提取溶劑對青稞提取物總酚、黃酮含量及其抗氧化活性的影響

申迎賓

張友維2

黃才歡1

陳永生1

王 立3

歐仕益1

張 暉3

(1. 暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；3. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；4. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

?

提取溶劑對青稞提取物總酚、黃酮含量及其抗氧化活性的影響

申迎賓1

張友維2

黃才歡1

陳永生1

王 立3

歐仕益1

張 暉3

(1. 暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；3. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；4. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

以3種不同的青稞為原料，采用不同的提取溶劑(水、60%乙醇、60%甲醇、60%丙酮、95%乙醇、100%甲醇、100%丙酮)對青稞進(jìn)行提取。對各提取物的總酚、總黃酮進(jìn)行測定，同時采用3種抗氧化方法：二苯代苦味酰自由基(DPPH)、2，2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽自由基(ABTS)和總抗氧化能力(FARP)評價青稞提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，95%乙醇和60%丙酮更有利于青稞多酚的提取。藏青2000的各溶劑提取物的總酚、總黃酮及抗氧化活性普遍高于相應(yīng)溶劑的循化藍(lán)青稞和香格里拉綠青稞。藏青2000的60%丙酮提取物含有最高的總酚含量，達(dá)到211.92 mg GAE/100 g DW；在60%乙醇提取時具有最高的總黃酮含量，達(dá)到60.11 mg RT/100 g DW；在60%乙醇提取時具有最強(qiáng)的DPPH清除能力，達(dá)到80.08%；而用60%丙酮提取時，具有最強(qiáng)的ABTS清除能力和總抗氧化能力，分別達(dá)到了1.85，9.28 mmol TEAC/100 g DW?？偡雍颗c抗氧化活性均具有顯著的相關(guān)性，F(xiàn)RAP法與DPPH、ABTS法具有極顯著的相關(guān)性。綜上表明，青稞富含總酚成分，是一種潛在的天然抗氧化劑資源。

青稞；總酚；總黃酮；抗氧化；DPPH；ABTS；FRAP

流行病學(xué)研究[1-3]表明，全谷物與氧化應(yīng)激相關(guān)的慢性病有著密切關(guān)系，在一定程度上有助于緩和慢性病的發(fā)展。其機(jī)制可能與全谷物中的多酚類成分有關(guān)[4-5]，因此谷物的抗氧化活性開始被廣大學(xué)者重視。

隨著人們對全谷物的認(rèn)識和不斷的推廣，谷物多酚被認(rèn)為是全谷物發(fā)揮作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。青稞由于其生長在高海拔、高寒、缺氧、強(qiáng)光照的極端環(huán)境下，因此和其他谷物不同，是一種高蛋白、高纖維、低脂肪、低糖的谷物資源，這符合現(xiàn)代人“三高兩低”的飲食結(jié)構(gòu)。以往研究多偏向于青稞花色苷的研究[6-7]，而對青稞總多酚和黃酮的研究較少[8-9]，但是有關(guān)溶劑對其多酚含量的影響報(bào)道也較少[10]，Zhao等[10]研究比較了水、80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮4種提取溶劑對大麥多酚及抗氧化活性的影響，認(rèn)為80%丙酮適合大麥多酚成分的提取，但沒有考慮溶劑對總黃酮的影響。張海暉等[11]研究了70%乙醇、70%甲醇和70%丙酮對米糠、高粱、甜高粱、大麥、水稻、燕麥等谷物的多酚含量及抗氧化活性的影響，認(rèn)為70%乙醇更有利于多酚化合物的提取，但沒有研究高濃度的有機(jī)溶劑對多酚含量的影響，也沒有考察其對總黃酮含量的影響。因此，本試驗(yàn)選擇3種青稞為原料，較為系統(tǒng)的研究不同的提取溶劑對青稞總酚、總黃酮含量和抗氧化活性(DPPH、ABTS、FARP)的影響；分析青稞總酚、總黃銅與抗氧化活性的相關(guān)性及抗氧化方法間的相關(guān)性，為其功能產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏青2000：產(chǎn)地西藏日喀則，迪慶香格里拉青稞資源開發(fā)有限公司；

