β—胡蘿卜素代謝調(diào)控研究

摘要：研究了酮康唑、β-紫羅蘭酮、表面活性劑和正十二烷對(duì)三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）發(fā)酵的生物量和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，酮康唑的最適添加量為30 mg/L，最適添加時(shí)間為接種后40 h。β-紫羅蘭酮的最適添加量為0.10%，最適添加時(shí)間為接種后36 h。表面活性劑以span-20效果最好，最適添加量為0.10%，接種前加入。正十二烷的最適添加量為1.0%，接種前加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

關(guān)鍵詞：β-胡蘿卜素；三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）；代謝調(diào)控

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ920；O629.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）14-3694-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.038

Abstract： The effect of ketoconazole， β-ionone，surfactant and n-dodecane on the biomass and β-carotene yield of Blakeslea trispora were studied. The optimal addtiton of ketoconazole is 30 mg/L， its optimal adding time is 40 hours after inoculation. The optimal addtiton of β-ionone is 0.10%， its optimal adding time is 36 hours after inoculation. Span-20 is the most effective in the surfactants. Its optimal addtiton is 0.10%. It could be added into the medium before inoculation. The optimal addtiton of n-dodecane is 1.0%. It could also be added into the medium before inoculation.

Key words： β-carotene；Blakeslea trispora；metabolic regulation

β-胡蘿卜素是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織一致認(rèn)定的A類(lèi)營(yíng)養(yǎng)色素，不僅是人體內(nèi)維生素A的重要來(lái)源，且具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)免疫等功能，在醫(yī)藥、食品著色及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化、日用化妝品及飼料添加劑等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。目前，市場(chǎng)上的β-胡蘿卜素產(chǎn)品主要有化學(xué)合成品和天然產(chǎn)品兩種類(lèi)型。天然β-胡蘿卜素因其功能性強(qiáng)、安全性好及生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的青睞[2]。發(fā)酵法是目前生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要途徑。在可合成β-胡蘿卜素的微生物中，三孢布拉氏霉無(wú)論是生物量（50 g干菌體/L），還是菌體細(xì)胞中β-胡蘿卜素含量（可達(dá)菌體干重的1%～5%）都是最理想的，已成為目前國(guó)內(nèi)外研究和生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的主要菌種[3]。本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)一直致力于β-胡蘿卜素的發(fā)酵制備研究，前期已完成了發(fā)酵條件優(yōu)化[4]、菌種選育[5]以及菌體中β-胡蘿卜素的提取[6]等方面的研究。本研究旨在探索各種代謝促進(jìn)劑對(duì)三孢布拉氏霉合成β-胡蘿卜素的影響，以期進(jìn)一步提高β-胡蘿卜素的發(fā)酵產(chǎn)量，從而為今后的產(chǎn)業(yè)化打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）正菌是從中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心購(gòu)買(mǎi)的原種，負(fù)菌是從中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心購(gòu)買(mǎi)的原種經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室誘變選育所得的突變菌株。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、自來(lái)水1 000 mL， pH自然。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%、大豆粉1%、1%麩皮浸出液、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%、大豆粉1%、1%麩皮浸出液、0.1% KH2PO4、 0.05% MgSO4、0.01% 維生素B1 、1%植物油，pH 7.0。

1.3 菌種活化培養(yǎng)

將保藏的三孢布拉氏霉正、負(fù)菌分別接種至新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)3 d。

1.4 種子培養(yǎng)

將活化好的三孢布拉氏霉正、負(fù)菌分別接種至三角瓶種子培養(yǎng)基中，26 ℃、180 r/m培養(yǎng)36 h。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的正、負(fù)菌株液體種子（菌絲）分別接種至三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。接種量為10%，正負(fù)菌的接種比例為1∶9，26 ℃、180 r/m發(fā)酵培養(yǎng)120 h。在發(fā)酵培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)加入不同量的代謝促進(jìn)劑，檢測(cè)其對(duì)生物量和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。

1.6 生物量及β-胡蘿卜素產(chǎn)量的測(cè)定

生物量及β-胡蘿卜素產(chǎn)量的測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酮康唑?qū)Ζ?胡蘿卜素發(fā)酵的影響

唐瓊[7]通過(guò)麥角固醇抑制劑酮康唑?qū)θ卟祭厦咕愇於┖铣赏緩酱x調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)，添加適量濃度的酮康唑可促進(jìn)番茄紅素的產(chǎn)量。由于番茄紅素是類(lèi)胡蘿卜素進(jìn)一步合成代謝的分支點(diǎn)，其中一條途徑是在番茄紅素β-環(huán)化酶的作用下產(chǎn)生β-胡蘿卜素，故考慮添加酮康唑來(lái)研究其對(duì)三孢布拉氏霉生物量和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。

從圖1可以看出，在接種發(fā)酵40 h后加入不同濃度的酮康唑，對(duì)生物量沒(méi)有太大的影響，說(shuō)明40 h后三孢布拉氏霉菌絲體基本上都已長(zhǎng)好。但對(duì)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量具有明顯的影響，當(dāng)酮康唑的添加量為30 mg/L時(shí)，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量最高，故以該添加量研究不同添加時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量及生物量的影響。

從圖2可以看出，前期加入酮康唑?qū)θ卟祭厦咕z體的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也相應(yīng)較低。36 h后加入對(duì)生物量已沒(méi)有太大的影響，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也趨于穩(wěn)定。因此，酮康唑的添加時(shí)間以接種發(fā)酵40 h為宜。

