利用microCT研究硫化鉍納米棒在小鼠體內(nèi)的分布

王東亮 何芳菲 郭宏博 胡西學(xué) 王昱青 鄭曉鵬 甘雅玲

(1. 國家納米科學(xué)中心納米生物儀器平臺(tái)， 北京 100190；2 .中國科學(xué)院高能物理研究所中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100049)

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研究與討論

利用microCT研究硫化鉍納米棒在小鼠體內(nèi)的分布

王東亮1何芳菲1郭宏博1胡西學(xué)1王昱青1鄭曉鵬2甘雅玲1

(1. 國家納米科學(xué)中心納米生物儀器平臺(tái)， 北京 100190；2 .中國科學(xué)院高能物理研究所中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100049)

MicroCT在分子影像學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，將硫化鉍納米棒灌胃給藥后，利用microCT對(duì)小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行掃描，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)納米材料在小鼠體內(nèi)的分布和代謝。計(jì)算小鼠各組織不同時(shí)間點(diǎn)的HU值，分析獲得納米材料在小鼠不同組織內(nèi)隨時(shí)間變化的累積及代謝情況。

MicroCT HU值 納米材料

MicroCT(micro computed tomography，微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù))，又稱微型CT、顯微CT，是一種非破壞性的3D成像技術(shù)，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)。X射線球管發(fā)射的X射線穿透樣本，最終在X-射線檢測(cè)器上成像，可對(duì)樣本進(jìn)行360°多角度成像。 MicroCT的應(yīng)用領(lǐng)域主要有骨研究、牙齒及牙周組織研究、生物材料、疾病機(jī)制研究、新藥開發(fā)等，主要是對(duì)活體小動(dòng)物、硬組織和相關(guān)軟組織進(jìn)行掃描成像分析,闡明疾病或腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中的分子相互作用，評(píng)價(jià)藥物和造影劑的生物效應(yīng)，并動(dòng)態(tài)連續(xù)監(jiān)測(cè)藥物在同一個(gè)體的分布及治療效果[1-3]。

現(xiàn)代分子影像學(xué)研究離不開能夠在分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平檢測(cè)生物和疾病發(fā)生過程的探針，以及有效提高成像分辨率的造影劑，納米材料作為新型成像造影劑，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)成像技術(shù)中發(fā)揮著越來越重要的作用[2]。硫化鉍可制備成各種不同尺寸、不同形狀的納米結(jié)構(gòu)，不同的結(jié)構(gòu)有著各種獨(dú)特的電學(xué)、光學(xué)特性[4，5]。同時(shí)，由硫化鉍制備所得的納米棒有很強(qiáng)的X射線吸收能力和在生物體內(nèi)更多的循環(huán)次數(shù)，在CT掃描時(shí)作為造影劑比傳統(tǒng)碘酸鹽造影劑具有優(yōu)勢(shì)，可以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，作為造影劑有很好的應(yīng)用潛力。目前對(duì)硫化鉍納米材料的研究多集中在不同的制備方法及其獨(dú)特的電化學(xué)、光學(xué)性能方面[4，5]，有些研究者則研究硫化鉍納米棒生物檢測(cè)器對(duì)DNA或miroRNA的檢測(cè)[6，7]，而硫化鉍納米棒還可以作為藥物載體，裝載藥物后進(jìn)入體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)治療與成像檢測(cè)的診療一體化。研究者發(fā)現(xiàn)，硫化鉍可實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像，同時(shí)用于熒光、光聲和CT成像檢測(cè)[8]，硫化鉍納米棒經(jīng)小鼠尾靜脈注射后，在肝和脾有較為明顯的聚集，但在不同時(shí)間、不同臟器的分布細(xì)節(jié)尚不清楚。目前常規(guī)研究藥物在動(dòng)物體內(nèi)的分布代謝所采用的方法多是收集其不同時(shí)間點(diǎn)的排泄物并取心、肝、脾、腎等臟器后利用ICP-MS、切片手段等研究其分布和代謝[9，10]，不僅工作量大，而且由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)誤差較大，本實(shí)驗(yàn)利用硫化鉍納米棒具有較好的CT成像特性，制備合成了硫化鉍納米棒，探索利用microCT實(shí)時(shí)檢測(cè)納米材料及藥物在動(dòng)物不同組織內(nèi)分布的方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 硫化鉍納米棒的制備和修飾

