露花微繁技術(shù)體系研究

摘要：以溫室中生長的露花（Mesembryanthemum cordifolium L. f.）幼嫩莖段為外植體，利用正交試驗(yàn)等方法研究了露花微繁技術(shù)體系。結(jié)果表明，用70%～75%乙醇浸泡30 s、0.1%升汞浸泡6 min對外植體消毒滅菌就能達(dá)到理想的效果；對于無頂芽莖段，叢生芽增殖最適培養(yǎng)基是MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9～1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L；而對于有頂芽莖段要達(dá)到相同增殖預(yù)期，則在其他成分不變的前提下，需要6-BA濃度達(dá)到1.5 mg/L。因此，無頂芽莖段更適合作為叢生芽增殖的培養(yǎng)材料；生根最適培養(yǎng)基是1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L。

關(guān)鍵詞：露花（Mesembryanthemum cordifolium L. f.）；組織培養(yǎng)；微繁技術(shù)；叢生芽增殖

中圖分類號：S649.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3657-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.029

Abstract： Using the tender stem growing in greenhouse as explants， orthogonal test was applied to study the micropropagation technique system of Mesembryanthemum cordifolium L. f.. The results showed that dipping in 70% to 75% alcohol for 30 s and 0.1% mercuric chloride for 6 min would had idea sterilization effect. For tender stem without terminal bud as explants， the optimal medium for clump bud proliferation was MS+0.05 mg/L NAA+0.9 to 1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3+30 g/L sugar+7 g/L agar； while for tender stem with terminal bud， the 6-BA concentration should be 1.5 mg/L. Therefore， tender stem without terminal bud was more suitable explants for clump bud proliferation. The optimal medium for rooting was 1/2 MS+0.2 mg/L IBA+30 g/L sugar+7 g/L agar.

Key words：Mesembryanthemum cordifolium L. f.； tissue culture； micropropagation technique； clump bud proliferation

露花（Mesembryanthemum cordifolium L. f.）又名心葉日中花、露草、花蔓草、牡丹吊蘭、櫻花吊蘭、太陽玫瑰等[1，2]，為番杏科（Aizoaceae）日中花屬（Mesembryanthemum L.）多年生常綠草本植物，原產(chǎn)于非洲南部，現(xiàn)在國內(nèi)多地都有栽培，通常栽培供觀賞，是去除甲醛效果較好的常見居室觀賞植物之一[3]；近些年也作為蔬菜食用[1，4，5]，俗稱田七菜、食用穿心蓮；同時(shí)作為兼性CAM植物常被用于生理研究[6-8]。生產(chǎn)上常采用分株、扦插、播種等方法繁殖[1，2，9]；國內(nèi)自匡安秀等[10]首次報(bào)道露花通過幼莖、葉片誘導(dǎo)愈傷組織分化出根與芽進(jìn)行離體培養(yǎng)以來，陳香波等[11]、王小紅等[12]也對露花的組織培養(yǎng)及植株再生技術(shù)進(jìn)行了探討，都為露花的組培快繁奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以露花幼嫩莖段為外植體，在消毒方案篩選與初代培養(yǎng)、叢生芽增殖、試管內(nèi)生根苗煉苗移栽等方面進(jìn)行了探索，初步確立了露花微繁技術(shù)體系，不僅為其快速生產(chǎn)找到了新的途徑，也為其生理生化研究帶來了便利。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料露花來自河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院科技園日光溫室；2012年10月下旬，剪取生長旺盛的露花幼嫩莖段，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與初代培養(yǎng) 在實(shí)驗(yàn)室將露花幼嫩莖段去葉留莖，流水緩慢沖洗1 h，去離子水漂洗3次后帶入無菌操作室，在超凈工作臺上用70%～75%乙醇浸泡30 s，迅速用去離子水漂洗2次，將水瀝干；再用0.1%升汞（每升加1滴吐溫80）分別浸泡6、8、10、12 min，去離子水漂洗4次，最后用無菌濾紙吸干殘留水分。在無菌條件下將消毒滅菌后的材料剪成1.5 cm左右長的莖段，接種在瓊脂含量為7 g/L（下同）的固體MS培養(yǎng)基[13]上培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH 5.6～6.0（下同）。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃±2 ℃，光照度2 000～3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)室相對空氣濕度70%左右。2周后統(tǒng)計(jì)污染率、未萌芽率和萌芽率[14]。

