沙田柚F—box蛋白基因的克隆及序列分析

摘要：采用生物信息學(xué)方法，對(duì)沙田柚[Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu.]F-box蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)從序列特征、理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能域等方面進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)為1 427 bp（GenBank登錄號(hào)為KR363148），開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)為1 101 bp，共編碼366個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量43.09 ku，理論等電點(diǎn)5.15。沙田柚F-box蛋白基因編碼蛋白含有一個(gè)植物F-box蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，為親水性非分泌不穩(wěn)定蛋白，不跨膜運(yùn)動(dòng)，共有30個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)。氨基酸序列分析表明，其編碼的氨基酸與甜橙（Citrus sinensis，KDO71185）和克萊門柚（Citrus clementina，XP_006425495）F-box蛋白的同源性分別為99%、98%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，沙田柚F-box蛋白基因與與甜橙（Citrus sinensis，KDO71185）和克萊門柚（Citrus clementina，XP_006425495）親緣關(guān)系很近，屬于同一進(jìn)化分支。

關(guān)鍵詞：沙田柚[Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu.]；F-box蛋白基因；序列分析

中圖分類號(hào)：S576 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）14-3723-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.046

Abstract： The characters of the F-box protein of Citrus maxima（Burm.） Merr. cv. Shatian Yu. were analyzed and predicted by bioinformatics method，including the composition of amino acid sequence，physicochemical parameters，hydrophobicity，transmembrane domain，secondary structure and function of protein etc. The results showed that the F-box gene was 1 427 bp（GenBank accession number： KR363148） in length with an open reading frame（ORF） of 1 101 bp，encoding 366 amino acids with deduced molecular weight of 43.09 ku，and theoretical pI value of 5.15，and contained an F-box domain in N end. Bioinformatics analysis showed that the F-box protein was a hydrophilic and unstable protein， has no transmembrane domain，and there are 30 phosphorylation sites within the polypeptide chain. The homology analysis of amino acid sequence indicated that the F-box protein shared high homology with that of Citrus sinensis，KDO71185（99%） and Citrus clementina， XP_006425495（98%）. Phylogenetic analysis revealed the F-box protein gene showed closer kinship with that of Citrus sinensis and Citrus clementina，indicating that they belong to the same evolutionary branch.

Key words： Citrus maxima （Burm.） Merr. cv. Shatian Yu.； F-box protein gene； sequence analysis

自交不親和是植物界的一種普遍現(xiàn)象，根據(jù)其遺傳背景可分為孢子體自交不親和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）和配子體自交不親和（Gemetophytic self-incompatibility，GSI）兩種類型。植物自交不親和性在被子植物的有性生殖中起到避免近親繁殖的重要作用[1]，闡明自交不親和的分子機(jī)理在培育無(wú)子品種等方面具有重要的意義。近年來(lái)，薔薇科（Rosaseae）、茄科（Solanaseae）、玄參科（Scrophulariaceae）等自交不親和的研究取得了較大進(jìn)展，已確定S-核酸酶（S-RNase）為花柱S-決定子，S-核酸酶（S-RNase）是一類具有核酸酶活性的堿性蛋白[2，3]。在花粉決定因子的研究方面，Lai等[4]采用S位點(diǎn)區(qū)域染色體步移法在自交不親和的玄參科金魚草（Antirrhinum）S-locus位點(diǎn)首次獲得一個(gè)在花粉組織特異表達(dá)的F-box基因AhSLF-S2（Antirrhinum S-locus F-box S2）。Sijacic等[5]在茄科矮牽牛（Petunia inflata）中發(fā)現(xiàn)的的S-locus F-box基因PiSLF2。薔薇科植物李屬梅（Prunus mume）以及扁桃（P. dulcis）中的自交不親和S型（S-haplotype）特異性的S-locus F-box基因Pm-SLF和PdSFB的克隆，李屬甜櫻桃（Prunus avium）不同型的S-locus中6個(gè)SFB基因，PaSFB1-6的發(fā)現(xiàn)，表明介導(dǎo)GSI反應(yīng)的花粉S-決定基因可能是這些基因[6～8]。

