異羥肟酸對宮頸癌細(xì)胞生長抑制作用的研究

魏萍+李苓+張瑋+張小玲+張婷婷+盛修貴

【中圖分類號】R490.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號】2095-6851（2016）12-0-01

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDI）是一類特異性抑制組蛋白去乙?；浮⒋龠M(jìn)染色質(zhì)解螺旋、增強(qiáng)其趨近性，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的小分子化合物。體內(nèi)、外研究證明組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移、降低腫瘤侵襲力等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，與放射聯(lián)合還有放射增敏作用[1]。

近來研究表明， 異羥肟酸有組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase ， HDAC）抑制劑活性， 可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長。異羥肟酸被廣泛稱為低毒性HDAC抑制劑。Tambunan US[2]等研究提出了利用苯三唑?qū)Ξ惲u肟酸修改，獲得一個(gè)更好的抑制劑。本研究觀察異羥肟酸對宮頸癌Hela 和Siha 細(xì)胞株生長和細(xì)胞周期的影響及p53mRNA 和蛋白表達(dá)改變。

1.材料與方法

1.1 材料

異羥肟酸購自Sigma 公司，用PBS 稀釋成500mmol/L， 過濾分裝，貯藏于- 20℃。P53抗體購自Santa Cruz 公司，為鼠抗人單抗。RPMI-1640 （Gibco 公司）。TRIZOL 試劑購自Invitrogen 公司。新生牛血清（杭州四季青）。FACSort 流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickson 公司產(chǎn)品。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinV-FITC 凋亡和細(xì)胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson 公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

Hela 和Siha 細(xì)胞株由本科室保存。細(xì)胞在5% CO2、37℃條件下，用含10% 新生牛血清、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100U/ml）的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代。

1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測生長抑制率

取對數(shù)生長期宮頸癌細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為5×104/ 孔接種于96 孔板。37℃、5%CO2 飽和濕度培養(yǎng)24h 后， 分別加入不同濃度SAHA（0， 1.2， 2.4， 5.0 mM） 的培養(yǎng)基，每孔200μl，對照組不做處理。分別于加藥后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT 溶液（5mg/ml）20μl， 37℃避光培養(yǎng)4h。徹底吸去MTT 溶液，加入二甲基亞砜150μl/孔， 震蕩10min， 酶標(biāo)儀490nm激發(fā)波長檢測吸光度。計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率（%）=（1- 實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3 復(fù)孔， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

Hela 細(xì)胞和Siha 細(xì)胞分別用含（0， 1.2， 2.4， 5.0 mM） SAHA的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h 。胰酶消化成單細(xì)胞懸液， 1 000r/min 離心5min收集細(xì)胞， 加0.01mol/L PBS 洗滌離心2 次， 用4℃75% 乙醇固定過夜。1 000r/ min 離心5min ， 去掉乙醇固定液， PBS 洗滌2 次。加入PI 染液1ml（50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1% Triton-100）， 4℃孵育30min ， FCM檢測凋亡細(xì)胞率。

1.2.4 RT- PCR 檢測p53表達(dá)

分別收集用含（0， 1.2， 2.4， 5.0 m M） SAHA處理48h的細(xì)胞。用TRIZOL 提取細(xì)胞總mRNA， 參照說明書進(jìn)行。提取的mRNA 用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度（A260 /A280>1.8）。取2μg mR-NA 為模板， 應(yīng)用通用引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。P53 引物： 正義鏈5′-cctcttcggcccagtggac-3 ′， 反義鏈5′-ccgttttcgaccctgagag-3 ′，退火溫度60℃， 共28 個(gè)循環(huán)， 擴(kuò)增產(chǎn)物369bp ；β-actin 引物： 正義鏈5′-ggcatcgtgatggactccg-3 ′，反義鏈5′-gctggaaggtggacagcga-3 ′， 退火溫度62℃， 共28個(gè)循環(huán)， 擴(kuò)增產(chǎn)物594bp 。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃ 40 s， 56 ℃ 40 s， 72 ℃ 1min， 30 個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物5 μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（ 100 V， 30 min） 。凝膠成像系統(tǒng)成像， 經(jīng)薄層掃描求得每個(gè)待測產(chǎn)物與β-actin 產(chǎn)物光密度之比， 進(jìn)行半定量分析。 PCR 產(chǎn)物在1.5% 的瓊脂糖凝膠上電泳， 電泳結(jié)果用英國UVP 公司GDS8000 型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)處理。

1.6 Western blot 分析p53蛋白表達(dá)水平 分別收集0， 1.2， 2.4， 5.0 m M SAHA 處理72 h 的細(xì)胞， 提取蛋白質(zhì)， 采用Bradford 法定量蛋白質(zhì)，取50μg蛋白進(jìn)行SDS- PAGE 凝膠電泳。然后電轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。室溫下?lián)u動(dòng)封閉4h。TBS-T洗滌3 次， 加一抗（p53按1 ∶100 稀釋）在4 ℃下過夜。室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗小鼠IgG 抗體， 洗去未結(jié)合的二抗， 滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL 進(jìn)行發(fā)光顯影。TBS- T 洗滌3 次，再用二抗（1 ∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG）振蕩孵育2h 。采用化學(xué)發(fā)光法（ ECL）顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，用SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗(yàn)，單變量多組資料之間比較采用單因素方差分析， 以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 異羥肟酸抑制細(xì)胞生長