污染率=（污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%，

未萌芽率=[（死亡外植體數(shù)+未萌芽外植體數(shù)）/接種外植體數(shù)]×100%，

萌芽率=（萌芽并且沒污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

1.2.2 芽繼代增殖培養(yǎng) ①L9（34）正交試驗(yàn)篩選芽增殖配方。以固體MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)[15]，各因素、水平組合見表1。采用初代培養(yǎng)中生長旺盛、健壯一致的無菌綠苗，取有頂芽帶2對葉片的莖段分別接種于9組培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組試驗(yàn)做5次重復(fù)。4周后統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)，，取5次重復(fù)的均值；試驗(yàn)中有效芽的苗長度不小于0.5 cm。芽增殖系數(shù)=有效芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)。②增殖配方中6-BA濃度的優(yōu)化試驗(yàn)。分別取有頂芽帶2對葉片與無頂芽帶2對葉片的無菌莖段，接種于添加NAA 0.05 mg/L、GA3 0.3 mg/L、蔗糖30 g/L和不同濃度6-BA（0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/L）的固體MS培養(yǎng)基上。每組接種5瓶，每瓶接種4株，4周后統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng) 以固體1/2 MS（即MS大量元素減半，其他正常）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA（0、0.2 mg/L）進(jìn)行生根試驗(yàn)。采用有頂芽帶3對葉的莖段進(jìn)行接種，每組接種5瓶，每瓶接種4株。2周后統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)和根長。生根數(shù)指根長大于或等于0.2 cm的根數(shù)量。

生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%。

1.2.4 煉苗移栽 2013年9月13日開始，在溫室內(nèi)對苗高不低于3 cm、生根數(shù)不少于2條、根長不小于0.5 cm的組培苗進(jìn)行煉苗。先閉瓶煉苗0、14 d，然后開口加少量自來水煉苗3 d（每天都要更換自來水），準(zhǔn)備移栽。移栽時(shí)先用自來水洗凈根上的培養(yǎng)基，在50%多菌靈可濕性粉劑600～800倍溶液中浸根10 min，然后移栽入事先裝有基質(zhì)（草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1，已經(jīng)混合均勻并加適量水調(diào)好基質(zhì)含水量65%左右）的營養(yǎng)缽中，澆透水（也可用多菌靈溶液澆灌），蓋上小拱棚（也可放入能嚴(yán)格控制濕度的大玻璃槽箱中）。煉苗期間和移栽初期7～10 d內(nèi)，控制溫度20～30 ℃，遮光，相對空氣濕度保持在90%以上，并保持適當(dāng)透氣性。10～15 d后撤去拱棚，做好日常管理。移栽3周后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

移栽成活率=（移栽成活苗株數(shù)/煉苗株數(shù)）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003和SPSS 9.1軟件處理、制表，并做方差分析；利用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（Duncan's new multiple range test，DMRT）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對露花外植體初代培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)設(shè)定的不同消毒時(shí)間對露花外植體萌芽率的影響情況見表2和圖1。由表2和圖1可知，在0.1%升汞中浸洗6、10、12 min的萌芽率最高，均為93.75%；盡管在0.1%升汞中浸洗8 min處理的萌芽率略低，但與6、10、12 min處理的萌芽率差別不大。說明在10月下旬剪取的溫室內(nèi)露花幼嫩莖段含菌少、易消毒、易萌芽，用70%～75%乙醇浸泡30 s、0.1%升汞浸泡6 min即可達(dá)到理想的消毒滅菌效果。

2.2 芽增殖培養(yǎng)