沙田柚[Citrus maxima（Burm.） Merr. cv. Shatian Yu.]屬于蕓香科配子體高度自交不親和果樹。薛妙男等[9]確定了沙田柚為配子體自交不親和，花粉管生長(zhǎng)抑制部位在花柱的1/2，分析了沙田柚花柱蛋白以及花柱在不同發(fā)育時(shí)期的幾種同工酶特征[10，11]；秦新民等[12]對(duì)沙田柚花粉管特異蛋白進(jìn)行了分離和鑒定；薛妙男等[13]確定了花柱通道細(xì)胞中的特異蛋白；秦新民等[14，15]研究了花粉管中特異蛋白產(chǎn)生部分和分布位置。為了進(jìn)一步探討沙田柚自交不親和的機(jī)理，對(duì)自交和異交花柱進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)自交與異交花柱差異基因的比對(duì)，獲得了沙田柚F-box蛋白基因，并對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物化學(xué)特征分析，旨在為沙田柚自交不親和分子機(jī)理的深入研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

沙田柚試驗(yàn)材料采自廣西靈川縣潮田鄉(xiāng)大山口村果園十年生結(jié)果樹。在盛花期對(duì)沙田柚樣樹進(jìn)行人工自交（沙田柚×沙田柚）授粉和異交授粉（酸柚×沙田柚），分別收集自交和異交1～3 d的授粉花柱以及當(dāng)天未開花的花柱，立即放入液氮中保存，并放入-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、建庫(kù)和測(cè)序 按改良Trizol法對(duì)總RNA進(jìn)行提取[16]，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司對(duì)檢測(cè)合格的RNA進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，并隨機(jī)將mRNA打斷成片段，然后以打斷的RNA為模板，由隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，加入緩沖液、RNase H、DNA polymeraseⅠ以及dNTPs合成第2條cDNA鏈。使用試劑盒純化cDNA，用EB緩沖液洗脫后進(jìn)行末端修復(fù)和加上poly（A）以及連接測(cè)序接頭，使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)cDNA文庫(kù)的片段大小進(jìn)行檢測(cè)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Illumina HiSeqTM 2000對(duì)制備好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建 使用DNAman、ORF Finder、TMPRED、SWISS-MODEL、NetPhos 2.0等軟件對(duì)序列以及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，使用DNAman軟件對(duì)氨基酸序列F-box蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的生物信息學(xué)分析

沙田柚F-box蛋白基因（CL8619.Contig2_All）的基因組序列全長(zhǎng)為1 427 bp（GenBank登錄號(hào)為KR363148），通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的NCBI ORF Finder和生物信息學(xué)軟件DNAman進(jìn)行分析，該序列包含一個(gè)1 101 bp的開放閱讀框（ORF），編碼366個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 編碼蛋白質(zhì)的分析和疏水性預(yù)測(cè)

通過(guò)DNAMan軟件分析，該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量43.09 ku，理論pI 5.15。從圖2中可以看出，所編碼的肽鏈?zhǔn)杷宰畲笾导s為2.689，最小值約為-2.544，平均值為-0.233，屬于親水性蛋白。運(yùn)用在線分析軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析可知，該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）總數(shù)為51，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）總數(shù)為40，分子式為C1 964H2 966N492O561S20，不穩(wěn)定系數(shù)為46.99，屬于不穩(wěn)定性蛋白。

2.3 功能結(jié)構(gòu)域分析

功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖3）表明，將編碼的氨基酸序列用NCBI的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有一個(gè)與F-box super-family蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域。

2.4 跨膜預(yù)測(cè)

運(yùn)用跨膜數(shù)據(jù)庫(kù)TMbase（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測(cè)F-box蛋白的跨膜區(qū)域。從圖4可以看出，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，為膜內(nèi)蛋白。

2.5 蛋白質(zhì)磷酸化預(yù)測(cè)

通過(guò)在線蛋白磷酸化位點(diǎn)分析軟件NetPhos 2.0 Server，對(duì)F-box基因所編碼的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果（圖5）表明，該多肽鏈中分值在0.5以上的可能的磷酸化位點(diǎn)共有30個(gè)。其中，絲氨酸（Ser）可能的磷酸化位點(diǎn)共有14個(gè)，分別位于肽鏈的8、13、28、38、130、196、206、213、240、242、286、288、298和328位；蘇氨酸（Thr）可能的磷酸化位點(diǎn)共有4個(gè)，分別位于肽鏈的7、62、148和311位；酪氨酸（Tyr）可能的磷酸化位點(diǎn)共有12個(gè)，分別位于肽鏈的9、40、50、67、71、96、134、184、218、233、302和339位。

