黃芩素、LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響

汪楓，喻小蘭，夏紀毅，3，王曉燕，唐利，曹勇，唐小平，夏國棟

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；3西南醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所)

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·論著·

黃芩素、LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響

汪楓1，喻小蘭2，夏紀毅1，3，王曉燕1，唐利1，曹勇1，唐小平1，夏國棟1

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；3西南醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所)

目的 探討黃芩素和PI3K特異性抑制劑LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞， 20 μmol/L DMSO及0、1、5、10、20 μmol/L黃芩素分別處理SMMC-7721細胞，顯微鏡觀察細胞數(shù)量變化； 20 μmol/L DMSO及0、1、2、5、10、20、50、100、200和300 μmol/L黃芩素和0、1、2、5、10、20、30 μmol/L的LY294002處理SMMC-7721細胞24 h，CCK8法檢測細胞增殖活性。將SMMC-7721細胞隨機分為4組，A組加入0 μmol/L黃芩素；B組加20 μmol/L DMSO；C組加20 μmol/L黃芩素；D組加20 μmol/L黃芩素和 10 μmol/L LY294002，培養(yǎng)24 h，流式細胞術(shù)檢測細胞周期并計算細胞凋亡比例、RT- PCR法和Western blotting法檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表達及p-AKT活性。 結(jié)果 SMMC-7721細胞數(shù)量隨黃芩素/LY294002濃度增加而顯著減少，細胞增殖活性明顯降低(P均<0.05)。與A、B組相比，C、D組的G0～G1期細胞比例明顯增多(P<0.05)，S期細胞比例明顯下降，G2/M期細胞變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，C、D組G0～G1期細胞升高比例、S期細胞降低比例比較，P<均0.05。與A組和B組相比，C、D組早期凋亡和晚期凋亡細胞均明顯增多(P均<0.05)，D組比C組早期凋亡和晚期凋亡細胞增多更明顯(P<0.05)。與A、B組相比，C、D組抑制凋亡因子Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，凋亡促進因子Bax mRNA水平顯著增高(P<0.05)；D組Bcl-2 mRNA水平比C組降低更明顯，而Bax mRNA水平比C組升高更明顯(P均<0.05)。與A、B組相比，C、D組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平顯著降低(P均<0.05)，凋亡促進因子Bax表達量顯著增高(P均<0.05)，D組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平降低比C組更明顯(P均<0.05)，凋亡促進因子Bax表達量升高比C組更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 黃芩素與LY294002可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子的表達及增加活化的AKT水平從而誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡，抑制其增殖，且二者有協(xié)同效應(yīng)。

肝癌；黃芩素；磷酸肌醇3激酶抑制劑；人肝癌細胞系SMMC-7721細胞；細胞凋亡

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)臨床常用的治療方法有手術(shù)、放療和化療[1]。但肝癌易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，臨床療效和預(yù)后不理想，因此，尋找新的藥物和分子治療靶點是治療肝癌的關(guān)鍵[2]。磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT信號通路是參與多種癌細胞惡性增殖、分化、凋亡、心血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移的重要信號通路，多種藥物誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡均通過干擾PI3K/AKT信號通路[3]。生長因子受體如PDGF、IGF、EGF和胰島素等受體活化后可激活PI3K，使細胞質(zhì)膜上的3-磷酸肌醇磷脂含量增加，AKT與3-磷酸肌醇磷脂結(jié)合后被部分活化，PKB激酶被3-磷酸肌醇磷脂激活后使AKT磷酸化并全部激活，AKT被激活后，可激活核糖體S6激酶，促進Bcl-2表達，抑制細胞凋亡。Bax和Bcl-2是調(diào)控細胞凋亡的重要成員，Bcl-2/Bax值大小決定細胞是否凋亡，比值小，細胞凋亡，反之，細胞存活[4]。LY294002是PI3K的特異性抑制劑，能完全抑制PI3K的p110亞單位催化活性。黃芩素和LY294002均有抑制多種腫瘤的作用，但二者在肝癌中的療效罕見報道。2015年2月～2016年3月，我們探討了黃芩素和LY294002對人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系SMMC-7721用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、20 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。黃芩素購于Sigma公司，純度為99%，充分溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，儲存液濃度為5 000 μg/L(DMSO終濃度≤0.2%)，4 ℃避光保存，實驗時用細胞培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。LY294002購于Alexis公司，TRIzol試劑購于Invitrogen公司，細胞周期試劑盒購于南京凱基生物發(fā)展有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司。小鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人AKT抗體及兔抗人p-AKT抗體均購于CST公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(H+L)及辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(H+L)購于碧云天公司，引物均由上海生工合成。CCK8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購于拓然生物科技公司。