2.2.1 芽增殖配方的L9（34）正交試驗(yàn)篩選 試驗(yàn)過程中露花外植體萌芽后生長迅速，接種2 d后，各組植株就已開始生長。接種28 d時(shí)芽增殖情況見表3和圖2。由表3分析可見，有頂芽帶2對葉的莖段芽增殖系數(shù)產(chǎn)生高低的順序是6-BA、蔗糖、NAA、GA3，方差分析結(jié)果表明，6-BA濃度表現(xiàn)差異顯著，NAA、GA3與蔗糖均不顯著，4個(gè)因素NAA、 6-BA、GA3、蔗糖引起平均芽增殖系數(shù)最高的水平依次是2、3、3、2。因此，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L就是正交試驗(yàn)中最適的芽增殖培養(yǎng)基配方。在正交試驗(yàn)中，6-BA的濃度表現(xiàn)差異明顯，并且芽增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的增加（0.3、0.6、0.9 mg/L）而明顯增大，因此，筆者又探討了不同6-BA濃度對芽增殖的影響，并采用有頂芽與無頂芽莖段作為培養(yǎng)材料，比較了二類莖的芽增殖情況。

2.2.2 芽增殖配方中6-BA濃度的優(yōu)化 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在接種2～3 d，各組植株就開始生長。有頂芽帶2對葉片的莖段先是頂芽伸長、新葉長大，接種7 d開始萌發(fā)腋芽，接種14 d腋芽已明顯伸長；而無頂芽帶2對葉片的莖段在接種3～5 d就開始有腋芽萌發(fā)，接種14 d多數(shù)腋芽明顯伸長。接種28 d的芽增殖情況見表4。由表4可知，在相同配方上，有頂芽莖段的增殖系數(shù)均小于無頂芽莖段。對于接種有頂芽莖段的各配方處理而言，在6-BA濃度不小于0.9 mg/L時(shí)，芽叢（即叢生芽）才會出現(xiàn)，并在6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)芽增殖系數(shù)達(dá)到最高（平均芽增殖系數(shù)為5.4，最多的可達(dá)10.0），并且顯著高于其他水平（P<0.05）；而對于接種無頂芽莖段的各配方來說，在6-BA濃度為0.6 mg/L時(shí)就有芽叢產(chǎn)生，并在1.2 mg/L時(shí)芽增殖系數(shù)達(dá)到最高（平均芽增殖系數(shù)為5.7，最多的可達(dá)12.0），除1.5 mg/L處理外，顯著高于其他水平（P<0.05）。因此，對有頂芽莖段而言，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L就是叢生芽增殖的最適培養(yǎng)基配方，而對于無頂芽莖段來說，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9～1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L是叢生芽增殖的最適培養(yǎng)基配方?？梢?，要達(dá)到相同的叢生芽增殖預(yù)期，對于有頂芽莖段材料需要較高濃度的6-BA，而對于無頂芽莖段材料僅需較低濃度的6-BA。綜合考慮培養(yǎng)材料、配方（6-BA濃度）與芽增殖系數(shù)的關(guān)系，建議采用無頂芽莖段作為叢生芽增殖培養(yǎng)材料。不過試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度增大會加劇玻璃化現(xiàn)象，并且低濃度的6-BA也會出現(xiàn)玻璃化，這可能與MS培養(yǎng)基中的NH4NO3有關(guān)[16]。

2.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn)

對露花離體繼代增殖材料進(jìn)行生根培養(yǎng)的情況見表5和圖3。從表5和圖3可見，露花離體繼代增殖材料生根比較容易，早的在生根培養(yǎng)5～7 d就可見白色根突，新發(fā)根大部分在莖基部產(chǎn)生。在培養(yǎng)14 d時(shí)，從生根率、平均生根數(shù)與平均根長方面考慮，1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L培養(yǎng)基為露花離體繼代增殖材料比較適宜的生根培養(yǎng)基配方。

2.4 煉苗移栽

對露花生根培養(yǎng)苗進(jìn)行煉苗的情況見表6和圖4。由表6和圖4可見，閉瓶煉苗時(shí)間對于露花生根培養(yǎng)苗移栽成活率沒有明顯的影響，因此，露花生根培養(yǎng)苗在開口煉苗3 d后就可以進(jìn)行移栽，成活率可達(dá)96.7%以上。

