈酚殺菌防腐劑制成不含蘆薈及綠茶提取物的制劑，參照供試品溶液的制備方法，配制陰性對照溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別準確量取5 μL供試品溶液、陰性對照溶液和蘆薈苷及EGCG標準品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，按“1.2.1”的色譜條件進行分析。

1.2.4 標準曲線的繪制 精密稱取蘆薈苷標準品，加甲醇溶解、定容、密塞搖勻，配制成0.044、0.088、0.132、0.176、0.220、0.264 mg/mL的蘆薈苷系列標準溶液；精密稱取EGCG標準品，加甲醇溶液制成質量濃度分別為0.081 6、0.326 4、0.734 4、1.305 6、2.040 0、2.937 6 mg/mL的EGCG系列標準溶液，按“1.2.1”的色譜條件進行分析，分別以蘆薈苷和EGCG的質量濃度為橫坐標、以相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5 方法學考察

1）進樣精密度試驗。分別準確量取5 μL蘆薈苷及EGCG對照品溶液，按“1.2.1”的色譜條件，注入液相色譜儀測定，重復連續(xù)進樣5次，并記錄蘆薈苷及EGCG的峰面積。

2）穩(wěn)定性試驗。取同一供試品溶液，按照“1.2.1”的色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣，注入液相色譜儀測定，分別計算蘆薈苷及EGCG峰面積的RSD。

3）重現(xiàn)性試驗。取同一批號樣品5份，每份25 mL，參照供試品溶液的制備，依次配制供試品5份，準確量取5 μL按“1.2.1”的色譜條件，注入高效液相色譜儀測定，分別計算蘆薈苷及EGCG含量的RSD。

1.2.6 加樣回收率試驗 準確量取已知含量的樣品5份，分別添加蘆薈苷及EGCG標準儲備溶液，參照“1.2.2”中的方法制備供試品溶液5份，按“1.2.1”的色譜條件測定，計算蘆薈苷及EGCG的加樣回收率。

1.2.7 樣品中蘆薈苷及EGCG的含量測定 分別稱取各批號薈酚殺菌防腐劑，參照“1.2.2”中的方法制備各供試品溶液，參照“1.2.1”的色譜條件測定，每批樣品平行測定3份，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 線性關系

將標準系列溶液每個濃度分別進樣3次，取峰面積的平均值作為縱坐標，以對照品的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，蘆薈苷回歸方程：y=71.196x-0.337 6，r=0.999 2；EGCG回歸方程：y=5.795 8x+4.333 0，r=0.999 1。結果表明，蘆薈苷在0.044～0.264 mg/mL、EGCG在0.081 6～2.937 6 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

蘆薈苷及EGCG峰與其相鄰峰分離度良好、無其他雜質峰干擾，陰性對照制劑對蘆薈苷及EGCG色譜峰的分離無干擾。HPLC圖譜見圖1～圖6。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 分別連續(xù)進樣5次測定蘆薈苷及EGCG峰面積，計算其峰面積的RSD分別為1.23%、1.12%。結果表明，該儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 經計算蘆薈苷及EGCG峰面積的RSD分別為0.50%、2.37%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗 蘆薈苷及EGCG的含量的RSD分別為0.96%、2.25%。結果表明，該測定方法重現(xiàn)性良好。

2.4 方法的準確度、檢測限和定量限

加樣回收結果（表1、表2）表明，該方法對蘆薈苷及EGCG具有良好的加樣回收率，薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷及EGCG的平均添加回收率分別為98.25%、100.31%；相對標準偏差（RSD）分別為2.07%、1.42%，均符合測定要求。在所選定的檢測條件下，儀器對蘆薈苷及EGCG的檢測限（LOD）分別為0.0073、0.010 8 mg/mL；在薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷及EGCG的定量限（LQD）分別為0.022 0、0.032 3 mg/mL。

2.5 樣品中蘆薈苷及EGCG含量測定

3批薈酚殺菌防腐劑樣品中蘆薈苷及EGCG的含量見表3、表4。結果表明，3個批次薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷及EGCG平均含量分別為0.095、0.090 mg/mL。相同工藝條件下制得的不同批次的薈酚殺菌防腐劑中，蘆薈苷及EGCG含量上存在一定差別，這種差異可能是不同批次在制備過程中存在微小差異所致。

3 討論

3.1 樣品的前處理

薈酚殺菌防腐劑中存在一定量的乳化劑及助溶劑等基質，黏度較大易產生一定的干擾。為此，本試驗對樣品的前處理方式進行了改進，精密量取25 mL樣品直接蒸干，殘渣加甲醇溶解。該制樣方法操作簡單，但殘渣中含有大量的乳化劑等基質，黏度很大，殘渣在甲醇中的溶解度較小，過濾時較為困難；精密量取25 mL樣品，過D101型大孔吸附樹脂，先用12倍量柱體積的水洗脫后，再用4倍柱體積的70%乙醇洗脫，洗脫流速為3.0 mL/min，合并洗脫液，濃縮蒸干，殘渣加甲醇溶解，結果表明，該方法能夠很好地除去制劑中的乳化劑及助溶劑等基質。

3.2 流動相的選擇

薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷的含量測定方法可直接參照《中華人民共和國藥典》2010版一部[6]的方法便能得到理想的分離效果。藥典中關于茶多酚的含量測定中的流動相不是很常見，根據(jù)前期文獻做了篩選，以甲醇∶水∶磷酸（21∶78.9∶0.1）[7]為流動相時圖譜中EGCG峰拖尾較為嚴重；流動相為0.1%磷酸水溶液∶甲醇（68∶32）[8]時，得到的圖譜分離效果較好?？紤]到實際生產情況，故最終選擇0.1%磷酸水溶液∶甲醇（68∶32）作為流動相。

3.3 結論

本試驗建立了RP-HPLC測定薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷及EGCG含量的方法。該方法簡便、快速、準確、靈敏，可作為薈酚殺菌防腐劑中蘆薈苷及EGCG含量測定的方法。此研究結果可為某些乳劑劑型中同時存在乳化劑和助溶劑對測定存在較大干擾的情況下選擇適宜的前處理方式及流動相提供方法參考。

參考文獻：

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