1.2 細胞數(shù)量變化觀察 人肝癌細胞系SMMC-7721用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、20 mmol/L NaHCO3、20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)具體情況更換培養(yǎng)基和傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗，分別加入DMSO 20 μmol/L及0、1、5、10、20 μmol/L黃芩素進行處理，24 h后，低倍境下觀察細胞數(shù)量變化。

1.3 細胞增殖活性檢測 采用CCK8法。調(diào)整細胞濃度至每孔200 μL 共1×103個細胞接種于96孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入不同濃度黃芩素(DMSO對照、0、1、2、5、10、20、50、100、200和300 μmol/L)或LY294002(DMSO對照、0、1、2、5、10、20、30 μmol/L)，培養(yǎng)24 h，每個樣本重復(fù)3次，加入CCK8溶液10 μL,混勻；培養(yǎng)4 h，生成Formazan測定450 nm波長處的吸光度值(A值)，A值與細胞增殖活性呈正比。

1.4 細胞周期及凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。調(diào)整細胞濃度，接種于12孔板，每孔細胞數(shù)5×105個，無血清RPMI1640培養(yǎng)基饑餓20 h后更換完全培養(yǎng)基，將細胞隨機分為四組，A組為空白對照組(Control組)，不予干預(yù)；B組加入DMSO 20 μmol/L；C組加入黃芩素20 μmol/L；D組加入黃芩素20 μmol/L+ LY294002 10 μmol/L，培養(yǎng)24 h，收集細胞，室溫PBS洗滌2次，加入70%預(yù)冷乙醇1 mL固定過夜，第2天離心去除乙醇，PBS重懸，加入RNaseA至終質(zhì)量濃度為100 mg/L，37 ℃水浴30 min，加入終質(zhì)量濃度為50 mg/L的PI染色液，4 ℃避光染色30 min，用激發(fā)波長為488 nm的紅色熒光檢測細胞周期。結(jié)果采用細胞周期擬合軟件進行分析，記錄亞二倍體峰，即凋亡細胞峰sub-G1期、G0～G1期、S期、G2～M期細胞比例，實驗重復(fù)3次。細胞凋亡檢測按照相關(guān)的試劑盒說明進行操作，檢測結(jié)果采用CellQuest軟件進行分析，實驗重復(fù)3次。

