微血管模式、密度及影像學參數對涎腺腺樣囊性癌預后的關系

王 蕊 李立恒 謝麗娟 胥愛文 王鐘華

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微血管模式、密度及影像學參數對涎腺腺樣囊性癌預后的關系

王 蕊 李立恒 謝麗娟 胥愛文 王鐘華

目的 探討微血管模式、密度以及影像學參數與涎腺腺樣囊性癌預后的相關性。方法收集涎腺腺樣囊性癌患者148例，免疫組化染色方法檢測血管內皮細胞CD31、CD105單克隆抗體表達及檢測涎腺腫瘤組織的微血管密度(MVD)，比較CT灌注參數、微血管密度(MVD)參數在良惡性腫瘤之間的差異及相關性。結果CD31在惡性腫瘤組中的表達明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CD105在惡性腫瘤組中的表達明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；惡性腫瘤組灌注參數BF、BV、PS值明顯高于良性組，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而兩組的MTT參數比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；采用Spearman分析腫瘤各灌注各參數值與MVD的相關性，結果顯示BF、PS、BV、MTT與MVD之間呈正相關性。結論CT灌注參數可較準確地定量分析腫瘤血流灌注狀態(tài)，微血管密度(MVD)、CD105可特異性標記腫瘤新生血管內皮細胞，在涎腺腺樣囊性癌的預后的評價中發(fā)揮著有積極作用。

涎腺腺樣囊性癌；CT灌注參數；微血管密度(MVD)；CD34；CD105

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1432～1435)

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC) 是頜面部腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，極易發(fā)生局部浸潤和神經侵襲轉移，且其浸潤性極強，易侵入血管，造成血運轉移，預后不佳，但本病帶瘤生存時間相對較長[1-2]。腫瘤的生長有賴于血管的生成，作為量化血管形成程度的微血管密度是血管形成的效應標志，可反應腫瘤生物學惡性程度的重要參數。但是有關微血管模式與腫瘤進展以及脈管內癌栓、局部腫瘤浸潤等高危因素的以及預后的關系未見報道。目前影像學手段仍是診斷涎腺腺樣囊性癌的主要手段，對病變的性質、轉移等情況提供最直接的依據，CT灌注成像能夠反映組織血流動力學變化，從而可監(jiān)測腫瘤新生血管[3-5]。本研究收集術前CT灌注影像學檢查資料、預后資料和病理資料齊全的涎腺腺樣囊性癌標本組織蠟塊，通過觀察微血管模式、不同內皮標記物檢測微血管密度，探討涎腺腺樣囊性癌血供以及微血管新生及模式的演變規(guī)律，并且未腺樣囊性癌的預后評估研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2005年1月-2015年7月我院涎腺腺樣囊性癌患者148例，其中男性87例，女性61例，年齡39～74歲，平均年齡為(55.3±10.7)歲；均為單側腺體發(fā)病，其中左側發(fā)病的有77例，右側發(fā)病的有71例，發(fā)病部位位于舌下腺的有27例，位于腮腺的有101例，其余20例位于頜下腺。臨床分期及病理類型參照國際WHO的診斷標準[4]進行分析判斷，其中Ⅰ期40例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例，Ⅳ期34例；篩孔狀51例、管狀型50例、實體型47例。隨機將148例患者分為對照組和實驗組，每組74例。

1.2 治療情況

本研究均為來院的初診病例，均在我院完成手術治療，其中單純手術治療的有85例，輔助放療等治療手段的有63例，舌下腺27例中有12例行口底的微波治療，10例行上半頸部清掃，5例行頜下清掃加下頜骨切除術；位于腮腺101例中行腮腺淺葉切除的有38例，行全葉切除的有32例，行殘葉切除的有21例，行腮腺癌聯(lián)合根除術的有6例，行擴大切除術的有4例；20例位于頜下腺的患者中行頜下三角清掃術的有8例，行聯(lián)合根治術的有8例，行上半頸清掃術的有2例，行頜下三角清掃家頜骨切除的有2例；輔助放療治療的63例患者均采用面頸部聯(lián)合的對穿野照射，其中有24例輔加根治性的同側頸部照射，15例輔加預防性的同側頸部照射。區(qū)域淋巴結的放療劑量為50～70 Gy，原發(fā)灶的放療劑量為30～70 Gy。隨訪中發(fā)生復發(fā)的68例中行手術治療的有32例，其中15例追加了放療。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測CD31、CD105表達情況 石蠟切片脫蠟至水→3%甲醇-H2O2室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶的活性→蒸餾水沖洗，10 ml PBS洗5分鐘→抗原修復后，10 ml PBS洗3次，每次5 min→滴加10%正常山羊血清封閉游離的結合位點，減少非特異性染色→滴加一抗4 ℃冰箱過夜→0.01 M PBS洗3次，每次5 min→滴加生物素標記的二抗IgG，37 ℃孵育30 min→0.01 M PBS洗3次，每次2 min→滴加辣根酶HRP標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS洗3次，每次5 min→DAB顯色劑顯色5 min，自來水終止顯色→復染→酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2 CT灌注檢測流程 先行常規(guī)CT平掃，確定腫瘤中心部位，選取感興趣區(qū)，使用高壓注射器經肘靜脈快速推注對比劑碘克沙醇(300 mg/ml)，流率4 ml/s，總劑量50 ml，延遲時間5～15 s，掃描時間50 s，然后以病灶最大層面為中心，行灌注掃描，層厚5 mm×8層，50次連續(xù)同層動態(tài)掃描，將數據傳輸至GE AW4.22工作站，應用GE Perfusion 3灌注軟件分析，得到一系列CT灌注參考值BF、BV、PS及MTT。

