安多霖對(duì)高功率微波輻照大鼠睪丸生精細(xì)胞Caspase-9和 XIAP的影響

郝述霞 呂慧敏 王春燕 齊雪松 佟 鵬 茍 巧

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 北京 100088）

安多霖對(duì)高功率微波輻照大鼠睪丸生精細(xì)胞Caspase-9和 XIAP的影響

郝述霞 呂慧敏 王春燕 齊雪松 佟 鵬 茍 巧

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 北京 100088）

為探討安多霖對(duì)微波輻射損傷的的防治機(jī)制，將SD雄性大鼠按質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、輻照組和預(yù)防組（給藥量分別為3、6、9 mg/kg）。預(yù)防組大鼠連續(xù)灌胃給藥，對(duì)照組和輻照組給予雙蒸水，20 d后輻照組和預(yù)防組大鼠行100 mW/cm2的高功率微波(High power-microwave, HPM)全身輻照10 min。于輻照后第1、2、5天取睪丸組織制備病理標(biāo)本，采用SP免疫組化檢測(cè)試劑盒標(biāo)定目的蛋白，Image-pro plus圖像分析軟件對(duì)特定染色區(qū)域進(jìn)行灰度分析和測(cè)定。結(jié)果顯示，輻照組大鼠睪丸細(xì)胞 Caspase-9水平較對(duì)照組呈“高?低?高”的“倒拋物線”形(p<0.05)，給藥組則隨著時(shí)間呈現(xiàn)“先低后高”的趨勢(shì)(p<0.05)；對(duì)于X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)而言，輻照組與對(duì)照組之間的差異不顯著，而6、9 mg/kg組在輻照后第5天較輻照組顯著升高(p<0.05)。結(jié)果提示，Caspase-9參與了HPM致大鼠睪丸細(xì)胞凋亡的過(guò)程，安多霖對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞的保護(hù)作用需要Caspase-9和XIAP的共同參與。

高功率微波，安多霖，凋亡，Caspase-9，X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查對(duì)電磁輻射的生物效應(yīng)開(kāi)展了不少研究，認(rèn)為在一定吸收劑量下，電磁輻射對(duì)機(jī)體的內(nèi)分泌、心血管、造血、免疫、中樞神經(jīng)和生殖系統(tǒng)等均可造成損傷，引起組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和功能學(xué)障礙等諸多后果[1-6]。目前，針對(duì)電磁輻射損傷的輻射防護(hù)劑還比較缺乏，中藥安多霖是國(guó)內(nèi)自主創(chuàng)新并已獲得國(guó)家批準(zhǔn)的電離輻射防護(hù)劑和腫瘤治療輔助藥物。幾年來(lái)課題組從免疫、生殖和氧化損傷等方面開(kāi)展了大量實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果證實(shí)，在適宜的劑量下，安多霖對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)、氧化應(yīng)激系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均有明顯保護(hù)作用[7-9]。在先前實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究重點(diǎn)考察微波輻射以及服用安多霖對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和XIAP的影響，通過(guò)研究進(jìn)一步探討高功率微波輻射誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡及安多霖保護(hù)作用的發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

安多霖由福建阿多拉制藥公司提供，為淺黃色粉末，4 ℃保存，給藥前用蒸餾水配制。X連鎖凋亡抑制蛋白 XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)為美國(guó)Sant cruz產(chǎn)品，Caspase-9為Abcam公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒和 DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 動(dòng)物和分組

實(shí)驗(yàn)以SPF級(jí)性成熟SD雄性大鼠(250~270 g)為研究對(duì)象，按質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、輻照組(Exposure)、預(yù)防組(Prevention+exposure)（給藥劑量為3、6、9 mg/kg），每組10只。預(yù)防組大鼠連續(xù)灌胃20 d后（對(duì)照組和輻照組每天喂雙蒸水），將輻照組和預(yù)防組大鼠放在自行加工的鼠盒中（大鼠在鼠盒中不能自由活動(dòng)）采用平均功率密度為100 mW/cm2的高功率微波(High power-microwave, HPM)輻照10 min，分別于輻照后第1、2、5天解剖動(dòng)物取睪丸，用10%的甲醛溶液固定待用。

1.3 凋亡相關(guān)蛋白(XIAP和Caspase-9)表達(dá)量的測(cè)定

組織切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，用 SP免疫組化檢測(cè)試劑盒標(biāo)定目的蛋白。采用Image-pro plus 圖像分析軟件對(duì)動(dòng)物睪丸免疫組化切片的特定染色區(qū)域進(jìn)行灰度分析。每只大鼠一張切片，每張選取5個(gè)視野進(jìn)行組織的光密度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠睪丸細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的變化

安多霖對(duì) HPM輻照大鼠睪丸凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的影響見(jiàn)表1。輻照后，輻照組Caspase-9含量較對(duì)照組顯著升高(p<0.05)，而預(yù)防組Caspase-9水平均較輻照組低(p<0.05)。Caspase-9分子以酶原的形式被合成，存在于細(xì)胞漿中，在體內(nèi)低水平表達(dá)。活化的Caspase-9與細(xì)胞色素C (Cytochrome C)和凋亡蛋白活性因子-1 (Apaf-1 apoptosis protease activating factor-1)一起催化裂解Caspase-3，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。圖1顯示了各組Caspase-9蛋白的表達(dá)量。