1.5 凋亡相關(guān)基因mRNA表達檢測 采用Real Time PCR法。調(diào)整細胞濃度，接種于6孔板，每孔細胞數(shù)1×106個，無血清PRMI1640培養(yǎng)基饑餓20 h后更換完全培養(yǎng)基，細胞隨機分為五組，A組為空白對照組(Control組)，不予干預(yù)；B組加入DMSO 20 μmol/L；C組加入黃芩素20 μmol/L；D組加入LY294002 10 μmol/L，E組加入黃芩素20 μmol/L+ LY294002 10 μmol/L，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，用TRIzol提取總RNA，采用Thermo Fermentas公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，采用Real Time PCR檢測凋亡相關(guān)基因表達，實驗重復(fù)3次。引物序列如下：Bax上游引物：5′-CATATAACCCCGTCAACGCAG-3′，下游引物:5′-GCAGCCGCCACAAACATAC-3′；Bcl-2上游引物：5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物:5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.6 凋亡相關(guān)基因蛋白表達檢測 采用Western blotting法。調(diào)整細胞濃度，接種于6孔板，每孔細胞數(shù)1×106，無血清PRMI1640培養(yǎng)基饑餓20 h后更換完全培養(yǎng)基，細胞隨機分為五組，A組為空白對照組(Control組)，不予干預(yù)；B組加入DMSO20 μmol/L；C組加入黃芩素20 μmol/L；D組加入LY294002 10 μmol/L，E組加入黃芩素20 μmol/L+ LY294002 10 μmol/L，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入臨時配用、終濃度為5%蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑的裂解液，冰浴20 min，使細胞全部裂解，12 000 r/min離心后取上清液，收集細胞總蛋白。采用BCA測定蛋白濃度并統(tǒng)一各組濃度為1.2 μg/μL后，取25 μL體積蛋白樣本進行10%SDS-PAGE電泳，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(Bax稀釋比例為1∶800，Bcl-2稀釋比例為1∶500, AKT稀釋比例為1∶1 000，P-AKT稀釋比例為1∶500，GAPDH稀釋比例為1∶2 000)4 ℃孵育過夜。1×TBST漂洗2次，5 min/次，辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(H+L)及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(H+L)(二抗稀釋比例均為1∶2 000)室溫孵育1 h，1×TBST漂洗3次，10 min/次，凝膠成像儀成像后通過Quantity One軟件進行灰度分析，計算相關(guān)蛋白表達。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件。計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素干預(yù)后SMMC-7721細胞數(shù)量變化 與黃芩素0μmol/L和DMSO20μmol/L相比，不同濃度黃芩素處理SMMC-7721 24h，細胞凋亡隨黃芩素濃度升高越來越顯著(P均<0.01)。黃芩素可誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡且呈濃度依賴性(P均<0.05),詳見表1。

表1 不同濃度藥物干預(yù)后細胞數(shù)量比較(個，

2.2 黃芩素或LY294002對SMMC-7721細胞增殖的影響 黃芩素或LY294002可顯著抑制SMMC-7721細胞增殖且呈濃度依賴性(P均<0.05),詳見表2、表3。

2.3 黃芩素或LY294002對SMMC-7721細胞周期的影響 與A組和B組相比，C組G0～G1期細胞比例明顯增多(P均<0.05)，S期細胞比例明顯下降，G2～M期細胞比例變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，D組G0～G1期細胞比例升高更顯著(P<0.05)，S期細胞比例降低更明顯(P<0.05)，G2～M期細胞無明顯變化(P>0.05)。黃芩素和LY294002聯(lián)用可明顯增加SMMC-7721細胞G1期細胞比例，降低S期細胞比例(表4)。

表2 不同濃度黃芩素干預(yù)后人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖活性比較

表3 不同濃度LY294002干預(yù)后人肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖活性比較

表4 黃芩素或LY294002干預(yù)后各組SMMC-7721細胞周期所占比例比較

2.4 黃芩素或LY294002誘導(dǎo)對SMMC-7721細胞凋亡的影響 與A組和B組相比，C組早期凋亡和晚期凋亡細胞比例均明顯增多(P均<0.05)，D組早期凋亡和晚期凋亡細胞比例增多更明顯(P<0.05)。黃芩素和LY294002均可誘導(dǎo)SMMC-7721細胞早期凋亡和晚期凋亡，且二者有協(xié)同效應(yīng)(表5)。

2.5 黃芩素或LY294002干預(yù)后各組SMMC-7721細胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達比較 與A組或B組相比，C組的抑制凋亡因子Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，凋亡促進因子Bax mRNA水平顯著增高(P<0.05)；D組Bcl-2 mRNA水平降低更明顯，而Bax mRNA水平升高更明顯。黃芩素聯(lián)合LY294002誘導(dǎo)人肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡效果更顯著(表6)。

