梔子種子萌發(fā)過程中的水分與抗氧化酶活性變化

摘要：以梔子（Gardenia jasminoides Ellis）不同萌發(fā)階段的種子為材料，測定種子含水量及CAT、SOD、POD活性的動態(tài)變化規(guī)律。結果表明，梔子種子含水量的變化符合一般種子變化規(guī)律，可分為快速吸水階段、緩慢吸水階段及重新迅速吸水階段，在長葉階段含水量達到最高，為86.13%。在不同萌發(fā)階段，3種抗氧化酶活性從吸脹期開始升高，較干種子均有明顯變化，變化趨勢不盡相同，POD活性最先出現(xiàn)明顯的升高趨勢，SOD活性在露白階段急劇升高之后變化趨勢較平緩，CAT活性變化較大。種子萌發(fā)之后對環(huán)境有害因素的抵抗能力大大增強，3種酶的活性變化存在一定的協(xié)同作用和關聯(lián)性，說明CAT、SOD和POD活性能夠較好地指示梔子種子萌發(fā)后的不同階段。

關鍵詞：梔子（Gardenia jasminoides Ellis）；種子；萌發(fā)；含水量；抗氧化酶活性

中圖分類號：S567.7+9.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3666-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.031

Abstract： Using gardenia（Gardenia jasminoides Ellis） dry seed and seeds at different germination stage as material， the dynamic changing of water content； and activity of catalase（CAT）， superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） were investigated. The results showed that the change of seed moisture content conforms to normal seed change regularity， and could be divided into fast water absorbing period， slow water absorbing period and afresh rapid water absorbing period. The water content reached the highest（86.13%） in leaf growing phase. In different phases， the activity of the three antioxidant enzymes began to increase from imbibiting period and had marked change with variation trends compared with dry seed. POD activity appeared significantly rising trend the first； While SOD activity changed gently after a sharp promotion during reveal phase； And CAT activity changed greatly. Seed had greater resistibility to environmental toxic factors than after germination. Change among the three antioxidant enzyme activities existed some synergistic effect and correlation， indicating that CAT， SOD and POD could indicate the germination stage of gardenia seeds.

Key words：gardenia（Gardenia jasminoides Ellis）； seeds； germination； water content； antioxidant enzymes activity

中藥梔子來源于茜草科（Rubiaceae）梔子屬（Gardenia Ellis）植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實，其性寒味苦，歸心肺三焦經，具有泄火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效，常用于黃疸尿赤、血淋澀痛、尿血崩漏等病征[1]。梔子屬植物廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，中國主要分布在長江以南，主產于江西、四川、湖北、福建、湖南、廣西、廣東等?。ㄗ灾螀^(qū)）。研究證明，梔子的主要活性成分為黃酮類梔子素、三萜類化合物藏紅花素、藏紅花酸及α-藏紅花甙元、環(huán)烯醚萜甙類梔子甙、異梔子甙、去羥梔子甙、山梔子甙等[2]?，F(xiàn)在國內外市場對于梔子的需求量很大，且不斷上升，具有很好的市場前景[3]，所以梔子的栽培面積在不斷擴大[4]。但栽培梔子的藥材品質不穩(wěn)定，而且品種混雜，田間管理粗放，從而使藥材的質量存在隱患。種子萌發(fā)是植物生長的開始，是控制藥材質量的關鍵環(huán)節(jié)，只有培育出良好的種苗才能獲得優(yōu)質的藥材。天然的種子中含有一定量的抗氧化酶，包括過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等，在種子萌發(fā)階段，這些酶能及時清除種子中的活性氧，化解種子儲藏過程中產生的丙二醛（MDA）等有害代謝物[5]。但對于梔子種子萌發(fā)過程中抗氧化酶動態(tài)變化和含水量變化的研究較少。因此試驗比較了梔子種子在不同萌發(fā)階段的含水量和抗氧化酶活性的動態(tài)變化，從植物生理的角度探討梔子種子對環(huán)境的適應性，以期為弄清梔子種子萌發(fā)的生理適應機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子來源

