菘藍(lán)組培再生體系的建立

摘要：以菘藍(lán)（Isatis indigotica）無(wú)菌苗的葉片和葉柄為外植體，分別接種到添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的MS培養(yǎng)基上，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)菘藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響，建立菘藍(lán)組培再生體系。結(jié)果表明，葉片是菘藍(lán)愈傷組織形成的最佳外植體，菘藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L。以1/2MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/L NAA可使再生植株的生根率達(dá)到92.3%。

關(guān)鍵詞：菘藍(lán)（Isatis indigotica）；無(wú)菌苗；培養(yǎng)基；愈傷組織；再生植株

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）14-3716-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.044

Abstract： To study the effects of growth regulator on callus induction and differentiation，so that establish tissue culture regeneration system of Isatis indigotica，the leaves and petioles of Isatis indigotica aseptic seedings were cut and inoculated on MS medium supplemented with different growth regulator. The results showed that the leaf is the optimum explant for callus formation of Isatis indigotica and the optimum medium for callus induction and differentiation is MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L，respectively. When the shoots were cultured on 1/2MS medium supplemented with 0.1 mg/L NAA， the rooting rate could reach 92.3%.

Key words： Isatis indigotica； aseptic seedling； medium； callus； regenerated plant

菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort，2n=14）是十字花科菘藍(lán)屬二年生草本植物，是一種用途較廣的中藥材[1]，多分布于河南、河北、北京、黑龍江、江蘇、甘肅等地[2]。其干燥根入藥，稱(chēng)為板藍(lán)根，干燥葉入藥，稱(chēng)為大青葉[3]。菘藍(lán)中含有靛藍(lán)、靛玉紅、蒽醌類(lèi)、β-谷甾醇和多種氨基酸，具有清熱解毒、涼血利咽、抗病毒細(xì)菌的作用[4]，同時(shí)，在防治流感、乙肝、流行性腮腺炎等病毒性疾病方面有著廣泛的應(yīng)用[5]。菘藍(lán)中的成分靛玉紅能有效遏制腫瘤，對(duì)治愈慢性粒細(xì)胞白血病有一定療效[6]；靛紅是單胺氧化酶的抑制劑[7]。菘藍(lán)多糖能加強(qiáng)人體的免疫功能[8]。此外，板藍(lán)根在預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）方面發(fā)揮著很大作用[9]。Yang等[10]從菘藍(lán)根中提取的抗病毒成分Clemastanin B可以抵抗人類(lèi)和禽流感病毒和乙型病毒。Shan等[11]的研究表明，從菘藍(lán)根中提取的α-葡聚IIP-A-1是一種有效的輔助性和治療性疫苗的候選佐劑。Yang等[12]從菘藍(lán)根中提取出3種新的吲哚類(lèi)生物堿，對(duì)一氧化氮產(chǎn)生具有抑制作用。Liu等[13]從菘藍(lán)根中提取出7種具有抗流感病毒和柯薩奇病毒活性的物質(zhì)-糖苷雙吲哚類(lèi)生物堿。在菘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化方面，許鐵峰等[14]用根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)bar基因的四倍體菘藍(lán)植株。唐俊等[15]用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得草甘膦抗性的菘藍(lán)植株。Xiao等[16]用含有bar基因作為篩選標(biāo)記基因的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菘藍(lán)，獲得的轉(zhuǎn)Bt Cry1Ac和半夏凝集素（Pta）基因的四倍體菘藍(lán)增強(qiáng)了對(duì)蛾和蚜蟲(chóng)的抗性。再生體系的建立是植物遺傳轉(zhuǎn)化的前提，需進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。研究者利用子葉[17]、下胚軸[17]、葉片[18，19]、葉柄[18]、上胚軸[20]為外植體研究了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及組合對(duì)菘藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

本研究以菘藍(lán)無(wú)菌苗作為培養(yǎng)材料，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)菘藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響，探討菘藍(lán)組培再生體系的建立，以期為菘藍(lán)快速繁殖和高產(chǎn)栽培，高效益、規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持，為菘藍(lán)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及靛玉紅、靛藍(lán)等重要成分的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供原材料，為菘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化提供必要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

顆粒飽滿(mǎn)、大小基本一致、無(wú)病斑的菘藍(lán)種子無(wú)菌條件下培養(yǎng)所得的實(shí)生苗。

1.2 試驗(yàn)方法

將挑選出的菘藍(lán)種子先用自來(lái)水清洗，再用無(wú)菌水浸泡4 h，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)中進(jìn)行消毒處理。用無(wú)菌水沖洗種子5次，再用75%的乙醇溶液表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2次，然后用10%的NaClO溶液浸泡20 min，無(wú)菌水沖洗5次；最后，用無(wú)菌濾紙吸干種子表面的水分后，接種于MS基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)以獲得無(wú)菌苗。

挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的無(wú)菌苗葉片與葉柄作為外植體，將幼嫩葉片切成面積為1～2 cm2的小塊并使葉片正面朝上，將葉柄切成長(zhǎng)度為1～2 cm的小段，分別接種于添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合的MS培養(yǎng)基上（表1），每個(gè)處理5瓶，每瓶接種3個(gè)。MS基本培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，瓊脂7.0 g/L，pH 5.8，高壓蒸汽滅菌。25 ℃下進(jìn)行暗培養(yǎng)5 d，然后光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 800 lx，光照12 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將葉片、葉柄兩種外植體分別接種到培養(yǎng)基中，在適宜的條件下連續(xù)培養(yǎng)。7 d后，葉片向上卷曲，外緣增厚鼓起，并形成綠色顆粒狀的愈傷組織；10 d后，葉柄兩端向上翹起、腫脹，形成淺黃色的愈傷組織；14 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在相同的誘導(dǎo)條件下，葉片、葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)情況有較大差異，葉片愈傷組織的平均誘導(dǎo)率較高，為72.6%；葉柄的相對(duì)低些，為57.8%，這可能是不同外植體內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量不同以及對(duì)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收差異造成的。另外，兩種外植體上形成的愈傷組織質(zhì)量?jī)?yōu)劣不同，葉片較優(yōu)。從多種因素考慮，菘藍(lán)誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體是葉片。

2.1.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將葉片與葉柄兩種外植體分別接種于添加了不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基上，葉片與葉柄在不同的培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率有所差異，其結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，6-BA和NAA的交互作用，均可誘導(dǎo)葉片、葉柄形成愈傷組織，但誘導(dǎo)情況有明顯差異。將NAA的濃度從0.2 mg/L提高到0.5 mg/L時(shí)，兩種外植體愈傷組織的平均誘導(dǎo)率都得到提高，但繼續(xù)提高NAA濃度至1.0 mg/L，誘導(dǎo)率反而下降了。將6-BA的濃度從1.0 mg/L提高至2.0 mg/L的過(guò)程中，愈傷組織的平均誘導(dǎo)率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，說(shuō)明高濃度的6-BA不利于菘藍(lán)誘導(dǎo)形成愈傷組織。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合為6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

2.2 愈傷組織的分化

2.2.1 不同外植體形成愈傷組織的分化情況 在適宜條件下，連續(xù)培養(yǎng)愈傷組織，可以分化出不定芽。對(duì)于葉片、葉柄兩種外植體而言，愈傷組織的分化情況有較大差異，其結(jié)果見(jiàn)表3。從愈傷組織分化率、不定芽出現(xiàn)的時(shí)間、分化情況3個(gè)方面因素綜合考慮，菘藍(lán)葉片誘導(dǎo)形成的愈傷組織的分化情況較葉柄好。

2.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)愈傷組織分化的影響 6-BA與NAA的不同濃度組合，對(duì)菘藍(lán)愈傷組織的分化有著不同的作用效果，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織分化成苗起著至關(guān)重要的作用，不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)兩種外植體愈傷組織的分化情況有顯著差異。當(dāng)固定6-BA濃度時(shí)，將NAA的濃度由0.2 mg/L提高到1.0 mg/L，兩種外植體愈傷組織的分化率都得到了提高，最適合愈傷組織分化的NAA濃度為1.0 mg/L。將6-BA濃度由1.0 mg/L提高到1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織的分化率得到提高，但如果繼續(xù)提高6-BA濃度至2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的分化率降低了，可能是因?yàn)樯L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量太高，抑制了芽的分化。由此可見(jiàn)，6-BA為1.5 mg/L與NAA為1.0 mg/L的激素濃度組合是誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳濃度組合。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)葉片直接分化的影響

6-BA與NAA的不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，可使葉片先誘導(dǎo)出愈傷組織，并在愈傷組織上分化出不定芽。有些葉片并沒(méi)有形成愈傷組織，而是在葉片的切口處直接分化出不定芽。6-BA與NAA的不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)菘藍(lán)葉片分化的影響見(jiàn)表5。由表5可知，6-BA 2.0 mg/L與NAA 0.2 mg/L的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，可使葉片的出芽率最高。

2.4 生根誘導(dǎo)

待不定芽長(zhǎng)到一定高度（2～3 cm）后，選擇長(zhǎng)勢(shì)好、健壯的芽，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中使其分化生根，連續(xù)培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)生根率，結(jié)果見(jiàn)表6。1/2MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/L的NAA對(duì)菘藍(lán)的生根有顯著作用，不定根的誘導(dǎo)率高達(dá)92.3%，說(shuō)明低濃度的NAA有利于植株生根。

2.5 組培再生

將菘藍(lán)葉片和葉柄分別接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，可形成愈傷組織，將愈傷組織接種在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1 mg/L的分化培養(yǎng)基上，逐漸形成不定芽并發(fā)育成具有莖葉的小植株。移入1/2MS+NAA 0.1 mg/L的生根培養(yǎng)基中，20 d開(kāi)始生根，逐漸發(fā)育為再生植株（圖2、圖3）。