表5 黃芩素或LY294002誘導(dǎo)SMMC-7721早期及晚期凋亡細胞所占比例比較

表6 黃芩素或LY294002干預(yù)后各組SMMC-7721細胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達比較

2.6 黃芩素或LY294002干預(yù)后各組SMMC-7721細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較 與A組和B組相比，C組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平顯著降低，凋亡促進因子Bax表達量顯著增高，D組凋亡抑制因子Bcl-2表達量和AKT磷酸化水平降低更明顯，凋亡促進因子Bax表達量升高更明顯(P均<0.05)。黃芩素聯(lián)合LY294002誘導(dǎo)人肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡更明顯(表7)。

表7 黃芩素或LY294002干預(yù)后各組SMMC-7721細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較

3 討論

肝癌是發(fā)展中國家發(fā)病率位居第五和致死率位居第二的腫瘤[5]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是復(fù)雜的過程，探究肝癌增殖、凋亡的分子機制，尋找治療肝癌的新藥物有重要臨床意義。

黃芩素是從中藥黃芩根部提取的黃酮類化合物，具有廣泛的抗病毒、抗炎作用，我們前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖[6]、促進宮頸癌HeLa細胞凋亡[7]，但其在肝癌中的療效還未得到完全闡述。LY294002是PI3K的特異性抑制劑，能完全抑制PI3K的p110亞單位催化活性，可抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡[8]。本研究表明聯(lián)合使用黃芩素和LY294002刺激人肝癌細胞系SMMC-7721，可使肝癌細胞數(shù)量明顯減少。

PI3K/AKT信號通路廣泛存在于真核細胞中，在細胞代謝、增殖和凋亡等過程中起關(guān)鍵作用[3, 9]。生長因子受體活化后可激活PI3K，使細胞質(zhì)膜3-磷酸肌醇磷脂含量增高[10]。AKT可與質(zhì)膜上的3-磷酸肌醇磷脂(主要是PI-3，4和5-P3)結(jié)合并被部分活化[11]?；罨腁KT可激活核糖體S6激酶，促進蛋白質(zhì)合成和細胞增殖，AKT亦可促進Bcl-2表達，抑制細胞凋亡[12]。Bcl-2家族是目前最受重視與細胞凋亡密切相關(guān)的一類基因，包括凋亡抑制基因Bcl-2類和凋亡促進基因Bax類[13, 14]。Bcl-2類包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等，Bax類包括Bax、Bak、Box等。一般來說，Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。當Bax形成同源二聚體時誘導(dǎo)細胞凋亡，當Bax與Bcl-2形成異源二聚體時，則實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能，Bcl-2/Bax值決定了細胞接受凋亡信號后存活與否，Bax占優(yōu)勢時細胞死亡，Bcl-2占優(yōu)勢時細胞存活[13,15]。癌癥細胞的凋亡與治療效果密切相關(guān)。我們的研究表明黃芩素或LY294002通過降低Bcl-2/Bax值和AKT磷酸化水平，從而降低細胞增殖，使絕大多數(shù)細胞阻滯于G0～G1期，誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡。

本研究結(jié)果顯示，黃芩素/LY294002干預(yù)后，可明顯減少肝癌細胞數(shù)量并呈濃度依賴性，提示黃芩素/LY294002可抑制肝癌細胞增殖。黃芩素與LY294002聯(lián)用較兩者單獨使用時，肝癌細胞數(shù)量減少更顯著，細胞增殖受抑程度與凋亡增加程度更明顯。同時黃芩素與LY294002聯(lián)用較兩者單獨使用時，Bcl-2表達水平明顯降低，而Bax表達水平明顯升高，p-AKT水平明顯降低。以上結(jié)果提示在肝癌細胞中黃芩素與LY294002通過降低p-AKT進而降低Bcl-2表達水平，增加Bax表達水平抑制肝癌細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，黃芩素和LY294002作為新型的抗腫瘤-中草藥和小分子抑制劑，通過降低凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達比例，顯著抑制SMMC-7721細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，且二者有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

