微孔板法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的條件優(yōu)化

王紅月

陳 中1

簡(jiǎn)旭鳳2

(1. 華南理工大學(xué)食品工程與科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510640；2. 安利日用品公司，廣東 廣州 510730)

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微孔板法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的條件優(yōu)化

王紅月1

陳 中1

簡(jiǎn)旭鳳2

(1. 華南理工大學(xué)食品工程與科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510640；2. 安利日用品公司，廣東 廣州 510730)

研究以微孔板檢測(cè)法為基礎(chǔ)，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制能力進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到有效篩選適宜濃度的α-葡萄糖苷酶抑制劑用于制備降血糖類功能性食品的目的。試驗(yàn)針對(duì)酶濃度、檢測(cè)波長(zhǎng)、蔗糖底物濃度及酶反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。結(jié)果表明：試驗(yàn)中所用批次酶的最適濃度范圍為2.0～3.0 mg/mL；在405，450，492，520，630 nm 5種波長(zhǎng)條件下，520 nm和492 nm波長(zhǎng)檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)；蔗糖底物濃度的合適范圍應(yīng)為20～40 mmol/L；適宜的酶反應(yīng)時(shí)間范圍為20～30 min。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；血糖；微孔板法

糖尿病是一種終身慢性疾病，臨床上除了藥物治療手段外，飲食治療也是糖尿病的一種基本食療方法。近年來國(guó)內(nèi)外利用天然產(chǎn)物和膳食防治糖尿病及其并發(fā)癥已成為研究熱點(diǎn)[1]。天然α-葡萄糖苷酶抑制劑在糖尿病飲食療法中有重要作用，可用于功能性食品中，有效預(yù)防、控制糖尿病的產(chǎn)生與發(fā)展。開發(fā)含天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的降血糖功能性食品及降糖功能性食品配料具有廣泛的應(yīng)用前景。

α-葡萄糖苷酶主要分布于小腸刷狀緣膜上皮細(xì)胞，在代謝中是水解碳水化合物的關(guān)鍵酶，它能從低聚糖類底物的非還原端切開α-1,4-糖苷鍵，從而釋放出葡萄糖，葡萄糖再經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液，導(dǎo)致機(jī)體血糖水平的上升[2-3]。它參與了人體對(duì)碳水化合物的消化吸收、糖蛋白和糖脂的加工，與許多因代謝紊亂失調(diào)而引起的疾病(如糖尿病[4])、免疫反應(yīng)[5-6]、神經(jīng)細(xì)胞的分化[7]、腫瘤的轉(zhuǎn)移以及病毒和細(xì)菌的感染[8]有密切關(guān)系。

α-葡萄糖苷酶抑制劑能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制α-葡萄糖苷酶，在碳水化合物消化的最后一步抑制雙糖降解為單糖，從而延緩碳水化合物在腸道的消化，減緩來自雙糖、低聚糖及多糖水解產(chǎn)生的葡萄糖的吸收，可以有效推遲并減輕糖尿病人餐后血糖水平升高的時(shí)間及進(jìn)程[9-10]。

1966年在鏈霉素的代謝物中，首次發(fā)現(xiàn)了野尻霉素(nojirimycin)[11]，在后續(xù)的研究[12]中，又發(fā)現(xiàn)了由鏈霉菌、芽孢桿菌和枯草桿菌產(chǎn)生的1-脫氧野尻霉素(1-deoxyrijimycin，DNJ)，并在相關(guān)的研究[13]中顯示，DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶有強(qiáng)烈的抑制作用。DNJ是一種含氮生物堿，在桑屬植物中的含量較高[14]，其結(jié)構(gòu)與D-葡萄糖類似，兩者不同之處是：在六元環(huán)中，DNJ的氮原子取代了D-葡萄糖氧原子，由于它們結(jié)構(gòu)上的相似性，DNJ能夠和D-葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)與α-葡萄糖苷酶發(fā)生作用，是這類酶的強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[15]。

