低溫序批式生物反應(yīng)器中Comanonas testosteroni QYY降解水中喹啉的研究

陳 瑜，賈 濤，王天竹，王洪寧，4，徐特秀，郭樹君，4，邵徳武，4，劉志強(qiáng)，朱遂一

(1.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院，吉林 長春 130024；2.東北師范大學(xué)吉林省城市污水處理與水質(zhì)保障工程技術(shù)研究中心，吉林 長春 130117；3.河北省環(huán)境地質(zhì)勘查院，河北 邢臺 050022；4.中石油吉林石化公司109污水處理廠，吉林 吉林 132022)

低溫序批式生物反應(yīng)器中Comanonas testosteroni QYY降解水中喹啉的研究

陳 瑜1，2，賈 濤2，3，王天竹2，王洪寧2，4，徐特秀2，郭樹君2，4，邵徳武2，4，劉志強(qiáng)2，朱遂一2

(1.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院，吉林 長春 130024；2.東北師范大學(xué)吉林省城市污水處理與水質(zhì)保障工程技術(shù)研究中心，吉林 長春 130117；3.河北省環(huán)境地質(zhì)勘查院，河北 邢臺 050022；4.中石油吉林石化公司109污水處理廠，吉林 吉林 132022)

喹啉；睪丸酮叢毛單胞菌；生物降解；低溫

0 引言

喹啉是一種典型的含氮雜環(huán)有機(jī)物，其受雙環(huán)稠合影響增大了空間位阻效應(yīng)，同時吡啶環(huán)上的N原子降低了環(huán)上的電子云密度，妨礙了氧化酶的親電子攻擊，從而增大了其被生物降解的難度.在自然環(huán)境中，喹啉具有良好的水溶性和低生物降解性，使其成為土壤、地下水或生物處理系統(tǒng)的外排水中常見的一種污染物[1]，特別是在垃圾填埋場、制藥廠、煤焦化廠、木材保存和化石染料廠附近[2-4].一些研究顯示，喹啉及其衍生物對人和動物具有一定毒性、致癌和致突變性[5]，因此含喹啉的廢水需要經(jīng)過處理才能排放到環(huán)境中.

一些自然環(huán)境中存在的微生物，如假單胞菌[6]、紅球桿菌[7]、諾卡氏菌[8]、伯克氏桿菌[9]、食酸菌[10]等具有特定的酶可用來分解水中的喹啉.劉佐才等[11]的研究報(bào)道了伯克氏桿菌在30℃和生物添加量為0.985 8 g/L的條件下，可以在2 h內(nèi)完全降解水中200 mg/L的喹啉.Zhu等[12]的研究表明，通過添加1%的菌液(質(zhì)量濃度為4.8 g/L)，紅球桿菌QL2在pH=8和30℃～40℃時，具有最佳的降解效率.受加菌量、微量元素和培養(yǎng)條件的影響，很難比較細(xì)菌之間的降解效率.睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)是1987年命名的一類新細(xì)菌，它可以降解環(huán)境中的甾體，因而吸引了眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注.到目前為止，已有2株細(xì)菌被報(bào)道可以分解水中的喹啉，如C.testosteroniQ10[13]可以利用喹啉為單一碳源和能源生長，最佳條件是pH=8和30℃；另外，C.testosteroni63[14]能夠降解喹啉和多種喹啉衍生物.上述利用單菌分解水中喹啉的研究，多采用搖瓶培養(yǎng)來分析細(xì)菌對有機(jī)物的去除效率.在搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)菌的氧利用效率和搖瓶的水力條件均不同于污水處理裝置，相關(guān)現(xiàn)象難以直接解釋細(xì)菌在裝置中對有機(jī)物的降解過程.

