熒光定量16SrRNA基因檢測(cè)診斷婦產(chǎn)科菌血癥的應(yīng)用價(jià)值

任明保,李 揚(yáng),趙金輝,劉 晶

熒光定量16SrRNA基因檢測(cè)診斷婦產(chǎn)科菌血癥的應(yīng)用價(jià)值

任明保1,李 揚(yáng)1,趙金輝2,劉 晶2

目的 評(píng)價(jià)熒光定量16SrRNA基因檢測(cè)診斷婦產(chǎn)科患者菌血癥的應(yīng)用價(jià)值。方法 2013-01至2014-12對(duì)100例疑為全身感染處于菌血癥狀態(tài)的住院分娩孕產(chǎn)婦進(jìn)行常規(guī)血液培養(yǎng)，同時(shí)行細(xì)菌16SrRNA基因檢測(cè)，包括DNA提取、設(shè)計(jì)引物和探針、PCR擴(kuò)增及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量檢測(cè)，以臨床診斷及血液培養(yǎng)陽(yáng)性菌血癥作為對(duì)照，計(jì)算診斷陽(yáng)性率、敏感性和特異性，數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 熒光定量PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌血癥陽(yáng)性的患者44例，陽(yáng)性率為44%，明顯高于血液培養(yǎng)的15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；以臨床診斷及血液培養(yǎng)陽(yáng)性菌血癥作為對(duì)照，熒光PCR的診斷敏感性為87.9%，特異性為90.6%。結(jié)論 熒光定量16SrRNA基因檢測(cè)的陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于血液培養(yǎng)，可為孕產(chǎn)婦患者感染提供早期、敏感的病原學(xué)診斷依據(jù)。

16SrRNA；孕產(chǎn)婦；菌血癥；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

感染是婦產(chǎn)科患者圍術(shù)期和圍分娩期常見(jiàn)的并發(fā)癥，病原菌侵入血液通過(guò)血行播散到體內(nèi)各部位可造成菌血癥，全身表現(xiàn)有發(fā)熱，寒戰(zhàn)，乏力等；局部表現(xiàn)有傷口紅腫，滲液，化膿等。如不及時(shí)治療可能會(huì)危及生命，因此要求早期快速準(zhǔn)確診斷菌血癥。目前用于檢測(cè)血液感染細(xì)菌的方法主要是進(jìn)行血液培養(yǎng)，但其缺點(diǎn)是所需時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、因一次采血量較大患者的依從性也差。我們對(duì)100例住院分娩疑似感染處于菌血癥狀態(tài)的患者,在進(jìn)行血液培養(yǎng)的同時(shí)應(yīng)用熒光定量 PCR方法(PCR)檢測(cè)細(xì)菌的16S rRNA基因，16SrRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，其集保守性與變異性于一身， 是目前應(yīng)用最廣泛的分子微生物學(xué)檢測(cè)的靶基因[1,2]，希望通過(guò)此項(xiàng)研究探索婦產(chǎn)科菌血癥患者的早期診斷方法和治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2013-01至2014-12疑似處于菌血癥感染狀態(tài)的患者100例。菌血癥診斷指南，分為臨床診斷血液感染和血液培養(yǎng)陽(yáng)性作為確診血液感染，臨床診斷血液感染依據(jù)2001年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》血液感染的臨床診斷[3]。

1.2 試劑與儀器 血液培養(yǎng)檢測(cè)采用美國(guó)BD公司9240全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀。熒光PCR檢測(cè)采用ABI7300熒光定量PCR分析儀， PCR引物和探針依據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因保守區(qū)域，均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室合成。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923，菌株均購(gòu)于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 無(wú)菌條件下，取待檢血液標(biāo)本50 μl，分別加到1.5 ml離心管中；加入DNA提取液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽pH 7.6，5 mmol/L乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基硫酸鈉)50 μl，振蕩充分混勻，37 ℃搖床搖勻30 min后置100 ℃干浴10 min, 12 000 r/min，離心5 min，取上清液備用。

1.3.2 引物與探針 選擇細(xì)菌16S rRNA基因高保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在該引物的片段范圍內(nèi)，通過(guò)MegAlign分析軟件分別設(shè)計(jì)針對(duì)所有細(xì)菌共有的通用探針，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌特異的革蘭陽(yáng)性探針，對(duì)革蘭陰性菌特異的革蘭陰性探針。引物序列：上游引物(P690F)： TGTGTAGCGGTGAAATGCG (690～708 bp)；下游引物(P829R)： CATCGTTTACGGCGTGGAC(829～811 bp)。