微孔板檢測(cè)技術(shù)由于方法簡(jiǎn)單，使用靈活且具有高通量性而在生物化學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。這種檢測(cè)方法能快速檢測(cè)大量樣品小樣本量的抑制劑的存在，可以加快α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選和研發(fā)步伐。學(xué)者在α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選模型方面進(jìn)行了大量的研究工作。其中酶-抑制劑篩選模型大多以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物，但由于PNPG為麥芽糖類似物，所以只能篩選到對(duì)麥芽糖酶有抑制作用的抑制劑，有一定的局限性[16]。本篩選模型以蔗糖為底物，也可將底物更換為淀粉或蔗糖，可以針對(duì)不同的底物進(jìn)行定向篩選。本研究擬以96孔微孔板檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，以DNJ為標(biāo)準(zhǔn)參考物，以蔗糖為水解底物，測(cè)定α-葡萄糖苷酶在抑制劑存在的情況下水解蔗糖所產(chǎn)生的葡萄糖量。加入與葡萄糖特異性結(jié)合的顯色試劑，通過酶標(biāo)儀測(cè)定96孔試驗(yàn)板中的在一定檢測(cè)波長(zhǎng)下的吸光度，算出葡萄糖的具體含量，從而計(jì)算出α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制能力。同時(shí)針對(duì)不同的酶濃度、檢測(cè)波長(zhǎng)、底物濃度、及酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行最佳反應(yīng)條件的摸索，這種方式可以應(yīng)用到不同底物的酶-底物篩選模型，為α-葡萄糖苷酶抑制劑的定向篩選提供更多種類的篩選形式。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

小鼠腸干粉(Rat Intestinal Acetone，RIA)：美國(guó)Sigma公司；

蔗糖：≥99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

葡萄糖分析試劑(Glucose Assay Reagent，GAR)：日本W(wǎng)ako公司；

DNJ標(biāo)準(zhǔn)粉末：美國(guó)Chromdex公司；

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸：分析純，廣州市化學(xué)試劑廠；

試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

分析天平：AB304S/FACT型，美國(guó)Mettler Toledo公司；

離心機(jī)：H-28型，日本Kokusan公司；

酶標(biāo)儀：MK3型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

恒溫培養(yǎng)箱：307型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；

真空烘箱：273800型，美國(guó)Hot Pack公司；

pH計(jì)：PH744型，瑞士Metrohm技術(shù)公司；

手動(dòng)單道移液槍：100-1000μL型，德國(guó)Eppendorf公司；

手動(dòng)單道移液槍：10-100μL型，德國(guó)Eppendorf公司；

8通道移液槍，Transferpette-8型，德國(guó)Eppendorf公司；

96孔微孔板(平底)，9018型，美國(guó)Corning公司

1.3 試劑配制

(1) Enzyme Assay Buffer(以下簡(jiǎn)稱Buffer)：pH 7.0。分別配制50 mmol磷酸二氫鉀溶液與50 mmol磷酸氫二鈉溶液。在1 L燒杯中混合600 mL磷酸氫二鈉(50 mmol)和300 mL磷酸二氫鉀(50 mmol)，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)pH至7.0(精確至0.02)。

(2) DNJ溶液：DEOXYNOJIRIMYCIN(SH)，8 mg/mL?？梢园?2 μL/離心管的體積分裝，于-20 ℃冰箱保存1年。

(3) Ymin溶液：40 μg/mL。

(4) 酶溶液(Enzyme Solution)：1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL，使用前配制。

(5) 蔗糖溶液(底物)：10，20，40，60，80，100 mmol/L，使用前配制。

(6) Glucose Assay Reagent (GAR)：Wako Chemicals USA.In.，根據(jù)Glucose Kit說明書制備顯色劑。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酶反應(yīng)濃度的確定 取一塊淺孔分析平板，按表1配制不同酶濃度的反應(yīng)體系，每孔加入20 mmol/L的蔗糖溶液60 μL，加入6種不同濃度(1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL)的酶溶液各30 μL，以30 μL H2O(即Ymax)和30 μL DNJ(40 μg/mL，即Ymin)作為樣品加入反應(yīng)體系，比較在沒有抑制劑下(Ymax)和在最大濃度抑制劑下(Ymin)酶反應(yīng)的差異。每個(gè)反應(yīng)組合做3個(gè)平行和3個(gè)不加酶的對(duì)照。加完所有試劑后，用膜封好微孔板，于37 ℃孵育25 min。去除封膜，用排槍吸120 μL的Glucose Assay Reagent 至所有的孔。用膜封好微孔板，37 ℃孵育5 min。在520 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。計(jì)算出每孔的ODnet(加酶反應(yīng)吸光度讀數(shù)減去無酶反應(yīng)的吸光度讀數(shù))，以O(shè)Dnet為縱坐標(biāo)，酶溶液終濃度為橫坐標(biāo)，分別作出不同酶濃度下的ODnet變化曲線，觀察酶濃度對(duì)抑制反應(yīng)的變化規(guī)律。