2014年11月在江西省樟樹市采集梔子種子，將已經除去外果皮和果肉的種子漂洗干凈后，選取健康飽滿的種子，放在密封袋里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 種子培養(yǎng)

將梔子種子于25 ℃恒溫水里浸種1 d，采用濾紙作為發(fā)芽床，于30 ℃恒溫無光照環(huán)境里做發(fā)芽試驗。從置床開始，分別取出不同萌發(fā)階段（干種子、吸脹、露白、伸長、變綠、長根、長葉）的適量種子樣品，用于含水量和抗氧化酶活性的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 含水量測定 參照文獻[6]的方法，略有改動，取5 g梔子種子用高溫法測定含水量。先將樣品于130 ℃下烘干至恒重，并記下編號，然后將試樣放入預先烘干和稱重過的樣品盒內，在千分之一天平上稱取試樣3份。然后打開盒蓋，一起放入預熱好的烘箱內，關好箱門，將烘箱溫度保持在130～133 ℃，90～120 min后取出，放入干燥器內冷卻至室溫，稱重，計算水分含量。

種子含水量=[（烘前試樣重-烘后試樣重）÷烘前試樣重]×100%。

1.3.2 種子抗氧化酶活性測定 分別取不同萌發(fā)階段的梔子種子1 g，加入4 mL預冷的磷酸緩沖液（PBS，1/15 mol/L KH2PO4與1/15 mol/L Na2HPO4·15 H2O按3∶7的比例混合，pH 7.2）提取，冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液，用于測定酶活性。①POD活性測定。參照文獻[7]的方法，略有改動，通過過氧化物酶氧化愈創(chuàng)木酚的生成物量來測定其活性。反應體系中含有3 mL PBS（pH 7.2）、1.44 μL H2O2、1.5 μL愈創(chuàng)木酚和1 mL酶液。酶液在紫外可見分光光度計中孵育3 min后加入反應體系，之后連續(xù)測定470 nm波長處吸光度的變化值，以0.01 ΔA470 nm/min為一個酶活力單位（U），重復3次。計算公式：

POD活性[U/（g·min）]=ΔA470 nm×Vt/（W×Vs×0.01 t），

式中，ΔA470 nm為反應時間內吸光度的變化，Vt為提取酶液總體積（mL），W為種子鮮重（g），Vs為測定時酶液的體積（mL），t為反應時間（min）。②CAT活性測定。參照文獻[8]的方法，略做改動，通過直接測定H2O2的減少量來表示過氧化氫酶的活性。反應體系中含3.0 mL PBS（pH 7.2）、10 μL 30%H2O2和0.2 mL酶液，在25 ℃條件下反應，測定240 nm下吸光度值的變化，以0.01 ΔA240 nm/min為一個酶活力單位（U），重復3次。計算公式：

CAT活性[U/（g·min）]=△A240 nm×Vt/（W×Vs×0.01×t），

式中，ΔA240 nm為反應時間內吸光度的變化，Vt為提取酶液總體積（mL），W為種子鮮重（g），Vs為測定時酶液的體積（mL），t為反應時間（min）。③SOD活性測定。采用SOD抑制氮藍四唑（NBT）在光照條件下的還原作用來測定SOD活性。在較暗的光照下加入3 mL反應液（130 mmol/L甲硫氨酸0.6 mL、630 μmol/L NBT 0.72 mL、1.3 mmol/L核黃素0.01 mL、0.1 mol/L EDTA-Na2 0.005 mL，用pH 7.2的PBS定容至3 mL），加入酶液100 μL，混勻后轉移至光照恒溫培養(yǎng)箱中，25 ℃反應20 min。以空白的磷酸緩沖液代替酶提取液，以黑暗處理為對照，反應結束后以黑暗條件下的對照管做為空白，分別測定其他各管在560 nm處的吸光度。以抑制NBT光化學反應的50%為一個酶活力單位，重復3次。計算公式：