2.2 β-紫羅蘭酮對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的影響

β-紫羅蘭酮（β-ionone）在結(jié)構(gòu)上與β-胡蘿卜素相似，二者均具有β環(huán)，因此最初人們認(rèn)為β-紫羅蘭酮是β-胡蘿卜素前體，在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素。但后來(lái)的研究表明，β-紫羅蘭酮的作用是解抑制甲羥戊酸激酶，從而促進(jìn)β-胡蘿卜素合成[8]。

從圖3可以看出，接種發(fā)酵40 h后加入不同濃度的β-紫羅蘭酮時(shí)對(duì)菌絲體生物量影響不大，而對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量卻有明顯的影響。當(dāng)添加0.10% β-紫羅蘭酮時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大，因此，β-紫羅蘭酮添加劑量確定為0.10%。

從圖4可以看出，隨著β-紫羅蘭酮添加時(shí)間的推遲，生物量和β-胡蘿卜素產(chǎn)量均有上升趨勢(shì)，表明前期菌絲體生長(zhǎng)時(shí)加入β-紫羅蘭酮對(duì)菌絲生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素合成有抑制作用。接種36 h后添加0.10% β-紫羅蘭酮時(shí)β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大，因此β-紫羅蘭酮添加時(shí)間確定為接種后36 h。

2.3 表面活性劑對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的影響

在發(fā)酵液中添加適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣粌H可以改變發(fā)酵液的流體特性，增加溶氧，而且可以改變細(xì)胞的通透性，增加胞內(nèi)外物質(zhì)平衡從而有利于物質(zhì)傳遞。離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，一般添加非離子型表面活性劑較好。

從圖5可以看出，接種前在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.10%的不同表面活性劑，對(duì)三孢布拉氏霉菌絲體的生物量影響不大，但β-胡蘿卜素產(chǎn)量以添加span-20效果最好，故選擇添加span-20表面活性劑。

從圖6可以看出，接種前在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的span-20，當(dāng)添加濃度低于0.10%時(shí)，生物量沒(méi)有明顯的影響，當(dāng)高于0.10%時(shí)，生物量略有所下降，說(shuō)明span-20添加過(guò)量，對(duì)三孢布拉氏霉菌絲體的生長(zhǎng)還是有一定的抑制作用。β-胡蘿卜素產(chǎn)量以0.10%添加濃度時(shí)最高。

2.4 氧載體對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的影響

氧載體與發(fā)酵液形成的體系具有氧傳遞速度快、能耗低、泡沫生成少、剪切力小等特點(diǎn)，能在不增加能耗的基礎(chǔ)上提高氧傳遞效率，不僅適合于好氧高密度發(fā)酵，也適合于溶氧功耗高或因剪切力作用大而難以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的脆弱細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)也可應(yīng)用于固定化生物催化劑好氧反應(yīng)中[9]。三孢布拉氏霉菌是高好氧菌，因此，利用氧載體提高發(fā)酵液中溶氧具有重要的意義[10]。本試驗(yàn)主要研究了正十二烷對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的影響。

從圖7可以看出，接種前在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的正十二烷，隨著正十二烷濃度的增加，β-胡蘿卜素產(chǎn)量呈先上升后下降趨勢(shì)，說(shuō)明過(guò)高濃度的正十二烷不利于菌絲體合成β-胡蘿卜素，1.0%的正十二烷添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中β-胡蘿卜素產(chǎn)量及生物量均達(dá)到最大，因此正十二烷濃度確定為1.0%。

從圖8可以看出，隨著正十二烷添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)間的推遲，β-胡蘿卜素產(chǎn)量逐漸降低，表明越早加入正十二烷越有利于提升發(fā)酵液溶氧水平從而利于β-胡蘿卜色素合成。正十二烷不同添加時(shí)間對(duì)菌絲體生長(zhǎng)影響不大，因此正十二烷可直接先添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

3 討論

三孢布拉氏霉合成β-胡蘿卜素的途徑已經(jīng)研究清楚，研究人員為了提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，在菌種選育及培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化方面進(jìn)行了大量的探索研究，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也得到了不同程度的改善和提高。β-胡蘿卜素的生物合成受合成細(xì)胞自身的代謝控制，為了提高其產(chǎn)量，最有效的辦法就是從遺傳的角度打破微生物細(xì)胞的正常代謝控制機(jī)制。然而，人們目前對(duì)內(nèi)源類(lèi)胡蘿卜素合成的相關(guān)酶基因在生物細(xì)胞中如何表達(dá)及調(diào)控知之有限，這使得在調(diào)控類(lèi)胡蘿卜素生物合成的基因工程研究方面因缺乏理論基礎(chǔ)而帶有一定的盲目性。盡管已有研究者將β-胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵酶基因?qū)氲郊?xì)菌或酵母菌中，并成功的合成出了β-胡蘿卜素，但由于新的宿主細(xì)胞中缺乏三孢布拉氏霉菌絲中所特有的脂溶性油囊結(jié)構(gòu)，使得新宿主細(xì)胞承載β-胡蘿卜素的能力有限，因而工程菌合成β-胡蘿卜素的產(chǎn)量依然偏低[11]，現(xiàn)有的β-胡蘿卜素生物合成代謝調(diào)控依然以三孢布拉氏霉自身細(xì)胞為主。

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