循化藍(lán)青稞、香格里拉綠青稞：彩云之南美食坊；

福林酚試劑：2 mol/L，上海荔達(dá)生物科技有限公司；

對二苯代苦味酰自由基(DPPH)、3-吡啶三吖嗪(TPTZ)、2，2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)和水溶性維生素E衍生物(Trolox)：分析純，美國Sigma 公司；

沒食子酸、蘆?。杭兌?99.98%，北京百靈威科技有限公司；

高速中藥粉碎機(jī)：DFY-500型，浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHZ-B型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZX-QF101-3S型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

可見分光光度計(jì)：722N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

精密電子天平：FA100，上海上平儀器公司；

離心機(jī)：L550型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程 青稞用粉碎機(jī)整粒磨碎，過60目篩，備用。準(zhǔn)確稱量1.0 g各青稞粉末，用25 mL相應(yīng)提取溶劑在60 ℃下，震蕩提取2 h， 重復(fù)2次，旋轉(zhuǎn)濃縮，采用60%乙醇定容25 mL，青稞提取物濃度為40 mg青稞谷物/mL，-20 ℃保存待測。

1.2.2 總酚含量的測定 采用福林酚法[12]。取0.5 mL青稞提取物樣品，加入0.5 mL福林酚試劑和2 mL 15%的碳酸鈉溶液，充分混合，定容至10 mL，然后混勻，室溫下反應(yīng)60 min，以不加碳酸鈉溶液的反應(yīng)液為空白，在特征吸收波長765 nm處測定吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程：Y=0.089 3X+0.129 5(R2=0.997 8)計(jì)算樣品總酚的相對含量。以mg GAE/100 g DW計(jì)算。

1.2.3 總黃酮的測定 根據(jù)NY/T 1295—2007標(biāo)準(zhǔn)，配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.000，0.025，0.050，0.100，0.150，0.200 mg/mL，取各標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，加入0.1 mol/L三氯化鋁(AlCl3·6H2O)2 mL，加入乙酸鉀1.5 mL， 加入相應(yīng)溶劑0.5 mL，室溫放置30 min，以試劑溶劑為參比溶液，在420 nm處測定吸光度。以吸光度和蘆丁濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定時，取樣品液1 mL，按照上述操作進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)線性方程Y=11.828X+0.045 1(R2=0.994 1)測定樣品中的總黃酮含量，表示為mg Rutin/100 g DW。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[13～14]并做一定修改。稱量一定質(zhì)量的DPPH，以乙醇為溶劑，制濃度為2 ×10-4mol /L 的DPPH溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用。在4 mL 2×10-4mol/L DPPH 溶液中加入0.5 mL青稞提取液樣品，搖勻，然后在室溫下放置30 min，在517 nm下測定其吸光值A(chǔ)i；同時測定4 mL 2×10-4mo1/L DPPH·溶于0.5 mL的60%乙醇混合液的吸光值A(chǔ)C；根據(jù)式(1)計(jì)算青稞樣品對DPPH的抑制率。

(1)

式中：

S——DPPH的抑制率，%；

Ai——加樣品時DPPH·溶液的吸光值；

AC——未加樣品時DPPH·溶液的吸光值。

1.2.5 ABTS自由基的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]并做一定修改，取4.9 mL ABTS+溶液與0.1 mL青稞提取液混合，反應(yīng)10 min，測定734 nm下吸光度，空白為0.1 mL 相應(yīng)提取溶劑。以Trolox為參照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性方程Y=0.815 1X+0.007 6(R2=0.998 5)，計(jì)算對ABST自由基的清除效果，計(jì)算結(jié)果以mmol TEAC/100 g DW表示。

1.2.6 總抗氧化能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[15]并做相應(yīng)修改：取4 mL的FRAP試劑與0.1 mL青稞提取物樣品，混勻，反應(yīng)10 min， 然后在593 nm下測吸光值。以不同濃度梯度的Trolox溶液為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總抗氧化能力用TEAC (水溶性維生素E抗氧化當(dāng)量，trolox equivalent antioxidant capacity)表示，空白0.1 mL相應(yīng)提取溶劑，得到吸光值(Y)與Trolox 含量(x)之間的回歸方程Y=0.672 6X+0.226 6(R2=0.995 9)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003和SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑對青稞提取物總酚含量的影響