1.3.3 PCR 抽取上清液2 μl作為模板，在ABI 7300檢測(cè)儀按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng): 94 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)40次。每次PCR循環(huán)均設(shè)陽(yáng)性和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCCC25923；空白對(duì)照不加DNA模板。

1.3.4 結(jié)果報(bào)告 將baseline曲線start值設(shè)置為7～18，熒光值設(shè)置為4000，使correlation數(shù)值介于-1.0～-0.97，F(xiàn)AM通道為革蘭陽(yáng)性菌，VIC通道為革蘭陰性菌。PCR完畢計(jì)算CT 值 (Cycle Threshold)，以CT值<35判定為陽(yáng)性。

1.3.5 血液培養(yǎng) 采用臨床常規(guī)血液培養(yǎng)方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用絕對(duì)數(shù)和率的形式表達(dá)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 16S rRNA基因檢測(cè)結(jié)果 100份標(biāo)本中，基于16S rRNA基因的PCR方法的檢測(cè)陽(yáng)性44例，陽(yáng)性率為44%。

2.2 PCR方法與血液培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果的比較 100份標(biāo)本中，血培養(yǎng)陽(yáng)性16例，陽(yáng)性率為16%，遠(yuǎn)低于PCR的44%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

表1 婦產(chǎn)科菌血癥PCR方法與血液培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 PCR方法與臨床診斷指標(biāo)的結(jié)果比較 100例中，基于臨床診斷指標(biāo)的陽(yáng)性患者37例，陽(yáng)性率為37.0%，低于PCR的檢測(cè)陽(yáng)性率44%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

表2 婦產(chǎn)科菌血癥PCR方法與臨床診斷指標(biāo)的比較

2.4 診斷指標(biāo) 若以臨床診斷且血液培養(yǎng)陽(yáng)性作為菌血癥診斷作對(duì)照，PCR的診斷敏感性為87.9%，診斷特異性為90.6%。

3 討 論

臨床診斷婦產(chǎn)科菌血癥的感染缺乏特異性的指標(biāo)，血液培養(yǎng)雖然是菌血癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但其所需時(shí)間長(zhǎng)，在出現(xiàn)臨床癥狀后的數(shù)天才能發(fā)出報(bào)告，從而導(dǎo)致患者的依從性相對(duì)較差，而且，由于抗生素的廣泛使用，血培養(yǎng)的陽(yáng)性率也不高，因此不能滿足臨床上的要求，尤其對(duì)于臨床癥狀嚴(yán)重如高熱不退、合并其他系統(tǒng)癥狀可能存在復(fù)合感染的婦產(chǎn)科住院患者，甚至引起不必要的恐慌。目前臨床診斷菌血癥多依靠患者的臨床表現(xiàn)，2001年國(guó)內(nèi)衛(wèi)生部發(fā)布了《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》作為國(guó)內(nèi)醫(yī)院院內(nèi)感染臨床診斷的試行指南，其中血液感染部分對(duì)菌血癥的臨床診斷做出具體規(guī)定，包括發(fā)熱時(shí)體溫>38 ℃或低體溫<36 ℃，可伴有寒戰(zhàn)，同時(shí)合并有下列情況之一：(1)有入侵門戶或遷徙病灶；(2)有全身中毒癥狀而無(wú)明顯感染灶；(3)有皮疹或出血點(diǎn)、肝脾腫大、粒細(xì)胞核左移，且無(wú)其他原因可解釋；(4)收縮壓<90 mmHg或較原收縮壓下降超過(guò)40 mmHg。但是這些感染指標(biāo)均存在特異性不足的問(wèn)題，若做出病原學(xué)診斷須在臨床診斷基礎(chǔ)上，符合下述兩條之一才可做出：(1)血液培養(yǎng)分離出病原微生物；(2)血液中檢測(cè)到病原體的抗原物質(zhì)。因此婦產(chǎn)科臨床工作中對(duì)重癥感染的診斷常常面臨較大的壓力。

