枸杞子中OTA污染檢測方法的建立

摘要：建立枸杞子OTA污染的檢測方法，分別用100 mL甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水（4∶1）溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液等4種溶液提取寧夏枸杞子中OTA；取20 mL提取液過固相萃取柱（SPE），再用0.1 mol/L磷酸、雙蒸水淋洗，乙酸乙酯洗脫后氮氣吹干，流動相溶解；高效液相色譜法測定，條件為C18反相柱分離，乙腈-水-乙酸（99∶99∶2）為流動相，熒光檢測器（激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長460 nm）檢測。結(jié)果表明，5% NaHCO3+1% PEG 8 000溶液為最佳提取液，SPE柱純化后，HPLC測定，平均回收率為88.6%～118.0%，變異系數(shù)為3.16%～7.54%，可以作為檢測寧夏枸杞子中OTA污染的方法。

關(guān)鍵詞：寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）；赭曲霉毒素A；固相萃取

中圖分類號：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3733-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.049

Abstract：The method of determination OTA in wolfberry with SPE-HPLC was established in this paper. The dried wolfberry was grinded and extracted Ochratoxin A with methyl alcohol-0.1 mol/L phosphoric acid（10∶1），5% NaHCO3-1% PEG 8 000，methyl alcohol-water （4∶1） and 2% NaHCO3-15% NaCl. After C18 solid phase extraction column （C18-SPE） has activated with 5 mL Methanol，5 mL double diluted water， 5 mL Sodium hydrogen carbonate（30 g/L），the above extract 20 mL was firstly brought into C18-SPE column. Then the C18-SPE column was washed with 2 mL phosphoric acid （0.1 mol/L） and 2 mL double diluted water respectively and was eluted with 5 mL ethyl acetate subsequently. The eluent was dried with N2 gas. The residue was dissolved with 0.2 mL of mobile phase for determination. The chromatographic column was C18 reversed-phase column（150 mm×4.6 mm i.d.） for separation. Mobile phase was acetonitrile-water-acetic acid（99∶99∶2）. A high performance liquid chromatography determined with fluorescence detection. The excitation wavelength is 330 nm. The emission wavelength is 460 nm.The recoveries of this method were between 88.6% and 118.0%，and coefficient of variation varied from 3.16% to 7.54%. This method can be used to detection OTA in wolfberry.

Key words：Ningxia wolfberry（Lycium barbarum L.）；Ochratoxin A；solid-phase extraction

赭曲霉毒素（Ochratoxin）是一類結(jié)構(gòu)相似的生物毒素，有OTA、OTB、OTC、OTD 4種化合物，其中OTA毒性最強(qiáng)、分布最廣、污染最嚴(yán)重，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC將其確定為2B類致癌物[1]。OTA的分子質(zhì)量為403.8，熔點169 ℃，為無色晶體，易溶于極性有機(jī)溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，在紫外光下OTA呈綠色熒光，最大吸收峰為333 nm[2]。OTA由許多霉菌產(chǎn)生，主要有炭黑曲霉（Aspergillum carbonarius）、黑曲霉（A.niger）、棘孢曲霉（A.aculeatus）、塔賓曲霉（A.tubingensis）和青霉（Penicillium spp.），這些微生物平時存在于種植園土壤及殘葉上，其中一種或幾種在果實期轉(zhuǎn)為果棲微生物并產(chǎn)生毒素，積累在干果中或隨果粒榨汁進(jìn)入發(fā)酵過程。果酒、干果食品中OTA相當(dāng)穩(wěn)定，一般的烹調(diào)和加工方法只能部分破壞[3，4]。OTA的污染在全球范圍內(nèi)都比較嚴(yán)重，不僅在糧谷類（主要是小麥、大麥、玉米和燕麥）、豆類、花生、動物飼料、葡萄、可可、咖啡豆等干果中發(fā)現(xiàn)OTA污染，而且在香料、茶葉、調(diào)味料、咖啡、巧克力、中草藥、罐頭食品、油、豆制品、啤酒、葡萄酒、葡萄汁等飲料中也已經(jīng)檢測到了OTA，甚至在以糧食為飼料動物體內(nèi)及其肉、奶和奶制品等動物性食品中也常有被OTA檢出，通過食物鏈蓄積對人類健康構(gòu)成威脅[5，6]。