SOD總活性[U/g（FW）]=（ACK-Ae）Vt/（ACK×0.5 W×Vs）

式中：ACK為照光管的吸光度，Ae為樣品管的吸光度，Vt為提取酶液總體積（mL），W為種子鮮重（g），Vs為測定時酶液的體積（mL）。

2 結果與分析

2.1 梔子種子萌發(fā)過程中含水量的變化

梔子種子萌發(fā)階段含水量的動態(tài)變化情況見圖1。由圖1可知，梔子種子在吸脹階段含水量大幅增加，比干種子增加了27.11個百分點，達到了41.13%，這一階段主要靠種子內部膠體吸脹吸水，和種子代謝活動無關；到露白階段含水量略有下降，此后含水量持續(xù)增加，到伸長階段達到最大，為86.13%。含水量的這種變化可能是梔子種子長出胚芽之后靠胚芽吸收水分、不再依靠簡單的滲透作用或者吸脹作用來吸水引起的，所以露白之后種子的含水量持續(xù)增加。種子中貯藏的可溶性糖、脂肪、蛋白質等營養(yǎng)物質不能以原來的形態(tài)從貯藏組織中向生長部位移動，只有被水解為低分子化合物之后才能為種子萌發(fā)生長提供營養(yǎng)和能量，因此種子萌發(fā)必須先吸收大量的水分，使吸脹階段種子的含水量急劇增加，所以吸脹階段也是種子的第一吸水期。其后種殼破裂，胚根速生期吸水緩慢，且這一階段種子內的各種酶被激活；為供生長之需，各種物質水解需要水分，而且細胞要利用已吸收的水分完成各種代謝，所以這一階段耗水增加，使含水量略有下降，之后又恢復急劇吸水。呼吸作用可能也隨之增強，胚迅速長大且細胞體積增大，種子內貯藏的有機物大規(guī)模水解為滲透性很強的小分子物質，使梔子種子再次快速吸水，這時的吸水是滲透性吸水，與代謝作用緊密相關。

2.2 種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化

2.2.1 梔子種子萌發(fā)過程中POD活性的的變化 POD廣泛存在于生物體內，是活性較高的酶，它與光合作用、呼吸作用及生長素的氧化都有關系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷變化，一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較低；這是因為POD能使組織中的某些碳水化合物轉化為木質素，增強了植物組織木質化程度，所以POD可作為組織老化的一種生理指標；梔子種子萌發(fā)階段POD活性的動態(tài)變化情況見圖2。由圖2可知，隨著萌發(fā)進程，梔子種子的POD活性出現(xiàn)波動，波動范圍在56.92～505.17 U/（g·min）；但在最后的長葉階段明顯高于干種子的活性，所以總體上呈上升趨勢。不同萌發(fā)階段的POD活性差異十分明顯，以干種子的酶活性最低，僅為56.92 U/（g·min）；隨著種子吸脹作用的開始，種子在大量吸水后，POD活性顯著增強，在吸脹階段迅速上升到388.00 U/（g·min）；到露白階段略有下降，而后持續(xù)增加；在伸長階段酶活性達到最強，但此后酶活性逐步下降。梔子種子的POD活性在萌發(fā)階段變化明顯，可能原因是種子在生長過程中內部代謝活動相對較強、發(fā)生了一系列復雜的物質轉化和生理變化所致。POD在植物體內與多種代謝活動有關，如參與細胞分化、影響一系列的生理活性物質的合成與降解[9]。種子萌發(fā)改變了最初的靜止狀態(tài)，使種子的代謝活動迅速增強，通過一系列復雜的生理生化活動使POD活性得以恢復，而且合成新的POD，所以在生長過程中表現(xiàn)為POD的活性升高。此外較高活性的POD能夠清除種子代謝產生的H2O2和阻礙遺傳信息表達的物質，有助于種苗的健康成長。