制備方法如文獻(xiàn)所述[8]，具體步驟如下：稱取1.45 g新十二酸鉍放入圓底燒瓶中，加入20 mL油酸和10 mL乙醇，室溫下攪拌0.5 小時(shí)。將0.15 g硫代乙酰胺完全溶于4 mL 油胺，快速加入含有新十二酸鉍的圓底燒瓶，然后將燒瓶放置的攪拌臺(tái)上，劇烈攪拌 0.5小時(shí)。待混合均勻后，將混合液體轉(zhuǎn)移到50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中。把反應(yīng)釜密封以后放置到烘箱里，在150oC 下放置10小時(shí)。自然冷卻至室溫后，通過12000 rpm離心收集產(chǎn)物，并用無水乙醇洗滌3次，去除可能的雜質(zhì)。

稱取50 mg 油酸包覆的Bi2S3納米材料，分散于20 mL環(huán)己烷中，在劇烈攪拌下接著滴加100 μL 吐溫-20，室溫下攪拌1小時(shí)。量取30 mL二次水加入100 mL圓底燒瓶中，在水浴條件下加熱到70oC，在劇烈攪拌下，滴加上述硫化鉍的環(huán)己烷溶液。在70oC下攪拌3小時(shí)來蒸干環(huán)己烷，隨著環(huán)己烷的蒸發(fā)，硫化鉍納米材料慢慢的轉(zhuǎn)到水相中。最后，通過離心收集產(chǎn)物，并用無水乙醇洗滌3次，最終得到的硫化鉍納米材料能很好的分散在水中并通過透射電鏡觀察制備所得的納米Bi2S3的形貌。

1.2 小鼠體內(nèi)Bi2S3納米棒的分布研究

取制備好的Bi2S3納米棒用生理鹽水溶解成為30mg/mL的溶液，取15g左右的Balb/c裸鼠，灌胃200μL后利用microCT進(jìn)行實(shí)時(shí)掃描觀察。

1.3 MicroCT掃描數(shù)據(jù)獲取及處理

CT掃描所采用儀器為國家納米科學(xué)中心生物儀器平臺(tái)的Triumph X-SPECT2h/X-OCT(TriFoil Imaging, Inc.)，掃描電壓為60 kV，電流250 μA，視野FOV為8cm×8cm，圖像處理采用系統(tǒng)自帶軟件Amira 4.1，采用軟件自帶插件計(jì)算所獲取圖像的HU值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 硫化鉍納米棒制備完成后

取10 μL滴到銅網(wǎng)上，干燥后在透射電鏡下觀察，結(jié)果圖1所示，顯示制備所得納米棒基本為棒狀，長約50 nm左右，寬約6納米，比較均一。

2.2 硫化鉍納米棒在小鼠體內(nèi)的分布

對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后，取200 μL硫化鉍納米棒溶液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，完畢后馬上進(jìn)行CT數(shù)據(jù)采集，將采集獲得的數(shù)據(jù)利用Amira 進(jìn)行三維重建后生成CT圖像，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出,灌胃前,小鼠的胃和腸道基本是空的, 灌胃后進(jìn)行掃描，10分鐘時(shí)，小鼠的胃部充滿了硫化鉍納米棒，少部分硫化鉍已經(jīng)到達(dá)了小腸部分。隨著時(shí)間的推移，硫化鉍逐漸從胃部進(jìn)入小腸。隨著硫化鉍在小鼠小腸部位的聚集，小腸的CT圖像越來越清晰，亮度越來越高。隨著時(shí)間的延長，硫化鉍也逐漸從小腸進(jìn)入到大腸，大腸體積變大，顯示硫化鉍在大腸中累積起來。

在本實(shí)驗(yàn)中所使用的小鼠是處于存活狀態(tài)，通過microCT掃描獲取的圖像無法明確區(qū)分小鼠腸道如十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等各個(gè)具體部分，我們僅按照文獻(xiàn)[11]的研究方法，簡單分成了小腸和大腸，如圖3所示，利用Amira影像分析軟件分別計(jì)算了小鼠的胃部、小腸和大腸在不同時(shí)間點(diǎn)的HU值及其體積。