枸杞子是由寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）鮮果干燥制成的干果，由于其鮮果為漿果，含水率高，且表皮有蠟質(zhì)層覆蓋。因此，制干時間需要較長，致使其易生霉變，采摘后的枸杞鮮果不經(jīng)任何處理，1 d后就會有霉菌生長，2 d后霉變率為30%～40%，3 d后則高達(dá)50%～80%。采用太陽能干燥裝置干燥枸杞，其平均霉變率也在20%左右。在霉變過程中，炭黑曲霉、黑曲霉、塔賓曲霉和青霉這些產(chǎn)OTA的菌就有可能生長繁殖并產(chǎn)生OTA毒素[7，8]。目前，關(guān)于枸杞子中OTA污染的研究鮮見報道，有必要開展關(guān)于枸杞OTA污染狀況的研究。本研究以采用有機(jī)溶劑或碳酸氫鈉等溶液為提取液提取寧夏枸杞中的OTA，再用固相萃取柱（SPE）進(jìn)一步凈化，最后以高效液相色譜（HPLC）檢測OTA，摸索一種簡便高效的測定寧夏枸杞中OTA含量的方法，為寧夏枸杞安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

枸杞子，購自寧夏銀川市同心路市場。

1.2 儀器

固相萃取裝置、C18-SPE柱（6 mL 500 mg）（美國Varian公司）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200Series，美國Agilent公司）；熒光檢測器（Agilent Technologies 1200 Series）、C18反相柱（pH 2～12）（美國Agilent公司）；微量移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.3 試劑

OTA標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，美國Fermentek公司）；乙腈和甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；其他試劑均為化學(xué)純。

OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：1 mg OTA 標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級甲醇完全溶解，定容至 50 mL（20 μg/mL，-20 ℃避光保存）。

OTA標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：取0.5 mL OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相定容至 100 mL（100 ng/mL，4 ℃避光保存）。

1.4 方法

1.4.1 樣品準(zhǔn)備 稱取枸杞子5 g，加入OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 μg/mL），放入平皿，置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥12 h，粉碎機(jī)粉碎，使70%以上的樣品顆粒直徑在1 mm以下。

1.4.2 提取 粉碎枸杞子粉末中分別加入100 mL以下提取液：甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水（4∶1）溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液，磁力攪拌30 min， 15 000 r/min離心10 min，上清液用玻璃纖維濾紙過濾，取20 mL濾液上樣。

1.4.3 凈化方法 C18-SPE凈化方法，參考文獻(xiàn)[9-11]等方法。①C18-SPE萃取柱活化。C18-SPE柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水、5 mL 30 g/L碳酸氫鈉溶液沖洗小柱，保持柱子濕潤。②上樣。當(dāng)碳酸氫鈉溶液下降到柱底時，立即將20 mL上樣液移入小柱。③淋洗。先用2 mL 0.1 mol/L磷酸淋洗，再用 2 mL超純水淋洗。④洗脫。用5 mL乙酸乙酯洗脫。用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL乙酸乙酯洗脫液到樣品瓶中，氮氣吹干。用0.2 mL色譜流動相溶解殘留物，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾至樣液瓶內(nèi)，供HPLC檢測。

1.4.4 HPLC檢測 色譜條件：參考AOAC2001方法[12，13]。色譜柱：C18反相柱（Eclipse XDB-C18分析柱，5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相∶乙腈；超純水∶冰乙酸=99∶99∶2，pH 3.2；流速：1.0 mL/min；熒光檢測條件：激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長460 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.5 指標(biāo)計算 加標(biāo)回收率=（加標(biāo)樣品測定值-空白樣品測定值）/理論加標(biāo)濃度×100%；

式中，X—樣品中OTA含量，ng/g；A—樣液 OTA峰面積；Am—標(biāo)準(zhǔn)液OTA峰面積；C—標(biāo)準(zhǔn)液OTA的濃度，ng/mL；V—處理后的最終樣液體積，mL；M—最終樣液相當(dāng)?shù)脑嚇淤|(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍和檢測限

取OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液（20 μg/mL），用流動相為溶劑，分別配制濃度為2、3、5、10、20、60、80 ng/mL的OTA標(biāo)準(zhǔn)液，按高效液相色譜法條件進(jìn)行檢測，每個標(biāo)準(zhǔn)濃度分別檢測5次。以O(shè)TA質(zhì)量濃度y（ng/mL）對峰面積x進(jìn)行回歸分析，線性方程為y=1.311 4x+0.286 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。結(jié)果表明，OTA在2.0～80.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1），OTA標(biāo)品的保留時間為7.023 min（圖2）。