表1 不同酶濃度下的反應(yīng)體系Table 1 Reactionsystemin different enzyme concentration

1.4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 按表1配制的不同酶濃度的分析平板，分別在405，450，492，520，630 nm 5個(gè)波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。計(jì)算出每個(gè)反應(yīng)組合的Ymax ODnet均值和Ymin ODnet，以吸光度為縱坐標(biāo)，酶溶液終濃度為橫坐標(biāo)，分別作出不同檢測(cè)波長(zhǎng)下和不同酶濃度下的均值差變化曲線，觀察信號(hào)最強(qiáng)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4.3 底物濃度的確定 取一塊淺孔分析平板，按表1配制不同蔗糖底物濃度的反應(yīng)體系，分別加入60 μL不同稀釋倍數(shù)(10，20，40，60，80，100 mmol/L)的蔗糖底物溶液，1～6列分別加入3.0 mg/mL左右的酶溶液各30 μL，7～12列分別加入30 μL同體積水溶液。以30 μL H2O(即Ymax)和30 μL DNJ(40 μg/mL，即Ymin)作為樣品加入反應(yīng)體系，比較在沒有抑制劑下(Ymax)和在最大濃度抑制劑下(Ymin)不同蔗糖底物濃度的差異。每個(gè)反應(yīng)組合做3個(gè)平行和3個(gè)不加酶的對(duì)照。加完所有試劑后，用膜封好微孔板，于37 ℃孵育25 min。去除封膜，用排槍吸120 μL的Glucose Assay Reagent 至所有的孔。用膜封好微孔板，37 ℃孵育5 min。在520 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。計(jì)算出每孔的ODnet(加酶反應(yīng)吸光度讀數(shù)減去無酶反應(yīng)的吸光度讀數(shù))，以吸光度為縱坐標(biāo)，不同濃度蔗糖底物溶液為橫坐標(biāo)，分別作出不同酶濃度下的Ymax ODnet與Ymin ODnet的變化曲線，觀察酶濃度對(duì)抑制反應(yīng)的變化規(guī)律。

1.4.4 酶反應(yīng)時(shí)間的確定 取一塊淺孔分析平板，按表1配制不同時(shí)間的反應(yīng)體系。反應(yīng)時(shí)間分別為5，10，15，20，25，30 min，分別加入60 μL 20 mmol/L的蔗糖底物溶液，其中1～6列分別加入3.0 mg/mL左右的酶溶液各30 μL，7～12列分別加入30 μL同體積水溶液。以30 μL H2O(即Ymax)和30 μL DNJ(40 μg/mL，即Ymin)作為樣品加入反應(yīng)體系，比較在沒有抑制劑下(Ymax)和在最大濃度抑制劑下(Ymin)不同反應(yīng)時(shí)間的差異。每個(gè)反應(yīng)組合做3個(gè)平行和3個(gè)不加酶的對(duì)照。加完所有試劑后，用膜封好微孔板，于37 ℃孵育25 min。去除封膜，用排槍吸120 μL的Glucose Assay Reagent 至所有的孔。用膜封好微孔板，37 ℃孵育5 min。在520 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。計(jì)算出每孔的ODnet(加酶反應(yīng)吸光度讀數(shù)減去無酶反應(yīng)的吸光度讀數(shù))，以吸光度為縱坐標(biāo)，不同時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別作出不同反應(yīng)時(shí)間下的Ymax ODnet與Ymin ODnet變化曲線，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)抑制反應(yīng)的變化規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳酶濃度

由圖1可知，在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，Ymax ODnet和Ymin ODnet均隨著酶濃度的降低而降低。其中，酶濃度達(dá)到2.0～3.0 mg/mL時(shí)的吸光度最能滿足微孔板法對(duì)酶活性的要求(Ymax ODnet為0.190～0.280。Ymax ODnet低于0.190時(shí)，微孔板顯色整體較弱，酶解反應(yīng)抑制曲線梯度不明顯；高于0.280時(shí)，微孔板整體顯色過強(qiáng)，酶解反應(yīng)抑制曲線梯度同樣不明顯)，所以在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，酶濃度合適范圍應(yīng)為2.0～3.0 mg/mL。