研究[1, 16-17]表明，谷物中富含多酚成分，是一種潛在的天然抗氧化劑資源。溶劑對青稞提取物總酚含量的影響見表1。由表1可知，藏青2000和香格里拉綠青稞均在60%丙酮提取時，具有最高的總酚含量，分別達(dá)到了211.92，180.36 mg GAE/100 g DW，是其相應(yīng)水提取物的1.35，2.65倍。而循化藍(lán)青稞在95%乙醇提取時，總酚含量最高，達(dá)到了169.84 mg GAE/100 g DW，是其水提取物的1.69倍。除60%丙酮和95%乙醇外，在使用相同的提取溶劑時，藏青2000的總酚含量最高，循化藍(lán)青稞次之，而香格里拉綠青稞最低。綜上表明，在提取青稞總酚時，可以選擇60%的丙酮或者95%的乙醇作為提取溶劑。

表1 溶劑對青稞提取物總酚含量的影響

Table 1 Effect of different extraction solvents on total phenolic contents of highland barley

mg GAE/100 g DW

2.2 提取溶劑對青稞提取物總黃酮含量的影響

溶劑對青稞提取物總黃酮含量的影響見表2。由表2可知，藏青2000和循化藍(lán)青稞均在60%乙醇提取時，具有最高的總黃酮含量，分別達(dá)到了60.11，45.06 mg RT/100 g DW，是其相應(yīng)水提取物的1.36，1.28倍。而香格里拉綠青稞在60%的甲醇提取時具有最高的總黃酮含量，達(dá)到了52.99 mg RT/100 g DW，是其水提取物的1.39倍。在使用相同提取溶劑時，藏青2000的總黃酮含量均較循化藍(lán)青稞和香格里拉綠青稞高。綜上表明，在提取青稞總黃酮時，60%乙醇和60%甲醇可以作為提取溶劑。

2.3 DPPH自由基清除能力

溶劑對青稞提取物清除DPPH自由基能力的影響見表3。由表3可知，3種青稞均在60%乙醇提取時，DPPH清除能力達(dá)到最高，分別達(dá)到了80.08%，72.66%，50.32%，是其相應(yīng)水提取物的近13，57，22倍。同時，青稞的相同溶劑提取物(除水外)的DPPH自由基清除能力普遍是藏青2000最高，循化藍(lán)青稞次之，香格里拉綠青稞最低?？傮w來看，如果以DPPH清除能力為衡量指標(biāo)，則60%乙醇更適合作為青稞的提取溶劑。

表2 溶劑對青稞提取物總黃酮含量的影響

Table 2 Effect of different extraction solvents on total flavonoid contents of highland barley

mg RT/100 g DW

表3 溶劑對青稞提取物清除DPPH自由基能力的影響

Table 3 Effect of different extraction solvents on DPPH radical scavenging ability of highland barley

%

2.4 ABTS自由基清除能力

溶劑對青稞提取物清除ABTS自由基能力的影響見表4。由表4可知，3種青稞均在60%丙酮提取時，ABTS自由基清除能力達(dá)到最高，分別為1.85，1.71，1.55 mmol TEAC/100 g DW，分別為相應(yīng)水提取物的1.40，1.78，2.82倍。在使用相同提取溶劑提取時，藏青2000含量最高，循化藍(lán)青稞次之，香格里拉綠青稞最低(60%乙醇除外)。在相同提取溶劑時，藏青2000的ABTS自由基清除能力較其他兩種青稞強(qiáng)。這表明，如果以ABTS自由基清除能力為衡量指標(biāo)，則60%丙酮更適合作為青稞的提取溶劑。

2.5 總抗氧化能力

溶劑對青稞提取物總抗氧化能力的影響見表5。由表5可知，3種青稞均在60%丙酮提取時，總抗氧化能力達(dá)到最高，分別為9.28，7.91，3.86 mmol TEAC/100 g DW，分別為相應(yīng)水提取物的3.22，4.10，3.11倍。這說明60%丙酮有利于青稞高抗氧化活性物質(zhì)的提取。在采用相同提取溶劑時，藏青2000的總氧化能力均較其他兩種青稞強(qiáng)。