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，供試材料的生長環(huán)境直接影響外植體的潔凈程度和生理狀態(tài)；切取外植體的供體植株生理狀態(tài)，對于芽在培養(yǎng)條件中的響應(yīng)能力有明顯的影響。在植物生長季節(jié)開始時(shí)，由活躍生長的枝條上切取的外植體通常能產(chǎn)生最好的組織培養(yǎng)效果。若把供體植株種在溫室或培養(yǎng)箱中，使它們持續(xù)在進(jìn)行營養(yǎng)生長所需的光照和溫度環(huán)境條件下，就有可能把莖芽對培養(yǎng)響應(yīng)的季節(jié)性波動減少到最低限度[13]。選用溫室中生長的露花幼嫩莖段，不僅相對潔凈、染菌率較低[17]，而且即使在10月下旬室外為霜降節(jié)氣時(shí)仍在活躍生長。試驗(yàn)結(jié)果表明，用70%～75%的乙醇浸泡30 s，去離子水漂洗2次，瀝干水后再用0.1%升汞浸泡6 min，去離子水漂洗4次，則適宜對露花幼嫩莖段進(jìn)行初代培養(yǎng)，易獲得無菌培養(yǎng)材料。

誘導(dǎo)頂芽和腋芽成苗是一種“芽生芽”的增殖過程，獲得的再生植株遺傳性狀穩(wěn)定，增殖能力不易退化，是植物離體微繁中常用的增殖材料，其增殖途徑主要分為通過單節(jié)莖段扦插實(shí)現(xiàn)芽增殖的無菌短枝型和通過增強(qiáng)腋芽生枝能力實(shí)現(xiàn)芽增殖的叢生芽增殖型[13，18，19]。試驗(yàn)結(jié)果表明，露花離體嫩莖既可以通過無菌短枝型增殖，也可以通過叢生芽增殖型增殖。在NAA濃度為0.05 mg/L時(shí)，若6-BA濃度較低（對于有頂芽莖段小于0.9 mg/L，對于無頂芽莖段小于0.6 mg/L）則植株以無菌短枝型增殖為主；若6-BA濃度較高（對于有頂芽莖段不小于1.2 mg/L，對于無頂芽莖段不小于0.9 mg/L）則植株以叢生芽增殖型增殖為主?？梢?，露花有較強(qiáng)的頂端優(yōu)勢，要打破頂端優(yōu)勢獲得相同的叢生芽增殖預(yù)期，對于有頂芽莖段材料需要較高濃度的6-BA，而對于無頂芽莖段材料僅需較低濃度的6-BA，因此，建議采用無頂芽莖段作為叢生芽增殖培養(yǎng)材料。

當(dāng)把小枝條放在一種含有適宜種類和適當(dāng)濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基（生長素或有或無）上時(shí)，則可增強(qiáng)腋芽的生枝能力，使枝條的繁殖系數(shù)顯著提高[13]。露花芽增殖L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素6-BA濃度對露花芽增殖系數(shù)影響明顯，而NAA、GA3與蔗糖濃度影響不明顯。當(dāng)細(xì)胞分裂素的水平較高時(shí)，形成莖芽的數(shù)目可能較多，但每個(gè)莖芽的生長會受到抑制，有時(shí)還要加入GA3以促使莖的伸長[13]。雖然GA3濃度對芽增殖系數(shù)影響不明顯，但試驗(yàn)表明不加GA3的配方中增殖的芽莖較短密，而加有GA3的配方中增殖的芽莖較伸展。6-BA濃度的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)露花有頂芽莖段時(shí)，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L是最適宜的叢生芽增殖培養(yǎng)基配方，其平均芽增殖系數(shù)（5.4）高于正交試驗(yàn)中篩選的最適配方MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L（3.8）；培養(yǎng)露花無頂芽莖段時(shí)，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9～1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂是最適宜的叢生芽增殖培養(yǎng)基配方，其芽增殖系數(shù)達(dá)到最高，平均芽增殖系數(shù)高達(dá)5.7（最多的可達(dá)12.0），高于陳香波等[11]的4.0，接近（或高于）王小紅等[12]的6.2±2.8（最多的可達(dá)11.6）。試驗(yàn)進(jìn)一步表明，培養(yǎng)露花無頂芽莖段時(shí)，較低濃度的6-BA有利于減輕玻璃化現(xiàn)象；但要完全抑制露花試管苗的玻璃化，需在MS培養(yǎng)基中不加NH4NO3[16]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，露花適宜的生根培養(yǎng)基配方是1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L。只要控制好溫度、保持高濕度、遮陰避強(qiáng)光、注意基質(zhì)的透氣性，則露花煉苗移栽的成活率較高，可達(dá)96.7%以上。

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