圖1 不同酶濃度下Ymax ODnet均值與Ymin ODnet 均值的變化曲線Figure 1 Curve of Ymax ODnet and Ymin ODnet in different enzyme concentration system

2.2 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)

由圖2可知，在405，450，492，520，630 nm 5種檢測(cè)波長(zhǎng)下，檢測(cè)吸光度。520 nm和492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)，兩者強(qiáng)度相當(dāng)，且檢測(cè)強(qiáng)度均隨著酶濃度的降低而降低。

2.3 最佳底物濃度

由圖3可知，在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，Ymax ODnet和Ymin ODnet均隨著蔗糖底物濃度的升高而升高。其中，蔗糖底物濃度達(dá)到20～40 mmol/L時(shí)的吸光度最能滿足微孔板法對(duì)酶活性的要求(Ymax ODnet為0.190～0.280。當(dāng)Ymax ODnet低于0.190時(shí)，微孔板顯色整體較弱，酶解反應(yīng)抑制曲線梯度不明顯；高于0.280時(shí)，微孔板整體顯色過強(qiáng)，酶解反應(yīng)抑制曲線梯度同樣不明顯)，所以在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，蔗糖底物濃度合適范圍應(yīng)為20～40 mmol/L。

圖2 不同波長(zhǎng)與酶濃度下Ymax ODnet均值與 Ymin ODnet均值差的變化曲線Figure 2 The difference value curves in different wavelengths and enzyme concentration

圖3 不同蔗糖底物濃度下Ymax ODnet與Ymin ODnet 的變化曲線

Figure 3 The curve of Ymax ODnet and Ymin ODnet in different substrate concentration system

2.4 最佳酶反應(yīng)時(shí)間

由圖4可知，在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，Ymax ODnet和Ymin ODnet均隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而升高。其中，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到20～30 min時(shí)吸光度最能滿足微孔板法對(duì)酶活性的要求(Ymax ODnet為0.190～0.280)，所以在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，反應(yīng)時(shí)間的合適范圍應(yīng)為20～30 min。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間下Ymax ODnet與Ymin ODnet 的變化曲線

Figure 4 The curve of Ymax ODnet and Ymin ODnet in different reaction time system

3 結(jié)論

本研究以96孔微孔板檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，以DNJ為標(biāo)準(zhǔn)參考物，蔗糖為水解底物，測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制能力。研究影響抑制反應(yīng)關(guān)鍵的4個(gè)因素——酶濃度、檢測(cè)波長(zhǎng)、底物濃度、及反應(yīng)時(shí)間的影響，得到更穩(wěn)定的α-葡萄糖苷酶抑制劑檢測(cè)方案：在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，最佳的酶反應(yīng)濃度為2.0～3.0 mg/mL；在405，450，492，520，630 nm 5種檢測(cè)波長(zhǎng)下，520 nm和492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)；在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，蔗糖底物濃度合適范圍為20～40 mmol/L；在520 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，酶反應(yīng)的最佳時(shí)間應(yīng)為20～30 min。不過，該試驗(yàn)以是以體外檢測(cè)為主，而α-葡萄糖苷酶抑制劑在體內(nèi)的吸收及發(fā)揮抑制作用的情況有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of a microplate bioassay method of filtering alpha-glucosidase inhibitors

WANG Hong-yue1

CHENZhong1

JIANXu-feng2

(1.SchoolofFoodScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510640,China; 2.AmwayChinaCo.Ltd,Guangzhou,Guangdong510730,China)

The half inhibitory concentration (IC50) of alpha glucosidase inhibitors was detected based on a microplate assay method in this study in order to find the effective inhibitors for preparing hypoglycemic functional food. The reaction conditions were optimized by the four aspects, i.e., the enzyme concentration, the detection wavelength, the substrate concentration and the reaction time. The results showed that the optimum enzyme concentration ranged from 2.0 mg/mL to 3.0 mg/mL, and waves 520 nm and 492 nm were optimum among the five waves, 405, 450, 492, 520, 630 nm. Moreover, the suitable substrate concentration of sucrose ranged from 20 mmol/L to 40 mmol/L, and the appropriate reaction time was about 20～30 min.

alpha glucosidase inhibitors; blood glucose; microplate bioassay

王紅月(1984—)，女，安利中國(guó)日用品有限公司工程師，碩士。E-mail: why-1648@163.com

2016-07-25

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.003