2.6 相關(guān)性分析

由表6可知，總酚與DPPH自由基清除率的相關(guān)系數(shù)為0.48，達(dá)到了顯著水平。與ABTS和FRAP兩種方法的相關(guān)系數(shù)為0.617和0.597，并達(dá)到了極顯著水平，這說明總酚與體外抗氧化活性密切相關(guān)，同時也表明存在其他成分對抗氧化活性的貢獻(xiàn)。青稞中的總黃酮與抗氧化活性沒有相關(guān)性。DPPH和FRAP相關(guān)性較高(0.611)，且達(dá)到了極顯著水平，ABTS與FRAP兩種方法的相關(guān)性較高(0.695)，也達(dá)到了極顯著水平，說明FRAP與DPPH、ABTS具有一定的同質(zhì)性，這表明，在評估青稞抗氧化活性的時候，可以選擇DPPH、ABTS兩種方法，F(xiàn)RAP則可以不列入選項(xiàng)，同時，為了更好的評估青稞的抗氧化活性，可以再采用不同機(jī)理的抗氧化評價方法，從不同側(cè)面來反應(yīng)青稞抗氧化活性的水平。

表4 溶劑對青稞提取物清除ABTS自由基能力的影響

Table 4 Effect of different extraction solvents on ABTS radical scavenging ability of highland barley

mmol TEAC/100 g DW

表5 溶劑對青稞提取物總抗氧化能力的影響

Table 5 Effect of different extraction solvents on total antioxidant activity of highland barley

mmol TEAC/100 g DW

表6 青稞總酚和總黃酮與抗氧化方法的相關(guān)性?

Table 6 Pearson’s Correlation among TPC，TFC and antioxidant methods

檢測指標(biāo)總酚總黃酮DPPHABTS總黃酮0.365DPPH0.480*0.345ABTS0.617**0.3170.412FARP0.597**0.0030.611**0.695**

? *代表顯著(P<0.05)，**代表極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

任何一種溶劑均不可能將谷物中的所有抗氧化成分提取出來，考慮到谷物中的主要抗氧化成分是多酚類化合物，在水、乙醇、甲醇和丙酮中溶解度較高。本試驗(yàn)選擇水、乙醇、甲醇、丙酮作為溶劑，重點(diǎn)考察中、高濃度溶劑對青稞總酚、總黃酮及抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，中濃度的有機(jī)溶劑更有利于總酚成分的溶出，且節(jié)約了成本。但本研究沒有考察多酚的具體成分，也沒有從生物吸收代謝角度考察多酚攝入后的抗氧化活性情況，將在后續(xù)研究中加以完善。同時，由于FRAP法與DPPH和ABTS法具有顯著的相關(guān)性，所以在以后的評價試驗(yàn)中可以簡化青稞體外抗氧化活性評價方法。

[1] LIU Rui-hai. Whole grain phytochemicals and health[J]. Journal of Cereal Science, 2007, 46(3): 207-219.

[2] KRISTENSEN M, TOUBRO S, JENSEN M G, et al. Whole grain compared with refined wheat decreases the percentage of body fat following a 12-week, energy-restricted dietary intervention in postmenopausal women[J]. Journal of Nutrition, 2012, 142(4): 710-716.

[3] BORNEO R, LEN A E. Whole grain cereals: functional components and health benefits[J]. Food & Function, 2012, 3(2): 110-119.

[4] MIN B, GU L, MCCLUNG A M, et al. Free and bound total phenolic concentrations, antioxidant capacities, and profiles of proanthocyanidins and anthocyanins in whole grain rice (Oryza sativa L.) of different bran colours[J]. Food Chemistry, 2012, 133(3): 715-722.

[5] LIU Rui-hai. Dietary bioactive compounds and their health implications[J]. Journal of Food Science, 2013, 78: A18-A25.

[6] BELLIDO G G, BETA T. Anthocyanin composition and oxygen radical scavenging capacity (ORAC) of milled and pearled purple, black, and common barley[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(3): 1 022-1 028.

[7] KOHYAMA N, ONO H, YANAGISAWA T. Changes in anthocyanins in the grains of purple waxy hull-less barley during seed maturation and after harvest[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(14): 5 770-5 774.