2.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

通過(guò)在線分析軟件Predict Protein（http：//www.predictprotein.org/）對(duì)F-box蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白含有α-螺旋為8.47%，β-折疊 31.15%，其他結(jié)構(gòu)為60.38%。

利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)F-box蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示，F(xiàn)-box蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)含有3個(gè)α-螺旋、9個(gè)β折疊，其間由無(wú)規(guī)則卷曲連接。

2.7 不同物種間F-box蛋白同源性比較及進(jìn)化分析

將沙田柚F-box蛋白的氨基酸序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他10種植物F-box基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖7），結(jié)果表明，沙田柚F-box蛋白基因編碼的氨基酸與甜橙（Citrus sinensis，KDO71185）和克萊門柚（Citrus clementina，XP_006425495）F-box蛋白的同源性分別為99%和98%。利用DNAMan構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明沙田柚F-box蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)與蕓香科的甜橙和克萊門柚有很近的親緣關(guān)系，屬于同一個(gè)進(jìn)化分支（圖7）。

2.8 F-box蛋白基因在沙田柚自交和異交花柱中的表達(dá)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析表明，該基因在自交花柱和異交花柱中的轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異（圖8）。在未授粉花柱中其表達(dá)量為0.73，在自交1 d花柱（Z1）中迅速上升（1.61），2 d（Z2）仍維持較高水平（1.40），3 d（Z3）則迅速下降（0.54）。而在異交1 d的花柱（Y1）中，該基因的表達(dá)迅速下降（0.25），2 d（Y2）出現(xiàn)回升（0.73），3 d（Y3）則快速下降（0.13）。

利用RPKM（Reads Per Kb per Million reads）[17]對(duì)該基因在自交和異交花柱中的表達(dá)水平估算，設(shè)定FDRS≤0.001且差異倍數(shù)≥2倍的基因視作顯著差異表達(dá)基因，對(duì)以RPKM值取2的對(duì)數(shù)值（log2（RPKM））對(duì)自交1 d/異交1 d、自交2 d/異交2 d和自交3 d/異交3 d花柱中F-box基因的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其log2（RPKM ratio）分別為2.69、0.96和2.05。

3 討論

F-box蛋白是一類廣泛存在于真核生物，含有F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白家族[18]，在細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能[19-21]。目前，人們已從多種植物中克隆了F-box蛋白基因，但尚未見關(guān)于沙田柚F-box蛋白基因克隆的報(bào)道。本研究克隆的CL8619.Contig2_All序列與甜橙和克萊門柚F-box蛋白基因編碼的氨基酸序列同源性分別為99%和98%，同時(shí)在N-端含有一個(gè)保守的F-box結(jié)構(gòu)域；說(shuō)明CL8619.Contig2_All序列是一個(gè)F-box蛋白基因。

F-box基因在植物自交不親和中也可能有重要作用。Lai等[4]首先在金魚草中克隆了一個(gè)有花粉組織特異性表達(dá)的F-box蛋白基因（AhSLF-S2）。隨后，在茄科矮牽牛中獲得了S-locus F-box基因PiSLF2[5]，在薔薇科梅和扁桃中分別鑒定出了特異性的S-locus F-box基因PmSLF和PdSFB[6-8]，相關(guān)研究表明，這些F-box基因可能是介導(dǎo)植物配子體自交不親和反應(yīng)，與其自交不親和性密切相關(guān)[6-8，22]。沙田柚為配子體自交不親和果樹，本研究克隆的F-box在沙田柚自交花柱和異交花柱中的表達(dá)存在明顯差異：在自交1 d花柱中其表達(dá)量由0.73迅速上升至1.61，2 d仍維持較高水平（1.40），3 d則迅速下降到0.54。而在異交1 d的花柱中，該基因的表達(dá)迅速下降0.25，2 d出現(xiàn)回升（0.73），3 d則快速下降至0.13。自交1 d/異交1 d，自交3 d/異交3 d的log2（RPKM ratio）分別為2.69和2.05，達(dá)到差異表達(dá)的水平。但該F-box蛋白基因在沙田柚自交不親和反應(yīng)中的功能尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] TAKAYAMA S， ISOGAI A. Self-incompatibility in plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2005，56：467-489.