表1 安多霖對(duì)HPM輻照大鼠睪丸凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的影響xTable 1 Effects of Anduolin on Caspase-9 in testicular cells of rats exposed to high power-microwave () (n=10)

表1 安多霖對(duì)HPM輻照大鼠睪丸凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的影響xTable 1 Effects of Anduolin on Caspase-9 in testicular cells of rats exposed to high power-microwave () (n=10)

注：a與正常對(duì)照組比較，p<0.05；b與輻照組比較，p<0.05。Note:a, compared with control group, p<0.05;b, compared with exposure group, p<0.05.

組別Groups照射后不同時(shí)間的平均光密度值A(chǔ)verage optical density at different times after exposure 1 d 2 d 5 d對(duì)照組Control 0.016 2±0.005 4 0.015 0±0.001 9 0.016 1±0.001 9輻照組Exposure 0.022 2±0.005 5a0.005 9±0.001 2a0.022 4±0.003 2a預(yù)防組Prevention + exposure 3 mg/kg 0.007 9±0.003 5b0.004 5±0.001 5b0.018 2±0.005 7b6 mg/kg 0.007 9±0.004 7b0.009 9±0.002 9b0.021 2±0.001 2 9 mg/kg 0.015 8±0.002 5b0.013 2±0.001 5b0.019 9±0.001 2b

2.2 大鼠睪丸細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白XIAP的變化

從表2可知，輻照后的第1天和第2天，輻照組、預(yù)防組和對(duì)照組之間XIAP的蛋白表達(dá)含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。輻照后第5天，6、9 mg/kg預(yù)防組大鼠XIAP蛋白含量較輻照組顯著升高(p<0.05)。

凋亡抑制因子X(jué)IAP蛋白是一種高度保守的內(nèi)源性抗細(xì)胞凋亡因子，主要通過(guò)抑制胱解酶(Caspase)活性和參與調(diào)節(jié)核因子NF-kB的作用而抑制細(xì)胞凋亡。XIAP存在于細(xì)胞漿中，長(zhǎng)497 kD。圖2中顯示了各組XIAP蛋白的表達(dá)量。

表2 安多霖對(duì)HPM輻照大鼠睪丸凋亡相關(guān)XIAP的影響xTable 2 Effects of Anduolin on XIAP in testicular cells of rats irradiated by high-power microwave (±s) (n=10)

3 討論

本課題組先前的研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng) HPM輻照后，其睪丸細(xì)胞凋亡明顯增加，而安多霖則對(duì)HPM輻照大鼠睪丸細(xì)胞有保護(hù)作用[9]。本研究在以往對(duì)多種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白研究的基礎(chǔ)上，以細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和XIAP為指標(biāo)，進(jìn)一步探討 HPM輻照大鼠睪丸細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，以及探討中藥安多霖對(duì)電磁輻射損傷的防治作用及可能機(jī)制。

Caspase-9是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中比較上游的一個(gè)胱解酶。線粒體釋放Cyt-c后，Caspase-9可以和Cyt-c以及Apaf-1形成復(fù)合物，同時(shí)被激活。激活的 Caspase-9可以激活細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵酶Caspase-3，從而引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，輻照組在輻照之后的5 d內(nèi)Caspase-9表達(dá)水平較正常對(duì)照組相比較呈“高-低-高”的“倒拋物線”型，輻照后第1天Caspase-9的迅速增高可能是由于輻照組經(jīng)電磁輻射激發(fā)引起，進(jìn)而引起睪丸細(xì)胞凋亡。FANG等[10]用75 mGy（劑量率為12.5 mGy/min）的X射線照射小鼠后24 h，小鼠睪丸細(xì)胞 Caspase-9表達(dá)水平也升高；輻照后第 2天Caspase-9表達(dá)水平銳減，推測(cè)可能是由于細(xì)胞受損、細(xì)胞合成Caspase-9受到限制所致，而第5天由于細(xì)胞的損傷修復(fù)，Caspase-9含量回升至輻照后第1天的水平，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。

對(duì)于安多霖藥物預(yù)防組，輻照之后各給藥組在第1、2和5天的Caspase-9含量均比輻照組明顯降低(p<0.05)，推測(cè)電磁輻射后，給藥組動(dòng)物迅速做出反應(yīng)使 Caspase-9含量降低以減少睪丸細(xì)胞凋亡。同時(shí)觀察到，在輻照之后的第1天和第2天，隨著給藥劑量的增大，大鼠睪丸細(xì)胞 Caspase-9表達(dá)量也增加，而且9 mg/kg組含量在輻照之后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平比較平穩(wěn)，推測(cè)9 mg/kg組動(dòng)物由于體內(nèi)安多霖的藥物水平較高，使得在照射之后Caspase-9降低的更早，在輻照后第1天表達(dá)已經(jīng)穩(wěn)定了，所以在下一步的實(shí)驗(yàn)中，我們可以把觀察時(shí)間提前來(lái)驗(yàn)證這一推測(cè)。