1.3.3 對病例干預手段及措施 資深病理專家對切片復核確認，利用相應的存檔組織蠟塊進行CD31、CD105免疫組化染色，標記微血管密度，記錄觀察微血管的生長模式；同時對患者術前行64排螺旋CT灌注掃描，先行常規(guī)CT平掃，確定腫瘤中心部位，選取感興趣區(qū)，使用高壓注射器經肘靜脈快速推注對比劑碘克沙醇(300 mg/ml)，流率4 ml/s，總劑量50 ml，延遲時間5～15 s，掃描時間50 s，然后以病灶最大層面為中心，行灌注掃描，層厚5 mm×8層，50次連續(xù)同層動態(tài)掃描，將數據傳輸至GE AW 4.22工作站，應用GE Perfusion 3灌注軟件分析，得到一系列CT灌注參數：血容量(BV)、血流量(BF)、對比劑平均通過時間(MTT)、表明通透性(PS)以及強化峰(PH)。

1.3.4 資料收集 征得所有患者及其家屬的同意，簽署知情同意書，選擇合適的手術方式，并記錄術后過程。記錄不同標記的微血管密度，收集CT影像微血管參數，同時對每位患者的治療方式等臨床資料進行收集，查閱出院后隨訪資料卡，定期記錄患者隨訪及復查情況。

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數據應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析，CT灌注參數與不同病理參數差異采用t檢驗；微血管模式與不同病理參數的差異采用多行卡方檢驗；CD105、CD31標記的微血管密度差異比較采用t檢驗；用Spearman分析腺樣囊性癌CT灌注參數BF、BV、PS及MTT值與MVD的相關性，計算等級相關系數rs;對所有影響預后的因素采用COX風險比例模型進行單因素和單因素分析，并繪制生存曲線，以P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD31在涎腺腫瘤中的表達

CD34在惡性腫瘤組中的表達水平明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 CD34在涎腺腫瘤中的表達情況(±s)

表1 CD34在涎腺腫瘤中的表達情況(±s)

組別例數MVD(個/100倍視野)t值P值惡性腫瘤組7224．8±10．31．2360．243良性腫瘤組7630．6±11．1

2.2 CD105在涎腺腫瘤中的表達

CD105在惡性腫瘤組中的表達水平明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 CD105在涎腺腫瘤中的表達(±s)

表2 CD105在涎腺腫瘤中的表達(±s)

組別例數MVDt值P值惡性腫瘤組7216．8±8．21．3650．184良性腫瘤組7621．6±8．4

2.3 良性腫瘤組與惡性腫瘤組灌注參數結果的比較

惡性腫瘤組灌注參數BF、BV、PS值明顯高于良性組，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而兩組的MTT參數比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 良性腫瘤組與惡性腫瘤組灌注參數結果的比較(±s)

表3 良性腫瘤組與惡性腫瘤組灌注參數結果的比較(±s)

灌注參數惡性腫瘤組良性腫瘤組t值P值BF(ml·100g-1·min-1)211．3±19．7144．0±27．28．2150．000BV(ml·100g-1)28．1±5．916．3±5．56．9450．000MTT/s12．8±1．312．0±6．30．0970．975PS(ml·100g-1·min-1)30．6±5．125．1±4．82．9640．001