本文通過向序批式活性污泥法反應(yīng)器(sequence batch reactor，SBR)中投加C.testosteroniQYY的方法，分析了單一細(xì)菌在反應(yīng)器中生長和營養(yǎng)攝取的過程.實(shí)驗(yàn)分析了裝置中溶解氧、pH、生物量等變化的規(guī)律，檢測了中間產(chǎn)物2-羥基喹啉(2-hydroxyquinoline，2-HQ)的生成與降解過程，并結(jié)合氨氮和總有機(jī)碳(total organic carbon，TOC)的變化探討了喹啉在SBR中的降解機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室用的喹啉和2-HQ為分析純，購置于阿拉丁試劑有限公司；甲醇和乙腈為色譜純，購置于Sigma公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(beef extract peptone medium，BEP)購置于北京川布蘭公司.其余試劑為化學(xué)純，由國藥化學(xué)試劑有限公司提供.實(shí)驗(yàn)室用水為超純水.

實(shí)驗(yàn)室用的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(mineral salt medium，MSM)成分為：Na2HPO4·12H2O 4.26 g/L，KH2PO42.65 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.02 g/L和微量元素1 mL.微量元素成分如下：FeCl2·4H2O 1.5 g/L，NiCl2·6H2O 0.024 g/L，CoCl2·6H2O 0.19 g/L，CuCl2·2H2O 0.002 g/L，MnSO4·H2O 0.061 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.024 g/L，ZnCl20.07 g/L，H3BO30.006 g/L.

1.2 降解菌的篩選與16S rRNA鑒定

細(xì)菌來源于吉林某化工企業(yè)廢水處理車間的活性污泥，篩選過程如下：將5 mL混合液接種于含200 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，在25℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，接種到新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；經(jīng)過3次馴化培養(yǎng)后，培養(yǎng)基的顏色逐漸變成粉紅色.采用平板劃片法分離培養(yǎng)基中的細(xì)菌.參照王培明等[15]的方法，采用PCR通用引物F27(AGAGTTTGATCATGGCTCAG)和R1492(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)對已分離的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將獲得的PCR產(chǎn)物純化并提交上海生工進(jìn)行序列測定，通過BLAST比對分析已獲得細(xì)菌的同源性.

1.3 SBR裝置的啟動與運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)使用的SBR裝置有效容積為1 L，底部曝氣(0.2 L/min)并增設(shè)攪拌裝置(100 r/min).在啟動階段，向裝置中依次加入1 L含100 mg/L喹啉的MSM和50 mLD(600)=0.5的菌液，在(10±1)℃條件下，開啟曝氣和攪拌裝置.裝置運(yùn)行周期為曝氣13 h，攪拌2 h，沉淀9 h.間隔時間取樣分析.

1.4 分析方法

分別采用溶解氧測定儀(Multi 340i，WTW)和pH計(jì)(PHS-3C，雷磁)分析水中溶解氧濃度和pH值；采用總有機(jī)碳測定儀(TOC-L CPH，日本島津)測定進(jìn)水和出水的TOC值；采用紫外-可見光分光光度計(jì)(T-6，普析通用)在波長600 nm下測定的吸光度值來對應(yīng)表示水中細(xì)菌的相對數(shù)量；采用離子色譜儀(883型，瑞士萬通)測定水中氨氮、硝酸鹽和亞硝酸鹽的濃度.按照Zhi等[16]方法先對細(xì)菌進(jìn)行脫水處理，表面噴銀后用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，美國FEI)觀察，儀器加速電壓為200 kV.采用液相色譜儀(LC-20A，日本島津)分析水中喹啉和2-HQ的濃度，條件如下：流動相V(乙腈)∶V(水)=60∶40，流量1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，紫外檢測器波長設(shè)置為273 nm，2-HQ和喹啉的保留時間分別設(shè)置為2.4 min 和3.6 min.利用SDS-PAGE儀(Mini-PROTEAN，美國Bio-rad)分析細(xì)菌經(jīng)BEP和喹啉誘導(dǎo)后蛋白譜帶的信息，步驟如下：配置D(600)=3的菌懸液40 mL，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY96，寧波新芝)，在冰浴條件下間隔2 s超聲處理90 min；樣品放入濃縮膠中，在120 V下開始電泳；電泳完成后染色12 h，脫色3 h后拍照.