[8] GONG Ling-xiao, JIN Cheng, WU Li-jiang, et al. Tibetan hull-less barley (Hordeum vulgare L.) as a potential source of antioxidants[J]. Cereal Chemistry, 2012, 89(6): 290-295.

[9] KIM M J, HYUN J N, KIM J A, et al. Relationship between phenolic compounds, anthocyanins content and antioxidant activity in colored barley germplasm[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(12): 4 802-4 809.

[10] ZHAO Hai-feng, DONG Jiang-jun, LU Jian, et al. Effects of extraction solvent mixtures on antioxidant activity evaluation and their extraction capacity and selectivity for free phenolic compounds in barley (Hordeum vulgare L.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(19): 7 277-7 286.

[11] 張海暉, 段玉清, 倪燕, 等. 谷物中多酚類化合物提取方法及抗氧化效果研究[J]. 中國糧油學(xué)報(bào), 2008, 23(6): 107-111.

[12] SINGLETON V L, ROSSI J A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1965, 16: 144-158.[13] FERNANDEZOROZCO R, ROCA M, GANDULROJAS B, et al. DPPH-scavenging capacity of chloroplastic pigments and phenolic compounds of olive fruits (cv. Arbequina) during ripening[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2011, 24(6): 858-864.

[14] 謝思蕓, 鐘瑞敏, 肖仔君, 等. 楊梅果醋體外抗氧化活性的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(6): 125-128.

[15] ZHU Xun-tao, SCHAICH K, CHEN Xi, et al. Antioxidant Effects of sesamol released from polymeric films on lipid oxidation in linoleic acid and oat cereal[J]. Packaging Technology and Science, 2013, 26(1): 31-38.

[16] OKARTER N, LIU Chang-shu, MARK E S, et al. Phytochemical content and antioxidant activity of six diverse varieties of whole wheat[J]. Food Chemistry, 2010, 119(1): 249-257.

[17] WANG Li-feng, CHEN Jing-yi, XIE Hui-hui, et al. Phytochemical profiles and antioxidant activity of adlay varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(21): 5 103-5 113.

Effect of different solvents on total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant activity of highland barley

SHNE Ying-bin1

ZHANGYou-wei2

HUANGCai-huan1

CHENYong-sheng1

WANGLi3,4

OUShi-yi1

ZHANGHui3,4

(1.DepartmentofFoodScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China;2.JiangsuFood&PharmaceuticalScienceCoollege,Huai′an,Jiangsu223003,China;3.ChinaStateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;4.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The objectives of this study were to evaluate total phenolic, total flavonoid content and antioxidant activities of different extraction from three kinds of highland barley. The results showed that 95% ethanol and 60%acetone were better to extract phenolic compounds than other solvents. Total phenolic and total flavonoid contents, antioxidant activities of Zangqing 2000 using different solvents were higher than that of Xunhua and Shangri-la highland barley. Meanwhile, the highest total phenolic content of Zangqing 2000 was 211.92 mg GAE/100 g DW in 60% acetone, the highest total flavonoid content of Zangqing 2000 was 60.11 mg RT/100 g DW in 60% ethanol, the highest ABTS scavenging ability and total antioxidant activity of Zangqing 2000 were 1.85 and 9.28 mmol TEAC/100 g DW, respectively. Furthermore, there was a significant correlation between total phenolic content and antioxidant methods. FRAP method was significantly correlated to DPPH and ABTS methods. These results suggested that highland barley was rich in phenolic content and considered as a good natural antioxidant resource.

highland barley; total phenolic content; total flavonoid content; antioxidant activity; DPPH; ABTS; FRAP

中國博士后科學(xué)基金(編號：2016M602605)；廣東省自然科學(xué)基金(編號：32215105)；江蘇省自然科學(xué)基金(編號：BK20130410); “十二五”科技支撐計(jì)劃(編號：2012BAD37B08-3)；863計(jì)劃(編號：2013AA102203-7)；國家自然科學(xué)基金(編號：31471617)

申迎賓，男，暨南大學(xué)在讀博士后。

張暉(1967-)，女，江南大學(xué)教授。 E-mail: zhanghuigwzx@gmail.com

2015—08—31

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.030