2.2 不同提取溶液提取測定結(jié)果比較

稱取寧夏枸杞子5 g，加入OTA標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 μg/mL）10 μL，分別用4種提取液提取，SPE柱凈化，HPLC檢測，重復(fù)3次，結(jié)果見表1。5%NaHCO3-1% PEG 8 000溶液色譜圖見圖3。以5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液回收率最高，達(dá)88.7%，而以其他3種溶液為提取液的方法回收率在30%～67%，均未達(dá)到加標(biāo)回收率達(dá)到85%～105%的要求。因此，采用5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液為提取液。

2.3 回收率及精密度試驗

制備加標(biāo)濃度為2 ng/g的加標(biāo)樣品，5% NaHCO3-1% PEG 8 000提取，SPE凈化，HPLC檢測，重復(fù)3次。結(jié)果表明，OTA的平均回收率為88.7%，標(biāo)準(zhǔn)差為3.58，變異系數(shù)為4.04%（表2），該方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性符合要求。

2.4 加標(biāo)回收率試驗

分別制備加標(biāo)濃度為0.5、1、2、3 ng/g的加標(biāo)樣品，5% NaHCO3+1% PEG 8 000提取，SPE凈化，HPLC檢測，重復(fù)3次。結(jié)果表明，回收率為 88.6%～118.0%，變異系數(shù)為3.16%～7.54%（表3），說明該方法的回收率高，其準(zhǔn)確度能滿足要求。

3 討論

提取是OTA檢測中重要步驟，可以依據(jù)其理化性質(zhì)選用不同的提取劑，由于OTA易溶于極性有機(jī)試劑和稀碳酸氫鈉溶液性質(zhì)，通常選用有機(jī)溶劑與酸性溶液（磷酸、乙酸或檸檬酸等）或碳酸氫鈉溶液的混合提取系統(tǒng)。本試驗選取甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水（4∶1）溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液4種提取液，其中以5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液回收率最高，達(dá)88.7%，而以其他3種溶液為提取液的方法回收率在30%～67%，均未達(dá)到加標(biāo)回收率為85%～105%的要求。由于枸杞中含有大量色素和芳香物質(zhì)，這些物質(zhì)易溶于甲醇，可能出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，致使甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、甲醇-水（4∶1）溶液提取效率較低[14-17]。提取液中加入NaCl起到使溶液保持足夠電解質(zhì)離子強(qiáng)度，增加提取效率[18-21]，但本試驗中采用2% NaHCO3-15% NaCl溶液作為提取液結(jié)果并不理想，可能由于枸杞含多糖量較高，與高離子濃度的NaCl作用，使提取液中出現(xiàn)呈現(xiàn)粉狀，不易過濾，導(dǎo)致OTA殘留在殘渣中，降低提取效率。而提取液5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液中加入分子質(zhì)量8 000的聚乙二醇作為助濾劑使用，聚乙二醇較難溶解于水，不溶于甲醇，在進(jìn)行均質(zhì)并過濾時，可以有效地增加樣品顆粒的間隙，提高過濾效率[15，16]，獲得了88.7%的回收率，但回收率仍有優(yōu)化的空間，在后續(xù)試驗中可采用磷酸/鹽酸化氯仿、氯仿、二氯甲烷，可能更進(jìn)一步提高回收率[22]。

凈化也是OTA檢測中另一重要步驟，近年來免疫親和層析柱（Immuno-affinity chromatography， IAC）由于凈化效果好已被廣泛使用，SPE柱與免疫親和柱相比，使用的有機(jī)試劑較少，對環(huán)境和試驗人員的危害較小，價格相對便宜，被優(yōu)先使用[21]。本試驗采用C18-SPE柱獲得了88.6%～118.0%回收率。但由于SPE柱對樣品中OTA的作用力為非特異性吸附力，加上枸杞子中含有豐富的枸杞多糖、單糖、色素等化合物，因此在保證較高回收率的同時凈化純度可能就不太理想，從加標(biāo)樣的色譜圖中就可以反映出這一點，在精度要求更高試驗中可以采用 IAC柱來提高凈化程度[23]。

4 結(jié)論

5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液提取枸杞子中的OTA，再用固相萃取柱（SPE）進(jìn)一步凈化，最后以高效液相色譜（HPLC）檢測，平均回收率為88.6%～118.0%，變異系數(shù)為3.16%～7.54%，是一種測定枸杞子中OTA污染較為可靠的方法。

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