2.6 馴化移栽

當(dāng)根的長(zhǎng)度達(dá)到2～3 cm時(shí)，揭開(kāi)組培瓶上的封口膜，煉苗3 d后，小心取出菘藍(lán)苗，用清水輕輕沖洗根部，洗掉根部攜帶的瓊脂塊，再用吸水紙吸掉根部的水，最后移栽到花盆中培養(yǎng)，成活率可達(dá)到85%以上。

3 小結(jié)與討論

植株再生體系的建立是植物組織培養(yǎng)的一個(gè)重要應(yīng)用，影響菘藍(lán)組培再生體系建立的因素有多種，主要包括生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)與濃度、外植體的生理狀態(tài)、接種方式、光照條件和培養(yǎng)溫度等。菘藍(lán)再生體系具有獨(dú)特之處，當(dāng)6-BA與NAA配合使用時(shí)，可先由外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織，再分化出不定芽；同時(shí)，還能不經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)階段，直接于葉片切口部位分化出芽，這種直接器官發(fā)生途徑為菘藍(lán)快速繁殖提供了一條新的途徑。

以菘藍(lán)無(wú)菌苗作為培養(yǎng)材料，以菘藍(lán)葉片和葉柄為外植體，初步建立了菘藍(lán)組培再生體系。菘藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加0.1 mg/L NAA。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蘇淑欣，李 世，李佳楠，等.菘藍(lán)生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的研究[J].職大學(xué)報(bào)，2012，28（6）：93-96.

[2] 崔振剛.板藍(lán)根的用途和栽培種植技術(shù)應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（4）：825-827.

[3] 程春松，彭代銀，黃和平，等.菘藍(lán)育種研究現(xiàn)狀及現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31（4）：84-87.

[4] 李戈蓮，高義富，江成君，等.板藍(lán)根的藥用價(jià)值及GAP示范栽培技術(shù)[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1）：60-61.

[5] 裴 毅，聶江力，韓英梅，等.菘藍(lán)根化學(xué)成分研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（25）：15258-15259.

[6] 陳紅霞，王康才，呂建軍.菘藍(lán)春化機(jī)理的初步研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17（5）：6-8.

[7] HAMAUE N. Pharmacological role of Isatin， an endogenous MAO inhibitor[J].Yakugaku Zasshi，2000，120（4）：352-362.

[8] 太光聰，李 友，朱繼富.菘藍(lán)的藥用價(jià)值及開(kāi)發(fā)利用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（9）：134，136.

[9] LIN C W，TSAI F J，TSAI C H，et al. Anti-SARS coronavirus 3C-like protease effects of Isatis indigotica root and plant-derived phenolic compounds[J]. Antiviral Research，2005，68（1）：36-42.

[10] YANG Z，WANG Y，ZHENG Z，et al.Antiviral activity of Isatis indigotica root-derived clemastanin B against human and avian influenza A and B viruses in vitro[J].International Journal of Molecular Medicine，2013，31（4）：867-873.

[11] SHAN J，SUN G，REN J，et al.An α-glucan isolated from root of Isatis Indigotica，its structure and adjuvant activity[J].Glycoconjugate journal，2014，31（4）：317-326.

[12] YANG L，WANG G，WANG M， et al. Indole alkaloids from the roots of Isatis indigotica and their inhibitory effects on nitric oxide production[J]. Fitoterapia，2014，95：175-181.

[13] LIU Y F，CHEN M H，GUO Q L，et al. Antiviral glycosidic bisindole alkaloids from the roots of Isatis indigotica[J].Journal of Asian Natural Products Research，2015，17（7）：1-16.

[14] 許鐵峰，唐克軒，張漢明，等.抗除草劑基因?qū)胨谋扼w菘藍(lán)[J].中藥材，2003，26（5）：313-315.

[15] 唐 俊，張富生，廖志華.基于草甘膦篩選的菘藍(lán)轉(zhuǎn)化體系的建立[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（3）：129-131.

[16] XIAO Y，WANG K，DING R，et al. Transgenic tetraploid Isatis indigotica expressing Bt Cry1Ac and Pinellia ternata agglutinin showed enhanced resistance to moths and aphids[J].Molecular Biology Reports，2012，39（1）：485-491.

[17] 彭 菲，王鳳翱.菘藍(lán)子葉和下胚軸組織培養(yǎng)再生植株的研究[J].湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，20（5）：450-456.

[18] 苗永美，簡(jiǎn) 興，石 靜.菘藍(lán)兩種外植體愈傷組織誘導(dǎo)研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2008（1）：147-150.

[19] 胡冬南，柯國(guó)慶，王恒芬，等.激素對(duì)菘藍(lán)葉片組織培養(yǎng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（17）：7868-7869.

[20] 王 瀚，趙淑玲，趙桂芳，等.藥用植物菘藍(lán)的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].甘肅高師學(xué)報(bào)，2015，20（2）：50-52.