在檢索相關(guān)文獻(xiàn)后我們進(jìn)行此項(xiàng)研究，以國(guó)內(nèi)浙江大學(xué)兒童醫(yī)院專利試劑盒為模板，在細(xì)菌16S rRNA基因保守區(qū)內(nèi)所建立的PCR分子生物學(xué)方法可檢測(cè)所有細(xì)菌的16S rRNA基因片段[3，4]。本研究表明，該方法具有高度的特異性與敏感性，而且檢測(cè)快速，從采集標(biāo)本到PCR擴(kuò)增只需4～6 h即可完成，而通常血液培養(yǎng)至少需要3～5 d，從而顯著提高了工作效率。

本試驗(yàn)證明，若以臨床診斷且血液培養(yǎng)陽(yáng)性作為血液感染對(duì)照，PCR方法的診斷敏感性為87.9%,診斷特異性為90.6%，說(shuō)明基于16S rRNA基因的PCR方法是一種快速準(zhǔn)確具有潛力和價(jià)值的診斷方法。同時(shí)，通過(guò)分別合成革蘭陽(yáng)性探針和革蘭陰性探針，可以進(jìn)一步判斷血液感染的病原菌為革蘭陽(yáng)性球菌或革蘭陰性桿菌，從而為臨床醫(yī)師有針對(duì)性的選擇抗菌藥物抗感染治療提供幫助。

本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示, PCR方法的陽(yáng)性率為44%，遠(yuǎn)高于血液培養(yǎng)的陽(yáng)性率16%，亦高于臨床診斷指標(biāo)37.0%，說(shuō)明PCR方法能夠發(fā)現(xiàn)其他方法無(wú)法查到的細(xì)菌感染。PCR方法檢測(cè)假陰性的原因可能在于PCR體系中血紅蛋白等抑制物存在較多或抽提過(guò)程中細(xì)菌DNA的丟失而導(dǎo)致PCR方法假陰性[5，6]，此外，臨床診斷指標(biāo)特異性較低也可能影響最后的數(shù)據(jù)。

血液培養(yǎng)陰性及不符合臨床血液感染的患者，分析原因，可能由于：(1)存在某些特殊培養(yǎng)條件的細(xì)菌如L型細(xì)菌等或某些無(wú)法培養(yǎng)的細(xì)菌[7]；(2)臨床診斷指標(biāo)亦存在假陰性的可能；(3)在PCR方法操作過(guò)程中有發(fā)生污染的可能性[8]。

綜上所述，16S rRNA基因熒光定量PCR方法可為婦產(chǎn)科患者血液感染提供早期、敏感的病原學(xué)診斷依據(jù)，具有較大的臨床應(yīng)用前景。但是，由于本試驗(yàn)只涉及細(xì)菌引起的血液感染，對(duì)真菌、病毒、支原體屬、衣原體屬等其他病原體引起的血液感染尚不能提供診斷幫助。血培養(yǎng)依然是血液感染最為重要的金標(biāo)準(zhǔn)，熒光定量PCR方法不能替代傳統(tǒng)的血液培養(yǎng)方法，其對(duì)臨床診斷的幫助還需要進(jìn)一步的研究。

致謝：感謝首都兒科研究所分子研究室王建華教授對(duì)此項(xiàng)研究所給予的大力支持和幫助。

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(2016-07-20收稿 2016-09-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Applicability of PCR methods based on 16S rRNA genes to diagnosis of infections in gynecological and obstetric patients

REN Mingbao1, LI Yang1, ZHAO Jinhui2, and LIU Jing2.1.Department of Obstetrics One，2.Department of Clinical Laboratory，Beijing Obstetric and Gynecology Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100026, China

Objective To develop a PCR method based on 16S rRNA genes for the diagnosis of infections among gynecological and obstetric patients in order to improve the efficiency and accuracy of bacterial detection.Methods 100 patients suspected with blood infections had their blood cultured and bacterial 16S r RNA genes were detected synchronously by extraction of DNA, primer and probe design, PCR amplification and fluorescent quantitative detection of amplified products.The positive rate, sensitivity and specificity of the two methods were compared.Results The positive rate of PCR was 44% by PCR, which was significantly higher than 15% by blood culture. Withg the criteria of positive blood culture and/or clinical diagnosis of blood infection as control, the sensitivity was 87.9% and the specificity was 90.6% for PCR.Conclusions The positive rate of PCR was significantly higher than that of blood culture and can be used as an early and sensitive index in pathogenic diagnosis of blood infections among gynecological and obstetric patients.

16S rRNA; para and grevia; blood infection; PCR

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院科研基金(201016)

任明保，博士，副主任醫(yī)師。

100026，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院：1.產(chǎn)一科,2.檢驗(yàn)科

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