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Effects of baicalein and LY294002 on proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line SMMC-7721

WANGFeng1,YUXiaolan,XIAJiyi,WANGXiaoyan,TANGLi,CAOYong,TANGXiaoping,XIAGuodong

(1TheAffiliatedHospitalofSouthWestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the effects of baicalein and phosphoinositide 3 kinase inhibitor LY294002 on proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line SMMC-7721. Methods SMMC-7721 cells were cultured in vitro, and the cell proliferation of SMMC-7721 cells was measured by CCK8 when SMMC-7721 cells were treated with 20 μmol/L DMSO and 0, 1, 5, 10, 20 μmol/L baicalein.The cell proliferative activity of SMMC-7721 cells was measured by CCK8 when SMMC-7721 cells were treated with 20 μmol/L DMSO, 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 and 300 μmol/L baicalein and 0, 1, 2, 5, 10, 20 and 30 μmol/L LY294002. Then SMMC-7721 cells were randomly divided into 4 groups: group A which was added with 0 μmol/L baicalein, group B with 20 μmol/L DMSO, group C with 20 μmol/L baicalein and group D with 20 μmol/L baicalein and 10 μmol/L LY294002 for 24 hours. The cell cycle and apoptosis of SMMC-7721 cells were detected by flow cytometry, the mRNA and protein levels of apoptosis-related factors Bcl-2, Bax as well as pAKT activity was detected by RT-PCR and Western blotting. Results SMMC-7721 cells were dramatically decreased with the increasing concentrations of baicalein and LY294002, with a dose-dependent manner, CCK8 assay indicated that both baicalein and LY294002 dramatically inhibited the proliferation of SMMC-7721 (allP<0.05). Compared with groups A and B, the proportion of cells in G0-G1phase of groups C and D was significantly higher (P<0.05). The proportion of cells in S phase was decreased and the cell changes in G2/M phase was not statistically different (P>0.05). In the groups C and D, the proportion of cells in G0-G1phase increased, and the proportion of cells in S phase decreased (allP<0.05). Compared with groups A and B, the early and late apoptotic cells in the groups C and D were significantly increased (allP<0.05), and the early and late apoptotic cells in the group D were more than those in the group C (P<0.05). Compared with groups A and B, the expression of Bcl 2 mRNA in the groups C and D was significantly decreased (P<0.05), and the level of Bax mRNA was significantly increased (P<0.05). The level of Bcl-2 mRNA in the group D was significantly lower than that in the group C, while the level of Bax mRNA was significantly higher than that in the group C (allP<0.05). Compared with groups A and B, the expression of Bcl-2 and the phosphorylation of AKT in the groups C and D was significantly decreased (allP<0.05) and the expression of Bax was significantly increased (allP<0.05). The expression of Bcl-2 and the phosphorylation of AKT in group D was significantly higher than that in the group C (allP<0.05) and the expression of Bax was significantly higher than that in the group C (allP<0.05).Conclusion Baicalein or LY294002 could induce apoptosis and inhibit the proliferation of SMMC7721 cells by regulating the expression of apoptosis-related factors and increasing the level of activated AKT, and the synergistic effect was found between them.

liver carcinama; baicalein; phosphoinositide 3 kinase inhibitor LY294002 cells; human liver cancer cell line SMMC-7721 cells; apoptosis

四川省科技廳項目(14JC01383-LH53)。

汪楓(1978-)，男，主治醫(yī)師，學(xué)士，主要研究方向為肝癌的機制研究。E-mail:wangfeng21080@163.com

簡介：夏國棟(1975-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要研究方向為肝癌的機制研究。E-mail:xjyi0615@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.001

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0001-05

2016-04-10)