酶解銀杏蛋白制備α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究

張 燦

吳彩娥1

范龔健1

李婷婷1

王佳宏1

曹福亮2

(1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2. 南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

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酶解銀杏蛋白制備α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究

張 燦1

吳彩娥1

范龔健1

李婷婷1

王佳宏1

曹福亮2

(1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2. 南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

為了獲得銀杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，利用木瓜蛋白酶酶解銀杏蛋白，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，考察底物濃度、酶底比、pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，并且利用超濾截留不同分子量(100，50，30，10，3 kDa)的多肽。結(jié)果表明：在pH 7.36，酶解時(shí)間4.4 h，酶底比(5 g/100 g)，酶解溫度57.9 ℃的條件下，α-葡萄糖苷酶抑制率最高為17.18%。分子量小于3 kDa多肽組分的α-葡萄糖苷酶抑制率最高為50.43%。因此，銀杏蛋白水解產(chǎn)物或其活性肽可應(yīng)用在食品中用于高血糖及相關(guān)疾病的治療。

銀杏；α-葡萄糖苷酶；酶解；活性多肽

銀杏(Ginkgobiloba)為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，被稱為“活化石”“植物界的大熊貓”，在中國(guó)的分布極廣。銀杏種仁又稱為白果，可以食用，具有止咳、化痰、潤(rùn)肺平喘的作用[1]。銀杏種子營(yíng)養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量(干基含量)約為10%，氨基酸組成合理，因此它屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。已經(jīng)報(bào)道了銀杏蛋白具有抗氧化劑[2-3]和抗菌[4-5]的功能。

蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)蘊(yùn)含著很多功能活性多肽，經(jīng)過(guò)水解后功能集團(tuán)就會(huì)暴露出來(lái)，便顯出不同的活性，如調(diào)節(jié)神經(jīng)、激素和免疫肽化合物、抗高血壓、降低膽固醇、抗癌、抗氧化等作用[6]。近年來(lái)，有許多文獻(xiàn)報(bào)道[7-10]從天然的動(dòng)植物以及機(jī)體分離到降血糖肽，并且研究了它的結(jié)構(gòu)和機(jī)制，其中一些已被用作抗糖尿病藥物或保健食品。

目前，糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的三大慢性病之一。它是胰島素分泌不足所引起的代謝紊亂[11]，目前有效的治療方法是通過(guò)抑制碳水化合物水解酶的活性，如抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以延緩餐后對(duì)葡萄糖的吸收[12-14]。據(jù)報(bào)道[15]，從蛋清中已經(jīng)分離得到α-葡萄糖苷酶抑制肽，可以發(fā)展為口服抗糖尿病藥物以控制高血糖癥2型糖尿病，且沒(méi)有副作用。最近，從蠶蛹[16]、雞蛋[15,17]、滿天星[18]、五味子[19]、牛[20]和益生菌[21]也得到了α-葡萄糖苷酶抑制肽。有關(guān)銀杏蛋白的研究多集中在抗氧化肽[22]和抑菌肽[23]，銀杏蛋白制備α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究卻沒(méi)有報(bào)道。本研究擬利用木瓜蛋白酶制備α-葡萄糖苷酶抑制肽，通過(guò)超濾純化，并驗(yàn)證其降血糖的功能，旨在為銀杏資源的深加工和銀杏多肽的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

白果：產(chǎn)于江蘇泰興；

α-葡萄糖苷酶(100 U)：分析純，美國(guó)Sigma公司；

木瓜蛋白酶：分析純，瑞陽(yáng)生物工程有限公司；

堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶：分析純，奧多福尼生物工程有限公司；

對(duì)硝基-α-吡喃葡萄糖苷：分析純，北京索萊寶專業(yè)生化公司；

其它試劑國(guó)產(chǎn)分析純；

電熱恒溫振蕩水槽：DKZ-2型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；

大容量低速離心機(jī)：DD-5M型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-2802型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

pH計(jì)：PP-20-P1型，德國(guó)Sartorius公司；

冷凍干燥機(jī)：12L型，美國(guó)Labconco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