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌形貌

在缺少微量元素，如氨基酸、維生素等條件下，本次實(shí)驗(yàn)所篩選的細(xì)菌可以利用喹啉為唯一碳源、氮源和能源生長.圖1顯示，該菌為桿狀，長3～5 μm，直徑約0.4 μm，外形與部分已鑒定的假單胞菌[6]、紅球桿菌[12]等相似.提取該菌株DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，在1 500 bp處獲得一個明亮條帶，如圖2所示.利用試劑盒切膠回收，并純化后測序，得到細(xì)菌的16S rRNA序列.將序列提交到Genbank，獲得登錄號為KM246901.1，命名為QYY.進(jìn)一步通過Blast比對后發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌與Genbank上多株睪丸酮叢毛單胞菌的相似度達(dá)99%，與C.testosteroniTM062，CNB-2和KZ-OAIFI的進(jìn)化距離接近.其中TM062和KZ-OAIFI來源于動物組織.而CNB-2已被證實(shí)具有降解環(huán)境中苯甲酸、苯酚等的能力[17].由此推測，細(xì)菌QYY能夠適應(yīng)各種環(huán)境條件，并具有降解水中多種有機(jī)物的能力.

圖1 細(xì)菌的SEM圖

圖2 喹啉降解菌的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖

2.2 低溫喹啉降解情況

一些文獻(xiàn)顯示，在細(xì)菌降解喹啉過程中，水溶液的顏色會發(fā)生變化，如紅球菌QL2降解喹啉時，溶液先變粉紅，然后變成暗紅色[12]；而C.testosteroniQ10降解時，溶液又從粉紅色變成黃色[18].本次實(shí)驗(yàn)中，水溶液大約從8 h開始顏色由無色變成粉紅色，反應(yīng)11 h后逐漸變成淺綠色，最后經(jīng)過24 h反應(yīng)后變成墨綠色.由于初始加菌量、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不同，無法對比相關(guān)文獻(xiàn)中的細(xì)菌對喹啉的降解效率.圖3顯示了隨著水中喹啉逐漸被細(xì)菌分解，2-HQ質(zhì)量濃度逐漸增大.當(dāng)運(yùn)行時間達(dá)到13 h時，水中喹啉被完全去除，而2-HQ質(zhì)量濃度達(dá)到了42.8 mg/L；再經(jīng)過0.5 h降解，2-HQ的濃度才達(dá)到最大值51.4 mg/L.2-HQ的生成量滯后于喹啉的分解，這表明水中喹啉的去除是經(jīng)過2個步驟完成的：喹啉首先被細(xì)菌的胞外聚合物捕獲吸附到細(xì)菌表面[19]，然后在氧化還原酶的作用下在2-位發(fā)生生物催化反應(yīng)將喹啉轉(zhuǎn)化為2-HQ.從圖3可以看出，當(dāng)水中喹啉被完全去除后，2-HQ質(zhì)量濃度才逐漸降低，這表明細(xì)菌QYY優(yōu)先分解水中喹啉，然后再分解初級產(chǎn)物2-HQ.然而，在8 h時喹啉去除率超過50%，而2-HQ質(zhì)量濃度在8 h時才開始出現(xiàn)迅速增大趨勢，由于2-HQ是喹啉生物降解的初級產(chǎn)物，意味著8 h后才出現(xiàn)喹啉的大量生物降解，而在8 h前喹啉的去除主要以細(xì)菌吸附為主，這明顯區(qū)別于搖瓶培養(yǎng)條件，也暗示了充足氧條件下細(xì)菌對水中有機(jī)物具有良好的吸附效果.此外，從圖3可以看出在水中喹啉和2-HQ去除的同時，總有機(jī)碳含量逐漸下降，但2-HQ去除階段總有機(jī)碳下降顯著快于喹啉去除階段，這也表明了細(xì)菌QYY優(yōu)先分解水中喹啉.