XIAP是IAP家族中最有效力的內(nèi)源性Caspase抑制因子，XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域可與Caspase-9單體形成異源二聚體，使 Caspase-9保持單體結(jié)構(gòu)，喪失催化活性[11]。在本研究中，輻照組動(dòng)物經(jīng)HPM輻照后，XIAP表達(dá)與正常對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各預(yù)防給藥組在輻照后隨著時(shí)間改變 XIAP表達(dá)水平逐步上升，到第5天，6、9 mg/kg組XIAP表達(dá)水平明顯高于輻照組(p<0.05)。在本實(shí)驗(yàn)條件下，HPM輻照對(duì)動(dòng)物睪丸細(xì)胞XIAP表達(dá)的影響不太明顯，而安多霖給藥組卻顯現(xiàn)出其提高XIAP表達(dá)水平的作用。Chater等[12]在電離輻射與化療藥物奧沙利鉑引起小鼠睪丸細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中，用0.5 Gy（劑量率為300 cGy/min）的X射線照射小鼠，同樣沒(méi)有引起XIAP水平的變化，而奧沙利鉑卻可以引起XIAP水平的增高。說(shuō)明XIAP沒(méi)有參與非電離輻射和電離輻射所致凋亡這一過(guò)程，但安多霖和奧沙利鉑卻可以調(diào)高XIAP的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡；安多霖起效時(shí)間比較晚，藥效維持時(shí)間有待于進(jìn)一步的觀察。

結(jié)合之前的研究[9,13]，推測(cè)HPM輻照大鼠后，睪丸細(xì)胞通過(guò)一系列的蛋白相互作用，引起p53蛋白的激活，活化的p53由核內(nèi)向線粒體快速轉(zhuǎn)移，p53或 p53小片段與線粒體膜上表達(dá)增高的 Bax[9]相互作用，誘導(dǎo)Bax多聚化形成孔復(fù)合物或線粒體腫脹通透性增加導(dǎo)致Cyt-c釋放[14-15]。Cyt-c與胞漿中的Apaf-1結(jié)合形成凋亡體，并活化Caspase-9，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡線粒體途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。給藥組動(dòng)物雖然也受到某種程度的輻射影響，但其影響較輻照模型組明顯減輕，表明安多霖具有輻射防治作用，推測(cè)其作用機(jī)制是安多霖通過(guò)一定程度的逆轉(zhuǎn)Bax和Apaf-1的表達(dá)水平、減小線粒體損傷、降低Caspase-3 活性以減少p53的被切割，以及減低Caspase-9和調(diào)高XIAP的表達(dá)水平，來(lái)達(dá)到減弱電磁輻射誘導(dǎo)大鼠睪丸細(xì)胞凋亡的作用。

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Effects of Anduolin on Caspase-9 and XIAP of testicular cells in rats irradiated by high-power microwave

HAO Shuxia LYU Huimin WANG Chunyan QI Xuesong TONG Peng GOU Qiao
(National Institute for Radiological Protection, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100088, China)

In order to investigate the Anduolin injury prevention mechanism of microwave exposure, sexually matured SD rats were randomly divided into control group, exposure group, and prevention groups (drug dosage were 3, 6 and 9 mg/kg). Prevention groups were given drug continuously by oral administration for 20 d, meanwhile the control group and exposure group were given distilled water. After that the prevention groups and exposure group were exposed to high power-microwave (HPM) of 100 mW/cm2for 10 min. Rats were killed at 1st, 2nd, and 5thday after exposure, and the pathological specimens were prepared from testicular tissue. Interested proteins in testicular tissue were detected with immunohistochemical method, and the protein content were analyzed with image-pro plus analysis software. The results showed that protein content of Caspase-9 of exposure group showed a high-low-high trend compared with control group (p<0.05) at 1st, 2nd, and 5thday after exposed to HPM, while the prevention groupsshowed a trend from low to high with time (p<0.05); for X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) protein, there was no significantly difference between exposure group and control group, while the XIAP levels of 6 mg/kg group and 9 mg/kg group at 5thday after exposure increased significantly compared with the exposure group (p<0.05). The results suggest that Caspase-9 is involved in the HPM-induced apoptosis in rat testis, and protective effect of Anduolin on rat testicular cells requires participation of Caspase-9 and XIAP.

High power microwave, Anduolin, Apoptosis, Caspase-9, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)

HAO Shuxia (female) was born in September 1975 and received her master degree from Chinese Center for Disease Control and Prevention, associate professor, majoring in radiation protection drugs, E-mail: hao-shuxia@163.com

LYU Huimin, professor, E-mail: lu-huimin@163.com

TL7

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.060201

郝述霞，女，1975年9月出生，2006年于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心獲得碩士學(xué)位，放射醫(yī)學(xué)專業(yè)，副研究員，從事輻射防護(hù)藥物的研究，E-mail: hao-shuxia@163.com

呂慧敏，研究員，E-mail: lu-huimin@163.com

初稿2016-07-06；修回2016-09-19

Received 6 July 2016; accepted 19 September 2016

CLCTL7