固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑

徐秋生 劉 俊 賀慧琳 吳愛紅

(平湖市食品藥品檢測(cè)中心，平湖 314200)

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固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑

徐秋生 劉 俊 賀慧琳 吳愛紅

(平湖市食品藥品檢測(cè)中心，平湖 314200)

建立了采用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑(除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲和氟啶脲)的方法。蔬菜樣品用乙腈均質(zhì)法提取鹽析后脫水，經(jīng)Florisil固相萃取柱凈化，正己烷/丙酮(85/15，V/V)淋洗，洗脫液濃縮定容后經(jīng)液相色譜分離與檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，各組分農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在83.5%～105.6%之間，變異系數(shù)(CV)在3.05%～9.56%之間，最低檢出限0.02～0.04mg/kg，滿足蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑的檢測(cè)要求。

固相萃取 高效液相色譜 蔬菜 敵菌靈 苯甲酰脲類殺蟲劑

敵菌靈是由三聚氰酰氯與鄰氯苯胺在脫酸劑存在下作用而得到的一種殺菌劑，其化工產(chǎn)品學(xué)名為2，4-二氯-6-(鄰氯代胺基)均三氮苯，具有低毒、內(nèi)吸性和殺菌譜較廣等特點(diǎn)[1]，對(duì)交鏈孢屬、尾孢屬、 葡柄霉屬、葡萄孢屬等真菌特別有效，廣泛用于糧食、蔬菜等農(nóng)作物，防治水稻胡麻葉斑病，瓜類的炭疽病、霜霉病、黑星病和各種農(nóng)作物的灰霉病。苯甲酰脲類殺蟲劑屬幾丁質(zhì)合成抑制劑，主要通過(guò)抑制昆蟲蛻皮，變態(tài)導(dǎo)致不育及直接殺卵等作用來(lái)控制害蟲的繁衍[2]。目前在用的主要有除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲和氟啶脲等，該類農(nóng)藥與有機(jī)磷、氨基甲酸酯、菊酯類等殺蟲劑之間無(wú)交互抗性且防蟲效果更佳，在糧食、蔬菜等農(nóng)作物得到廣泛應(yīng)用[3]。近年來(lái)隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和社會(huì)的發(fā)展，各類農(nóng)藥在農(nóng)作物生長(zhǎng)過(guò)程中的廣泛使用，不可避免帶來(lái)農(nóng)藥殘留問(wèn)題以及對(duì)人類在存潛在的危險(xiǎn)，農(nóng)藥殘留危害已引起更多人的關(guān)注，世界先進(jìn)國(guó)家和地區(qū)都制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，包括CAC、歐盟、美國(guó)和日本均有現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)在GB 2763-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[4]中對(duì)于敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑作了明確的限量規(guī)定。

農(nóng)藥殘留分析的樣品種類繁多，化學(xué)組成復(fù)雜，要使分析儀器能檢測(cè)到痕量的殘留農(nóng)藥，必須對(duì)樣品進(jìn)行必要的提取、濃縮和凈化處理[5]。固相萃取是近年發(fā)展起來(lái)一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來(lái)，能有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析中[6]。目前，測(cè)定糧食、蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法報(bào)道比較多，主要包括高效液相色譜法[7，8]、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等，但這些檢測(cè)的報(bào)道多以敵菌靈或苯甲酰脲類殺蟲劑單一品種農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑農(nóng)藥殘留的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了采用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑的分析方法，并做了方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，為快速檢測(cè)蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑農(nóng)藥殘留進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

敵菌靈、除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲、氟啶脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer)；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷(色譜純，德國(guó)Merck)；氯化鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán))；Cleanert Florisil柱(1000mg/6mL，天津Agela)；Cleanert Alumina-N柱(1000mg/6mL，天津Agela)；WondaSep Si硅膠小柱(500mg/6mL，日本島津)；有機(jī)微孔濾膜(0.22μm，天津Agela)；超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)，Thermo Fisher公司)；TurboVapLV型全自動(dòng)定量濃縮儀(瑞典，Biotage公司)；T25高速均質(zhì)機(jī)(德國(guó)，IKA公司)；LD4-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Milli-Q Advatantage A10超純水機(jī)(法國(guó)，Merck Millipore公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取敵菌靈、除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲和氟啶脲7種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg至10mL的棕色容量瓶中，用甲醇配成濃度約為1000 mg/L單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-18℃保存，備用。吸取7種單標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，置于棕色容量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為25mg/L農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-18℃保存，備用。