圖3 喹啉降解效率和初級降解產(chǎn)物2-HQ生成量

圖4 細(xì)菌QYY的生長(以D(600)計(jì))和溶液總有機(jī)碳含量

與搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)不同[15]，水中喹啉的分解并沒有嚴(yán)格對應(yīng)細(xì)菌的對數(shù)生長期.由圖4可見，細(xì)菌生長的遲緩期為8 h，在8 h后細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期.對比圖2中喹啉去除率和2-HQ質(zhì)量濃度的變化，可以發(fā)現(xiàn)從反應(yīng)器運(yùn)行初始時刻開始，就出現(xiàn)了喹啉的分解和2-HQ的生成.可見反應(yīng)器中的細(xì)菌能夠更好地適應(yīng)環(huán)境條件，并分解水中的有機(jī)物.此外，在反應(yīng)13.5 h后，細(xì)菌開始降解2-HQ并繼續(xù)生長，細(xì)菌的D(600)值也繼續(xù)增大(見圖4)，這表明細(xì)菌可以利用2-HQ為碳源和能源進(jìn)行生長，這不同于一些報(bào)道中顯示的2-HQ對喹啉降解菌有抑制效應(yīng)[12].

圖5 喹啉降解過程中溶解氧、pH值和氨氮濃度的變化

1為BEP培養(yǎng)基，2為無機(jī)鹽喹啉培養(yǎng)基圖6 細(xì)菌的蛋白電泳圖

圖5顯示了SBR中細(xì)菌分解喹啉時溶解氧、pH值和氨氮濃度的變化情況.如圖5所示，受SBR中持續(xù)曝氣影響，水中溶解氧濃度在初始階段沒有明顯變化，但是pH值出現(xiàn)V型變化趨勢.初始時刻pH值降低，主要受脅迫條件下細(xì)菌釋放有機(jī)酸的影響.圖5(b)顯示了在初始4 h內(nèi)溶液中氨氮離子濃度迅速增大，這說明死亡細(xì)菌分解和喹啉降解釋放的氨離子濃度逐漸增加，導(dǎo)致pH值出現(xiàn)上升趨勢.持續(xù)曝氣8 h后，溶解氧濃度和pH均出現(xiàn)下降趨勢，結(jié)合圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn)，從8 h開始2-HQ質(zhì)量濃度迅速增大，同時D(600)值也迅速增加，這表明細(xì)菌通過分解水中喹啉獲取碳源和能源來合成自身細(xì)胞的過程中，消耗了大量的氧并釋放有機(jī)酸.反應(yīng)13 h后停止曝氣，此時水中喹啉已經(jīng)被完全降解，細(xì)菌以2-羥基喹啉為基質(zhì)繼續(xù)生長，同時pH值和溶解氧持續(xù)下降，顯示細(xì)菌可以在低氧條件下繼續(xù)生殖.另外，圖5(b)顯示了在水中喹啉分解階段，氨氮濃度逐漸增加，說明喹啉被細(xì)菌分解，其吡啶環(huán)上的氮原子被轉(zhuǎn)化為氨氮.但在本次實(shí)驗(yàn)中，并未檢測到硝酸鹽或亞硝酸鹽的生成，說明細(xì)菌QYY不能氧化氨氮為硝態(tài)氮.對比水中喹啉和2-HQ的分解和氨氮的生成過程可以發(fā)現(xiàn)，在喹啉快速被生物降解期間，氨氮的產(chǎn)量非常少，這表示在細(xì)菌分解喹啉過程中，其初期步驟并不是從氮的脫除開始的，暗示細(xì)菌QYY分解水中喹啉可能遵循5，6-二羥基-2(1H)喹諾酮途徑[20].