CT掃描所獲得的某組織的HU值與該組織對(duì)X射線的吸收量有關(guān)，吸收的X射線越多，HU值越大，在其它條件都不變的情況下，小鼠某組積累積的硫化鉍納米棒越多，吸收的X射線也將越多，因此小鼠組織的HU值與該組織累積的硫化鉍的量是相關(guān)的。從圖4可以看出，小鼠被灌胃硫化鉍后，胃部的HU值增高，然后逐漸下降，這說明硫化鉍進(jìn)入小鼠胃部后隨即進(jìn)入小腸，在小腸部位會(huì)逐漸累積，直到1.5小時(shí)達(dá)到最大值，在此期間，小鼠大腸部位的HU值沒有明顯變化，說明硫化鉍納米棒還沒有進(jìn)入大腸。當(dāng)灌胃1.5小時(shí)后，硫化鉍逐漸從小腸進(jìn)入大腸，大腸的HU值有升高，但升高的幅度卻小于小腸HU值的下降幅度，這可能是由于部分硫化鉍進(jìn)入大腸后，通過排便行為被排出了小鼠體外，在小鼠掃描床及掃描間隙放置小鼠的紙盒中，都發(fā)現(xiàn)了一定量的小鼠糞便。

從圖2的H圖上可以看出，小鼠被灌胃6小時(shí)后，大腸部位應(yīng)該有大量的硫化鉍，但圖4顯示，6小時(shí)小鼠大腸部位的HU值并沒有明顯升高，這顯示硫化鉍在此處并沒有大量聚集。因此我們檢查了不同時(shí)間點(diǎn)小鼠CT斷層掃描圖片。如圖5所示，灌胃90分鐘后，小鼠的小腸內(nèi)充滿了硫化鉍，整條小腸的亮度很高。而在灌胃6個(gè)小時(shí)后，硫化鉍基本上只是存在于小鼠大腸的腸壁上，大部分已經(jīng)通過小鼠的排便行為排出。

3 討論

利用microCT檢測(cè)納米材料在小鼠體內(nèi)的分布已經(jīng)有相當(dāng)多的研究，如研究者發(fā)現(xiàn)一定尺寸的納米金顆粒經(jīng)小鼠尾靜脈注射后可富集于腎臟中，可作為CT造影劑用于腎臟成像[12]；摻雜有銣元素的三氧化鎢可制成RbxWO3納米棒，同時(shí)用于小鼠腫瘤的熱療和CT成像[13]；TPGS修飾后的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料NaYbF4:Er不僅可以用于熒光/CT的雙模態(tài)成像，還可以作為藥物載體裝載抗腫瘤藥物后用于抗性腫瘤的治療[14]。這些研究均利用microCT對(duì)納米材料進(jìn)行了成像，并取得了良好的結(jié)果，但是這些納米材料在小鼠體內(nèi)不同組織間隨時(shí)間的變化關(guān)系尚不清楚。建立一種可以實(shí)時(shí)檢測(cè)此類納米材料或載藥納米顆粒在小鼠體內(nèi)不同組織內(nèi)分布的方法，對(duì)于深入開展納米材料在動(dòng)物水平的生物效應(yīng)研究有很大的幫助。對(duì)于納米金、硫化鉍納米棒等一批具有良好CT成像效果的納米材料而言，利用microCT進(jìn)行成像，與熒光成像、PET和SPECT成像相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：它有遠(yuǎn)超熒光探針的穿透深度，易于實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)各組織的高分辨成像，而且microCT不像PET和SPECT那樣成像時(shí)需要放射性核素，應(yīng)用更安全、方便。本研究顯示，利用microCT有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)納米顆粒或載藥納米顆粒在小鼠體的分布變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，與需在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠檢測(cè)不同組織內(nèi)的藥物含量相比，獲取更接近小鼠生理狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Research on distribution of bismuth sulfide nanorods in vivo by microCT.

Wang Dongliang1, He Fangfei1, Guo Hongbo1, Hu Xixue1, Wang Yuqing1, Zheng Xiaopeng2, Gan Yaling1

(1.NanobiologicalInstrumentPlatform,NationalCenterforNanoscienceandTechnologyofChina,Beijing100190,China;2.KeyLaboratoryforBiomedicalEffectsofNanomaterialsandNanosafety,InstituteofHighEnergyPhysics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

The microCT was used for scanning the mice at different times by microCT, and monitoring the real-time distribution and metabolism of nano materials in vivo after the intragastric administration of the bismuth sulfide nanorods. The CT HU values of mice tissue at different times were calculated, and the accumulation and metabolism of nano materials in mice were analyzed.

microCT; HU values; nano material

王東亮，男，1978年出生，博士，現(xiàn)就職于國家納米科學(xué)中心納米生物儀器平臺(tái)，工程師，研究方向：分子影像學(xué)，E-mail：wangdl@nanoctr.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.015

2016-09-30