MTT 檢測結(jié)果顯示， 異羥肟酸顯著抑制Hela 和Siha 細(xì)胞生長，呈時(shí)間和濃度依賴性（ 見圖1A、1B ）。不同濃度（ 0～5 mmol /L）SAHA處理Hela 和Siha 細(xì)胞可抑制細(xì)胞生長， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ F=4.87， P<0.01）；SAHA處理不同時(shí)間（ 0 h～96 h） 可抑制細(xì)胞生長， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ F=3.78， P<0.01）。經(jīng)直線回歸方程計(jì)算，異羥肟酸作用48、72、96 h 時(shí)IC50 值分別為14.08、6.78、4.25 mmol /L。

2.2 異羥肟酸對細(xì)胞周期的抑制

異羥肟酸可顯著影響宮頸癌Hela 和Siha 細(xì)胞的周期分布，使Hela 和Siha 細(xì)胞G0/G1 期比例顯著增加（P =0.001）（ 見表1 ） 。異羥肟酸降低Hela 細(xì)胞S 期（ P=0.052 ） 和G2/M 期（ P =0.059 ） 比例， 但差異無顯著性。異羥肟酸降低Siha 細(xì)胞S 期（ P =0.004 ） 和G2/M 期（ P=0.007 ） 比例， 差異有顯著性。

2.3 異羥肟酸上調(diào)p53表達(dá)

RT- PCR 檢測顯示異羥肟酸上調(diào)Hela 和Siha細(xì)胞的p53mRNA 表達(dá) 。Westernblot 檢測提示異羥肟酸促進(jìn)Hela 和Siha 細(xì)胞的p53蛋白表達(dá)（ 見圖2） 。

3.討論

現(xiàn)有大量研究表明，癌癥的發(fā)生與表觀遺傳學(xué)有著密切的關(guān)系，主要包括組蛋白乙?；⒘姿峄?、泛素化及DNA甲基化等，其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Zhang Y[3]等在2004年發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙酰酶抑制劑能增強(qiáng)人鱗癌細(xì)胞放療的敏感性。為了進(jìn)行基因表達(dá)，細(xì)胞必須在組蛋白周圍調(diào)控DNA的螺旋和非螺旋，而這一過程需在組蛋白乙酰化酶的協(xié)助下方能完成，故HDAC抑制劑可引起組蛋白超乙?；瑥亩绊懠?xì)胞的基因表達(dá)。HDACs 不僅僅能夠催化組蛋白的去乙?；夷軌虼呋渌恍┲匾鞍祝?如Hsp90、Tubulin 等） 和轉(zhuǎn)錄因子（ p53、STAT1 等） 的乙?；? HDAC 在基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用[4]；其可與某些轉(zhuǎn)錄因子（ 如E2F、Stat3、p53、NF-_B、TFIIE 及Rb 蛋白） 發(fā)生相互作用，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[5]。

研究表明p53蛋白羧基端乙?；芤种埔阴；嚢彼崤c泛素酶的結(jié)合并由此引起的降解[6]， 而這種單泛素化降解能促進(jìn)p53蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)。因此p53羧基端乙?；煞€(wěn)定p53在核內(nèi)停滯并影響其在線粒體中的功能表達(dá)。同時(shí)，在正常情況下，乙?；痯53在細(xì)胞中的比例很低。反映出在體內(nèi)具有強(qiáng)去乙?；饔肹7-9]。早期研究顯示在多種腫瘤細(xì)胞中，p53羧基端乙?；癄顟B(tài)能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄凋亡前效應(yīng)[10-15]。

Xing J[16]等研究不同濃度SAHA 聯(lián)合順鉑（DDP）治療人類宮頸癌SiHa細(xì)胞，抑制和細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。SiHa細(xì)胞處理后20%的IC50SAHA24小時(shí)，經(jīng)歷了各種劑量的輻射處理。S發(fā)現(xiàn)AHA在化療時(shí)通過上調(diào)p21和Bax促進(jìn)SiHa信使rna和蛋白質(zhì)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0 / G1期。低劑量的SAHA在放療時(shí)通過Bax上調(diào)和Ku70下調(diào)促進(jìn)SiHa細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞修復(fù)。

本研究證實(shí)異羥肟酸抑制人宮頸癌Hela 和Siha細(xì)胞生長，可呈藥物依賴性地抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。阻滯于G0-G1期的細(xì)胞明顯增多， P53水平顯著上升。異羥肟酸使Hela 和Siha細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞比例顯著增加， 推測異羥肟酸主要通過影響細(xì)胞周期， 使細(xì)胞阻滯于G0/G1 期， 從而抑制宮頸癌細(xì)胞生長。我們觀察到， 異羥肟酸對Hela 細(xì)胞的生長抑制強(qiáng)于對Siha 細(xì)胞的生長抑制。這可能因?yàn)镠ela 細(xì)胞G0/G1 期比例明顯低于Siha細(xì)胞， Hela 細(xì)胞中有更多細(xì)胞處于S 期和G2/M 期， 推測異羥肟酸可能對增殖旺盛細(xì)胞的生長抑制作用更強(qiáng)。在宮頸癌細(xì)胞株中， HDAC抑制劑可經(jīng)P53 途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。HDAC抑制劑可增加P53的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)P53基因的表達(dá)，阻止P53蛋白被E6降解[18]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到異羥肟酸上調(diào)p53表達(dá)， 引起G0/G1 期阻滯， 可見細(xì)胞凋亡。

新型HDAC 抑制劑在小劑量、低氧濃度情況下可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、選擇性凋亡。HDAC 抑制劑作為一種新型的靶向抗癌藥，正成為藥物研究的新熱點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景廣泛。這類抑制劑可以靶向性地使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長停滯、分化、凋亡，對正常細(xì)胞無毒性，而且其抗腫瘤譜廣，實(shí)用性較強(qiáng)，臨床潛力巨大。

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