銀杏→預(yù)處理→堿溶酸沉→得沉淀→沉淀復(fù)溶→蛋白溶液→酶解→滅酶→離心→取上清→冷凍干燥→銀杏多肽

1.2.2 操作要點(diǎn)

(1) 預(yù)處理：將新鮮銀杏果去殼、去內(nèi)種皮、去芯，真空冷凍干燥后，將其磨粉并過(guò)80目篩。之后用石油醚脫脂，按1∶10(g/mL)混勻，置于4 ℃下處理72 h，隔1～2 h攪拌一次，每隔24 h更換一次石油醚。用蒸餾水浸泡清洗至溶液變?yōu)闊o(wú)色，以除去殘留的石油醚。真空冷凍干燥48 h，壓力降到100 Pa。

(2) 堿溶酸沉：按1∶20(g/mL)料液比將脫脂白果粉溶于純水中，超聲20 min，超聲功率為300 W，用1%的NaOH溶液調(diào)pH至10.0，45 ℃水浴50 min，3 000 r/min離心15 min，取上清，用0.01%的HCl調(diào)pH至蛋白等電點(diǎn)4.62(采用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳法測(cè)得其等電點(diǎn))，靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取沉淀，真空冷凍干燥48 h，得白果蛋白。

(3) 酶解：往蛋白溶液中加入蛋白酶水浴振蕩酶解，酶解后100 ℃滅酶10 min，然后在 3 000 r/min下離心15 min，取上清液。

1.2.3 酶活力的測(cè)定 按SB/T 23527—2009執(zhí)行。

1.2.4α-葡糖苷酶抑制率的測(cè)定 在梁凱[24]的方法基礎(chǔ)上做一定的修改，加448 μL磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)，再加入 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液 80 μL，45 μL樣品溶液(對(duì)照組用緩沖液代替)，混勻，然后 37 ℃恒溫 15 min，加入80 μL 2.5 mmol/L PNPG(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)，混勻后再 37 ℃恒溫反應(yīng) 15 min。最后加入 0.2 mol/L 的 Na2CO3溶液320 μL，再加入3 mL磷酸緩沖液，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(A)。α-葡糖苷酶抑制率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

I——α-葡糖苷酶抑制率，%；

AA——樣 A 的光密度值，樣 A 在反應(yīng)中不加抑制劑，用蒸餾水代替；

AB——樣 B 的光密度值，樣 B 在反應(yīng)中加抑制劑。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 蛋白酶的篩選 配制一定濃度的銀杏蛋白溶液，分別加入堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶，酶底比為5%，將其混合均勻，然后分別在各種酶的最適條件下(表1)水解4 h，以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標(biāo)，選擇最適蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的酶解試驗(yàn)。

表1 5種蛋白酶的說(shuō)明書(shū)反應(yīng)條件Table 1 The instruction reaction conditions offive enzymes

1.3.2 酶解制備活性多肽單因素試驗(yàn) 根據(jù)蛋白酶篩選的預(yù)試驗(yàn)，利用篩選出最適蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)，考察底物濃度、酶底比兩個(gè)因素對(duì)酶解效果的影響，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，并對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。

(1) 底物濃度對(duì)酶解效果的影響：固定酶底比為5%、pH值為7.0、溫度為60 ℃、酶解時(shí)間為4 h的條件下，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，考察底物濃度(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%)對(duì)酶解效果的影響。

(2) 酶底比對(duì)酶解效果的影響：固定底物濃度為1.5%、pH值為7.0、溫度為60 ℃、酶解時(shí)間為4 h的條件下，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，考察蛋白酶底比(1，3，5，7，9，11 g/100 g)對(duì)酶解效果的影響。

1.3.3 銀杏蛋白酶解工藝優(yōu)化 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間為考察因素，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。選取pH、酶解溫度和酶解時(shí)間作為試驗(yàn)因素，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)(表2)，分析各試驗(yàn)因素及交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels in response surface design