[2] SASSA H，HIRANO H，IKEHASHI H.Self-incompatibility-related RNase in styles of Japanese pear（Pyrus serotina Rehd.）[J]. Plant Cell Phsiology，1992，33：811-814.

[3] ANDERSON M A，CORNISH E C，MAU S-L，et al. Cloning of cDNA for a stylar glycoprotein associated with expression of self-incompatibility in Nicotiana alata[J].Nature，1986，321：38-44.

[4] LAI Z，MA W S，HAN B，et al.An F-box gene linked to the self-incompatibility（S） locus of Antirrhinum is expressed specifically in pollen and tapetum[J]. Plant Molecular Biology，2002，50：29-42.

[5] SIJACIC P，WANG X，SKIRPAN A L，et al. Identification of the pollen determinant of S-RNase-mediated self-incompatibility[J].Nature，2004，429：302-305.

[6] ENTANI T，IWANO M，SHIBA H，et al. Comparative analysis of the self-incompatibility（S-） locus region of Prunus mume： Identification of a pollen-expressed F-box gene with allelic diversity[J].Genes to Cells，2003，8：203-213.

[7] YAMANE H，IKEDA K，USHIJIMA K，et al. A pollen-expressed gene for a novel protein with an F-box motif that is very tightly linked to a gene for S-RNase in two species of cherry， Prunus cerasus and P. avium[J].Plant Cell Physiclogy，2003， 44：764-769.

[8] IKEDA K，IGIC B，USHIJIMA K，et al. Primary structural features of the S haplotype-specific F-box protein， SFB， in Prunus[J]. Sexual Plant Reproduction，2004，16：235-243.

[9] 薛妙男，陳騰土，楊繼華.沙田柚自交和異交親和性觀察[J].園藝學(xué)報(bào)，1995，22（2）：127-132

[10] 楊繼華，薛妙男，陸景峰.沙田柚自交、異交花柱蛋白質(zhì)的比較分析[J].植物學(xué)通報(bào)，1996，13（增刊）：45.

[11] 李紅艷，楊繼華，薛妙男.沙田柚花柱三種同工酶分析[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，17（4）：80-84.

[12] 秦新民，李惠敏，薛妙男，等.沙田柚自交，異交花粉管蛋白的雙向電泳分析[J].廣西植物，2004，24（6）：566-569.

[13] 薛妙男，李義平，張杏輝，等.沙田柚自交花柱中識(shí)別蛋白的免疫金定位[J].園藝學(xué)報(bào)，2001，28（1）：59-61.

[14] 秦新民，莫花濃，萬(wàn) 珊，等.沙田柚花粉管特異蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)研究[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（4）：113-115.

[15] 秦新民，莫花濃，石菁萍，等.沙田柚花粉管S1-RNase免疫膠體金定位研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（5）：483-485.

[16] BARIOLA P A，HOWARD C J，TAYLOR C B，et al. The Arabidopsis thaliana ribonuclease gene RNA1 is tightly controlled in response to phosphate limitation[J].Plant J，1994，6：673-685.

[17] MORTAZAVI A，WILLIAMS B A，MCCUE K，et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J].Nature Methods，2008，5（7）：621-628.

[18] KIPREOS E T，PAGANO M. The F-box protein family[J].Genome Biol，2000，1（5）：1-7.

[19] NAKAYAMAK K I，NAKAYAMAK K. Ubiquitin ligases：Cell cycle control and cancer[J].Nat Rev Cancer，2006，6（5）：369-381.

[20] MONTE E，AMADOR V，RUSSO E，et al. A U-Box GA signaling component with a role proteasome degradation[J].Journal Plant Growth Regulation，2003，22：152-162.

[21] YU H C，WU J，XU N F，et al. Roles of F-box proteins in plant hormone responses[J].Acts Biochim Biophys Sin，2007， 39（12）：915-922.

[22] QIAO H，WANG H Y，ZHAO L，et al.The F-box protein AhSLF-S2 physically interacts with S-RNases that may be inhibited by the ubiquitin/26S proteasome pathway of protein degradation during compatible pollination in antirrhinum[J].Plant Cell，2004，16：582-595.