2.4 灌注各參數與以CD34、CD105標記的MVD比較

采用Spearman分析腫瘤各灌注各參數值與MVD的相關性，結果顯示BF、PS、BV、MTT與MVD之間呈正相關性，結果見表4。

表4 灌注各參數與以CD31、CD105標記的MVD比較

3 討論

腺樣囊性癌是頜面部腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，5年生存率約為20%。極易發(fā)生局部浸潤和神經侵襲轉移[6]。腫瘤微血管新生是其浸潤和遠處轉移的前提條件[7]。近幾年涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病率有逐年增高的趨勢，雖然隨著治療手段的進步，患者的生存率有所提高，但轉移和復發(fā)仍然是其死亡的主要原因[8]。近年來國內外學者對涎腺腺樣囊性癌的研究主要集中在病因學中遺傳基因的研究、早期診斷方法的研究、手術方法改進的研究、放射、化學治療的研究等方面，且取得了一定進展，但涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病率及死亡率無明顯下降，說明上述研究的深度不夠，一些研究結果尚未用于臨床[9-11]。由于涎腺腺樣囊性癌是常見的惡性腫瘤，目前仍是威脅人類生命的主要疾病。因此，進一步研究和尋找有關涎腺腺樣囊性癌轉移和復發(fā)的早期生物標記物和敏感特異的診斷手段，是涎腺腺樣囊性癌有效治療、改善預后，提高生存率的關鍵所在。由于涎腺腺樣囊性癌是常見的惡性腫瘤，目前仍是威脅人類生命的主要疾病，研究涎腺腺樣囊性癌的病因，做好涎腺腺樣囊性癌發(fā)病的預防，減少其發(fā)病率，仍是今后研究的主要方向[12]。

傳統(tǒng)的診療方法已經難以滿足廣大患者日益增長的健康需求。目前，腫瘤的抗血管生成治療的作用受到越來越多的關注，但是有關腫瘤微血管模式的研究少見報道；因為腫瘤微血管分布無規(guī)律，多數計數密度，但是僅以密度代替微血管特性很不完善，需要對影像資料、病理資料和手術大體所見、預后隨訪進行綜合研究，但未見類似相關報道，而對此研究意義重大，它不僅可以術前評估腫瘤的性質、為手術治療提供參考，而且對腫瘤進展和預后評估提供參考[13]。本研究收集術前CT灌注影像學檢查資料、預后資料和病理資料齊全的涎腺腺樣囊性癌標本組織蠟塊，通過觀察微血管模式、不同內皮標記物檢測微血管密度，探討涎腺腺樣囊性癌血供以及微血管新生及模式的演變規(guī)律，并且未腺樣囊性癌的預后評估研究提供理論基礎。

CD105在血管生成中是必需的因子，其功能與TGF及其受體具有密切的相關性，可作為血管形成過程中的促進劑或拮抗劑，在體內能促進內皮細胞增生以及間質細胞的代謝，從而促進血管形成，研究發(fā)現(xiàn)CD105與多種惡性腫瘤的預后具有相關性并在腫瘤早期診斷中發(fā)揮著重要作用；CD31是在動脈粥樣硬化組織血管內皮細胞中高表達的因子之一，該因子有選擇性的定位于腫瘤組織內，其密度較高。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)CD105可能是一種比CD31更好的新生血管標志物，能更準確地反映內皮細胞的增殖狀態(tài)[14-15]。本組研究發(fā)現(xiàn)CD31、CD105在惡性腫瘤組中的表達明顯高于良性腫瘤組，但兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，尚有待與進一步大樣本分類研究。因此提示微血管密度單一指標并不能完全代表涎腺腫瘤的血管生成，需要更多的實驗手段來檢測微血管形態(tài)學改變以及微血管新生的形式表達的差異性。研究發(fā)現(xiàn)64排CT在反映腫瘤血管生成方面具有較強的優(yōu)勢，可提高了診斷的準確性，CT灌注掃描能更好的反映局部組織血流動力學情況。本研究結果顯示，惡性腫瘤組灌注參數BF、BV、PS值明顯高于良性組，差異比較具有統(tǒng)計學意義，而兩組的MTT參數比較差異不具有統(tǒng)計學意義，可能死亡原因是血液粘滯度增加、腫瘤新生血管的管腔不規(guī)則，從而導致血管阻力增加，所以惡性腫瘤相對于良性腫瘤具有高血流量、高血容量的表現(xiàn)。MVD標記與CT灌注參數的相關性結果顯示，BF、PS、BV、MTT與MVD之間呈正相關，單位體積內微血管數量越多血流量越大，本研究的原因考慮與涎腺腫瘤誘發(fā)的新生血管排列紊亂、結構異常、基膜不完整有關，通透性高同時存在動靜脈短路的現(xiàn)象均可導致血流分布不均。

綜上所述，標記涎腺腫瘤微血管密度有待擴大樣本量、分類細化研究，CT灌注成像對于涎腺腫瘤的診斷及病變的確定有一定的價值，CT灌注成像可以反映病變內部血管生成情況，涎腺良惡性腫瘤的CT灌注各項參數之間存在顯著性差異，MVD與灌注參數呈正相關性，微血管模式的研究不僅可以為腫瘤的治療提供參考，而且通過預后流行病資料以及臨床影像資料的研究可以科學評估預后以及篩選獨立的預后影響因素，對規(guī)范治療涎腺腺樣囊性癌和科學評估意義重大。

[1] 黃 艷,農曉琳.腺樣囊性癌相關基因的研究進展〔J〕.口腔醫(yī)學,2010,30(4):248-250.