1.2.2 樣品前處理

稱取粉碎均勻的蔬菜試樣15 g(精確至0.01 g)于100 mL聚丙烯(PP)塑料離心管中，加入30.0mL乙腈，均質(zhì)機(jī)高速均質(zhì)2min，4000r/min離心5min，取上清液倒入預(yù)先稱取3～5g氯化鈉的100 mL聚丙烯(PP)塑料離心管中，蓋上塞子，劇烈振蕩1min，靜置30min，使乙腈相和水相充分分層。從離心管中吸取10.0mL乙腈溶液至15mL玻璃樣品管中，置于全自動(dòng)定量濃縮儀80℃水浴氮吹蒸發(fā)近干，加入2.0mL正己烷渦旋混勻待凈化。依次用5.0mL正己烷/丙酮(85/15，V/V)淋洗液和5.0mL正己烷預(yù)淋洗Florisil(1000mg/6mL)小柱，棄去流出液，當(dāng)正己烷液面層到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即移入待凈化樣品液，用15mL玻璃樣品管接收洗脫液，5.0mL正己烷/丙酮(85/15，V/V)洗脫液清洗樣品管后淋洗小柱，并重復(fù)兩次。將盛有洗脫液樣品管置于全自動(dòng)定量濃縮儀上，水浴50℃氮吹蒸發(fā)近干，加入2.0mL甲醇渦旋混勻，過(guò)0.22μm有機(jī)微孔濾膜，上液相色譜測(cè)定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)B為水，洗脫程序0～20min，A從45%線性增加至100%， 20～22min保持A為100%，22～24min A線性減少至45%，23～30min保持A為45%；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)器：二極管陣列(DAD)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)分析，在190nm～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，獲得7種農(nóng)藥的紫外吸收光譜重疊圖(見圖1)，從光譜圖上可以看出7種農(nóng)藥在250 nm～260nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有較強(qiáng)紫外吸收峰，綜合比較后選擇260nm為本方法的色譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中，乙腈、丙酮和乙酸乙酯是3種常用的提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)選擇黃瓜空白樣品中添加農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定各組分農(nóng)藥的回收率，比較了3種提取溶劑的提取效率，結(jié)果見圖2。由圖2可見，3種溶劑的回收率均能滿足農(nóng)殘分析要求，但是與乙腈相比較，丙酮和乙酸乙酯溶出的雜質(zhì)和色素較多，對(duì)后續(xù)的凈化處理有較大的影響。本實(shí)驗(yàn)最終選用乙腈作為提取溶劑，7種農(nóng)藥回收率均在90%以上。

2.3 凈化方式的選擇

農(nóng)藥殘留分析常用的前處理方法有液-液萃取(MLLE)、固相萃取(SPE)、超臨界流體萃取(SFE)和凝膠滲透(GPC)等，本實(shí)驗(yàn)選用固相萃取法比較了Cleanert Florisil柱、WondaSep Si柱和Cleanert Alumina-N柱3種不同固相萃取柱對(duì)于黃瓜空白樣品的凈化效果及回收率，從圖3中可以看出3種固相萃取柱回收率都能滿足農(nóng)殘分析要求，相比較Cleanert Florisil柱和Cleanert Alumina-N柱的回收率優(yōu)于WondaSep Si柱，實(shí)驗(yàn)最終選擇傳統(tǒng)的Florisil柱作為凈化用固相萃取柱。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

吸取農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。用甲醇逐級(jí)稀釋各組分農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比(S/N)計(jì)算最低檢出限，結(jié)果見表1。從表1可見，7種農(nóng)藥在0.05～5.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

2.5 加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)

稱取粉碎均勻的黃瓜空白試樣15 g(精確至0.01 g)，分別添加0.04mg/kg、0.1mg/kg和1.0mg/kg 3個(gè)不同水平的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述條件進(jìn)行前處理，測(cè)定樣品中各組分農(nóng)藥的含量，每個(gè)添加濃度重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和變異系數(shù)(CV)，結(jié)果見表2。各組分農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在83.5%～105.6%之間，變異系數(shù)(CV)在3.05%～9.56%之間，符合農(nóng)藥殘留分析要求。黃瓜空白樣品和黃瓜加標(biāo)樣品的色譜圖見圖4、圖5，由色譜圖可見，經(jīng)過(guò)Florisil柱凈化后色素能被有效吸附，在上述色譜條件下，各組分農(nóng)藥分離較好，無(wú)雜質(zhì)干擾，能夠滿足敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

表2 回收率與精密度試驗(yàn)(n=6)

2.6 蔬菜樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)某蔬菜批發(fā)市場(chǎng)銷售的不同品種的蔬菜樣品進(jìn)行了敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲7種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，每個(gè)品種選擇了3個(gè)不同的基質(zhì)，并用二極管陣列(DAD)檢測(cè)器收集紫外譜圖進(jìn)行定性分析，檢測(cè)結(jié)果見表3。由表3可見，氟鈴脲和殺鈴脲2種農(nóng)藥在被檢蔬菜樣品中未檢出，其余5種農(nóng)藥均有檢出，但符合GB 2763-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[4]最大殘留限量要求。

表3 蔬菜樣品中7種農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果 mg/kg

3 結(jié)論

采用固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑，各組分農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在83.5%～105.6%之間，變異系數(shù)(CV)在3.05%～9.56%之間，符合農(nóng)藥殘留分析要求，方法操作簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確可靠，使用本方法完全可以滿足蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑的日常檢測(cè)要求。

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Determination of anilazine and benzoylurea insecticides pesticide residues in vegetables by solid phase extraction and high performance liquid chromatography.

Xu Qiusheng, Liu Jun, He Huilin ,Wu Aihong

(PinghuFoodandDrugInspectionCenter,Pinghu314200,China)

The sample was homogeneously extracted by acetonitrile with salting out and dehydration. After purification on the Florisil solid phase extraction column, eluted with Hexane/Acetone (85/15,V/V), the eluent was concentrated and diluted for high performance liquid chromatography analysis,measured by the external standard.The results showed that the recoveries of pesticides were between 83.5%-105.6%, and the coefficient of variation(CV) ranged from 3.05% to 9.56%, the lowest detection limit was 0.02-0.04mg/kg. The method can meet the detection requirements of anilazine and benzoylurea insecticides residues in vegetables.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography; vegetables; anilazine; benzoyllurea insecticides

徐秋生,男，1979年出生，工程師,研究方向:食品、農(nóng)產(chǎn)品儀器分析與測(cè)試，E-mail: xuqsh@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.005

2016-05-23