1.3.4 銀杏多肽的分離 參照文獻(xiàn)[25]，采用超濾離心管(100，50，30，10，3 kDa)進(jìn)行分離。共得到6個(gè)組分(>100，50～100，30～50，10～30，3～10，<3 kDa)，然后測(cè)定不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Design-Expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力的測(cè)定

圖1是以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線以測(cè)酶活。試驗(yàn)測(cè)得堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胃蛋白酶的酶活力分別為73 527.16，78 579.24，71 098.28，8 551.61，8 229.10 U/g。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 1 Standard curve of tyrosine

2.2 蛋白酶的篩選

由圖2可知，木瓜蛋白酶的抑制率最強(qiáng)，堿性蛋白酶其次，風(fēng)味蛋白酶效果最差。因此，以下試驗(yàn)選擇木瓜蛋白酶進(jìn)行。

2.3 底物濃度的確定

由圖3可知，在底物濃度為1.5%時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到最大。在0.5%～1.5%時(shí)，隨著底物濃度的增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率也逐漸增加，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛群枯^低時(shí)，在一定的時(shí)間內(nèi)只有一部分的酶可以與底物結(jié)合形成中間產(chǎn)物，但是隨著酶濃度增加，底物與酶結(jié)合的機(jī)會(huì)也增加，因此對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率變大；在1.5%～3.0%時(shí)，隨著底物濃度的增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸降低，因?yàn)楫?dāng)濃度很大時(shí)，反應(yīng)體系中的酶分子完全與底物結(jié)合生產(chǎn)中間產(chǎn)物，此時(shí)底物濃度雖然再增加但已經(jīng)沒(méi)有可以利用的酶與之結(jié)合，因此導(dǎo)致酶解產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率不再增加。

圖2 酶種類對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

Figure 2α-glucosidase inhibitory activities of enzymatic hydrolysates fromGinkgobyproduct protein

圖3 底物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Figure 3 Effect of substrate concentration on papain hydrolization

2.4 酶底比的確定

由圖4可知，隨著酶底比(E/S)的增加，α-葡萄糖苷酶抑制率先增加，這是由于E/S比例增加時(shí)更多的酶能夠與底物結(jié)合，α-葡萄糖苷酶抑制率明顯增加。當(dāng)E/S的比值超過(guò)5 g/100 g時(shí)，雖然酶的數(shù)量仍在增加，但底物已經(jīng)充分與酶結(jié)合，蛋白酶達(dá)到一定量時(shí)，大部分蛋白質(zhì)幾乎達(dá)到了水解平衡，所以α-葡萄糖苷酶抑制率不再隨著E/S增加而增加，其機(jī)理目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究，個(gè)人認(rèn)為酶解反應(yīng)是在液體環(huán)境中進(jìn)行的，當(dāng)酶的量越來(lái)越多時(shí)，會(huì)影響酶解反應(yīng)的環(huán)境，受此影響，α-葡萄糖苷酶抑制率會(huì)有所下降。因此，最佳酶底比為5 g/100 g。

圖4 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Figure 4 Effect of E/S ratio on papain hydrolization

2.5 酶解工藝條件優(yōu)化

2.5.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選pH、酶解溫度和酶解時(shí)間作為試驗(yàn)因素，以α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析 利用Design expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值Y對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)關(guān)鍵因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=16.74+1.56A-0.70B+1.10C+0.62AB-0.81AC+0.12BC-1.82A2-1.70B2-1.94C2。

(2)

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and results of response surface experiment

表4 α-葡萄糖苷酶抑制率回歸模型方差分析Table 4 Significance check of the regression equation

2.5.3 響應(yīng)面因素的效應(yīng)分析及優(yōu)化結(jié)果 由圖5可知，在選定的試驗(yàn)條件之內(nèi)，固定一個(gè)變量，α-葡萄糖苷酶抑制率的大小先隨著另一個(gè)變量的升高而增大，在達(dá)到最高值后會(huì)隨著另一個(gè)變量的升高而減小。規(guī)律符合預(yù)試驗(yàn)及方差分析結(jié)果。