[2] Chummun S,McLean NR,Kelly CG,et al.Adenoid cystic carcinoma of the head and neck〔J〕.Br J Plastic Surg,2011,54(6):476-480.

[3] Perez DE,Alves FA,Nishimoto IN,et al.Prognostic factors in head and neck adenoid cystic carcinoma〔J〕.Oral oncol,2012,42(2):139-146.

[4] Rhee CS,Won TB,Lee CH,et al.Adenoid cystic carcinoma of the sinonasal tract:treatment results〔J〕.Laryngoscope,2012,116(6):982-986.

[5] Szanto PA,Luna MA,Tortoledo E,et al.Histologic grading of adenoid cystic carcinoma of these salivary gland〔J〕.Cancer,2011,54(6):1062-1069.

[6] 閆 冰,李龍江.涎腺腺樣囊性癌的治療進展〔J〕.國際口腔醫(yī)學雜志,2009,36(1):41-45.

[7] Norberg-Spaak L,Dardick I,Ledin T.Adenoid cystic carcinoma:use of cell proliferation,bcl-2,expression,histologic grade,and clinical stage as predictors of clinical outcome〔J〕.Head Neck,2010,22(5):489-497.

[8] Mendenhall WM,Morris CG,Amdur RJ,et al.Radiotherapy alone or combined with surgery for adenoid cystic carcinoma of the head and neck〔J〕.Head Neck,2004,26(2):154-162.

[9] 鄭 剛,郭傳瑸,俞光巖,等.腺樣囊性癌患者生存預測模型的建立〔J〕.中華口腔醫(yī)學雜志,2006,41(6):350-353.

[10] 劉文勝,唐平章,祁永發(fā),等.腭部腺樣囊性癌的診治及預后因素的探討〔J〕.中華腫瘤雜志,2014,26(8):485-489.

[11] Sauvageau M,Sauvageau GPolycomb group proteins:mnlti-faceted regulators of somatic stem cells and cancer〔J〕.Cell Stem Cell，2010,7(3):299-313.

[12] Douglas JG,Laramore GE,Austin-Seymour M,et al.Treatment of locally advanced adenoid cystic carcinoma of the head and neck with neutron radiotherapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Phys,2010,46(3):551-557.

[13] Regine WF,Mendenhall WM,Parsons JT,et al.Radiotherapy for adenoid cystic carcinoma of the palate〔J〕.Head Neck,2013,15(3):241-244.

[14] Piunti A,Pasini D.Epigenetic factors in cancer developme- nt:polycomb group proteins〔J〕.Future 0ncol,2011,7(1):57-75.

[15] Min J,Zaslavsky A,Fedele G,et al.An oncogene-tumor su- ppressor cascade drives metastatic prostate cancer by coordinately activating Ras and nuclear factor kappaB〔J〕.Nat Med,2010,16(3):286-294.

(編輯：吳小紅)

Relationship between Microvessel Pattern,Density and Radiographic Parameters and Prognosis of Adenoid Cystic Carcinoma

WANGRui,LILiHeng,XIELijuan,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075000

Objective To investigate the correlation of microvascular pattern,density and imaging parameters and adenoid cystic carcinoma prognosis.Methods 148 patients with adenoid cystic carcinoma were selected,immunohistochemical staining method was used to detect vascular endothelial cells CD34,CD105 monoclonal antibody expression and salivary gland tumor microvessel density (MVD),differences of CT perfusion parameters,MVD parameter between benign and malignant tumors and their correlation were compared.Results The expression of CD34 in malignant group was significantly higher than that of benign group,but the difference was not statistically significant (P>0.05);CD105 expression in malignant group was significantly higher than that of benign group,but the difference was not statistically significant (P>0.05);malignant group perfusion parameters BF,BV,PS was significantly higher than those of benign group,the difference was statistically significant (P<0.05),while MTT parameter had no statistically significant difference(P>0.05);Spearman was used to analyze correlation between tumor perfusion parameter value and MVD,results showed a positive correlation between BF,PS,BV,MTT and MVD.Conclusion CT perfusion parameters can be more accurate quantitative analysis of the tumor blood perfusion,MVD,CD105 can be specifically labeled tumor vascular endothelial cells,it plays positive role in salivary prognostic evaluation.

Adenoid cystic carcinoma;CT perfusion parameters;Microvessel density (MVD);CD34;CD105

075000 河北北方學院附屬第一醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.09.014

R739.8

A

1001-5930(2016)09-1432-04

2015-10-08

2016-02-14)