2.2.2 梔子種子萌發(fā)過程中CAT活性的的變化 CAT普遍存在于能呼吸的生物體內，主要存在于植物細胞的葉綠體、線粒體、內質網(wǎng)里，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御能力，在植物細胞、細胞器內等不同部位之間所起的抗氧化防御作用是非常重要的[8]；梔子種子萌發(fā)階段CAT活性的動態(tài)變化情況見圖3。從圖3可見，干種子中的CAT活性最低，為1.99 U/（g·min）；到吸脹階段明顯增強，為38.28 U/（g·min）；露白階段又下降，為17.71 U/（g·min）；此后CAT活性呈不斷上升的趨勢，在生根階段活性達到最強，為168.33 U/（g·min）；而在長葉階段明顯下降，降為82.31 U/（g·min）。高活性的CAT能夠清除有害物質，從而使種子保持較高的活力，進而保證種子的順利生長。

2.2.3 梔子種子萌發(fā)過程中SOD活性的變化 SOD作為生物體內清除超氧陰離子自由基的關鍵酶，在一定程度上能夠反映植物抵抗逆境傷害的能力[10]，也是植物抗氧化酶系統(tǒng)的第一道防線，能清除細胞內過量的超氧陰離子自由基，維持活性氧代謝的平衡，保護膜結構，具有顯著的清除超氧化物自由基的作用。植物幼苗對外界不良環(huán)境的抵抗只有依靠高活力的酶活性才能夠保證植株的正常生長[10]；梔子種子萌發(fā)階段SOD活性的動態(tài)變化情況見圖4。由圖4可見，隨著萌發(fā)進程，干種子和吸脹階段的SOD活性變化不明顯，且酶活性低，分別為18.35、22.53 U/g（FW）；到露白階段酶活性快速增加，達到127.48 U/g（FW）；且之后的各階段SOD均保持了較高的活性。這可能與萌發(fā)過程中氧自由基和有害物質含量的增多有關。其中在變綠階段達到最強，為130.158 U/g（FW）。

3 討論

水分是種子萌發(fā)所必需的啟動條件，它起到了軟化種皮、加強種子內外氣體交換、增強胚的呼吸作用、加快酶的活化、促進物質的轉化和運輸?shù)淖饔肹11]。從梔子種子萌發(fā)階段的含水量動態(tài)變化可以看出，梔子種子的含水量變化趨勢呈S形曲線，可分為快速吸水階段、緩慢吸水階段及重新迅速吸水階段。處于休眠狀態(tài)的種子接觸到水分之后立即開始吸脹吸水，并開始一系列復雜的生理變化和物質代謝活動，為種子的萌發(fā)和生長準備了物質基礎。

梔子種子酶活性的變化與萌發(fā)階段相關，在梔子種子的萌發(fā)和生長過程中，種子吸水和萌發(fā)之后的CAT、POD、SOD 3種抗氧化酶活性均高于干種子的酶活性，其中，SOD活性在露白階段急劇增加之后變化比較平緩，而POD和CAT活性變化起伏較大?？赡茉蚴歉煞N子的生理活動處于相對靜止狀態(tài)，當在水分充足的條件下，隨著種子的代謝活動加強，種子浸泡于水中，氧氣供應不足，內部經過各種生理生化反應積累了一定量的活性氧，需要高活性的抗氧化酶來清除這些物質。3種抗氧化酶在干種子中也有一定的活性，說明干種子對環(huán)境的不利因素也具有一定的抵抗能力。但3種抗氧化酶在種子萌發(fā)的過程中活性水平變化既有一定的差異、也存在一定的聯(lián)系，均能消除梔子種子在萌發(fā)和生長過程中產生的活性氧自由基與積累的有害物質，保護并且修復細胞結構，較好地指示了種子不同的萌發(fā)階段。

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