圖5 AB及AC對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率交互影響 的響應(yīng)曲面圖

Figure 5 Response surface piotshowing the interactive effects ofpH and temperature, pH and time on α- glucosidase inhibitory rate

通過(guò)軟件分析：最適pH 值為7.36，酶解時(shí)間4.40 h，最適溫度57.9 ℃。在此條件下，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)取平均值，測(cè)得α-葡萄糖苷酶抑制率為 17.09%與預(yù)測(cè)值(17.18%)較接近，證明該模型的可行性和有效性。

2.6 超濾分離

采用超濾離心管對(duì)最佳工藝制備出的銀杏活性多肽進(jìn)行分離，得到6個(gè)組分，不同組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率見(jiàn)表5。

表5 不同多肽組分的α-葡萄糖苷酶抑制率

Table 5α-glucosidase inhibitory activities of each peptide fraction ofGinkgoprotein hydrolysates

多肽組分/kDaα-葡萄糖苷酶抑制率/% >100—50～100—30～502.39±0.0010～305.81±0.073～1043.59±0.52<350.43±0.63

? “—”表示無(wú)α-葡萄糖苷酶抑制率。

由表5可知，分子量<3 kDa組分的α-葡萄糖苷酶抑制率最高，為50.43%；低分子量肽具有更高α-葡萄糖苷酶抑制活性，可能是它們可以與α-葡萄糖苷酶作用的底物對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷競(jìng)爭(zhēng)性地抑制，從而降低了α-葡萄糖苷酶活性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳酶源是木瓜蛋白酶，酶解的最佳工藝為底物濃度1.5%，酶底比5 g/100 g，pH值7.36，酶解時(shí)間4.4 h，酶解溫度57.9 ℃。此條件下對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為 17.09%。同時(shí)經(jīng)過(guò)超濾得到不同分子量大小的組分，其中分子量<3 kDa的組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高為50.43%。

銀杏多肽具有抗氧化和抑菌的作用，但有關(guān)銀杏多肽的降血糖作用的報(bào)道幾乎沒(méi)有，本研究體外試驗(yàn)僅證實(shí)銀杏多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制率，但并不能說(shuō)明其具有體內(nèi)降血糖活性。研究其對(duì)動(dòng)物的血糖、膽固醇和甘油三酯等方面的影響需做進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)。

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Preparation ofα-glucosidase inhibitory peptides derived from Ginkgo biloba by enzymatic method

ZHANG Can1

WUCai-e1

FANGong-jian1

LITing-ting1

WANGJia-hong1宮 號(hào)1GONGHao1

CAOFu-liang2

(1.CollegeofLightIndustryScienceandEngineering,NanjingForestryUniversity,Nanjing,Jiangsu210037,China;2.CollegeofForestResourcesandEnvironment,NanjingForestryUniversity,Nanjing,Jiangsu210037,China)

The preparation ofα-glucosidase inhibitory peptides was gotten, which was derived from ginkgobilobaby enzymatic hydrolysis with papain. A factorial design experiment was conducted, while, the effects of concentration of substrate, pH, E/S ratio, extraction temperature and time were studied. And then, it was fractioned by using membrane ultrafiltration with molecular weight cutoffs of 100, 50, 30, 10 and 3 kDa. The results showed: with the concentration of substrate 1.5%, pH 7.36, E/S ratio of 5 g/100 g, temperature of 57.9 ℃ and extraction time of 4.4 h, the inhibitory activities ofα-glucosidase was the highest, and reached 17.18%. The inhibitory activities ofα-glucosidase, peptide fraction <3 kDa, exhibited the highest and reached 50.43%. Therefore, the ginkgo protein hydrolysate or its active peptides can be used in foods against hypertension and related diseases.Keywords：Ginkgobiloba; alpha-glucosidase; enzymatic hydrolysis; bioactive peptide

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2012BAD21B04) ；江蘇省科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(編號(hào)：BE2015315)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(編號(hào)：PAPD)

張燦，女，南京林業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

吳彩娥(1963—)，女，南京林業(yè)大學(xué)教授，博士。 E-mail：wucaie@njfu.edu.cn

2016—07—29

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.031