2.3 喹啉降解菌的降解蛋白分析

由圖6可見，與泳道1(BEP培養(yǎng)基)相比，喹啉誘導(dǎo)時泳道2的條帶數(shù)目多且清晰，存在2條新的蛋白條帶，分別位于相對分子質(zhì)量為31 000和50 500處.由于降解喹啉并不是細(xì)菌維持生長必需的生命活動，在適合生長條件下，如BEP培養(yǎng)基中，可以不表達(dá)降解喹啉的功能.因此，細(xì)菌QYY經(jīng)過喹啉誘導(dǎo)后，產(chǎn)生相應(yīng)的酶來分解水中喹啉，由此表達(dá)了參與喹啉降解的重要蛋白.如果將該蛋白進(jìn)一步純化并經(jīng)二維電泳分析，有可能獲得控制喹啉降解的生物信息學(xué)信息，揭示微生物降解喹啉時的遺傳進(jìn)化機(jī)制.

3 結(jié)論

本文從石化廢水處理廠的活性污泥中篩選出了1株睪丸酮叢毛單胞菌QYY(登錄號：KM246901.1)，能夠在缺少微量營養(yǎng)條件下以喹啉為唯一碳源、氮源和能源生長.在序批式活性污泥法反應(yīng)器中，用該細(xì)菌降解喹啉時，溶液顏色經(jīng)歷透明—粉紅—淺綠—墨綠的變化過程.在持續(xù)充氧條件下，水中喹啉的去除與細(xì)菌的對數(shù)生長期并沒有良好的對應(yīng)關(guān)系.充氧有助于提高細(xì)菌對水中喹啉的吸附效果，其去除過程遵循先吸附后降解的規(guī)律，且優(yōu)先分解喹啉再分解初級產(chǎn)物2-羥基喹啉，最終將喹啉分子中吡啶環(huán)上的氮原子轉(zhuǎn)化為氨氮而不能持續(xù)轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮.細(xì)菌QYY降解喹啉過程中需要消耗氧，在分解喹啉的過程中會生成酸性中間產(chǎn)物降低水的pH值.細(xì)菌QYY的降解酶由底物喹啉誘導(dǎo)，不同于細(xì)菌利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基生長所需的酶.

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(責(zé)任編輯：方 林)

Biodegradation of quinoline by Comamonas testosteroni QYY in sequence batch reactor at low temperature

CHEN Yu1，2，JIA Tao2，3，WANG Tian-zhu2，WANG Hong-ning2，4，XU Te-xiu2，GUO Shu-jun2，4，SHAO De-wu2，4，LIU Zhi-qiang2，ZHU Sui-yi2

(1.Jilin Institute of Forestry Survey and Design，Changchun 130022，China；2.Jilin Engineering Research Centre for Municipal Wastewater Treatment and Water Quality Protection，Northeast Normal University，Changchun 130117，China；3.Hebei Survey Institute of Environmental Gelogy，Xingtai 050022，China；4.No.109 Wastewater Treatment Plant，Petrochina Jilin Petrochemical Company，Jilin 132022，China)

A rod-shaped aerobe，capable of degrading quinoline without micronutrient was isolated from active sludge of a petro-chemical wastewater treatment plant and later identified asComamonastestosteroniQYY(Genbank No.KM246901).The strain was inoculated as a sole bacterium for quinoline degradation into a sequence batch reactor at (10±1)℃.The results show thatC.testosteroniQYY assembled quinoline in water prior to its initial products 2-hydroxyquinoline and converted the N atom in the pyridine ring of quinoline into ammonia nitrogen rather than nitrate or nitrite.In the reactor，the quinoline removal was irrelevant to the exponential growth period ofC.testosteroniQYY and gradually decreased dissolved oxygen concentration from 8 mg/L to 2.4 mg/L，followed by releasing some acidic intermediates of quinoline degradation to reduce the pH value of water.Moreover，some key enzymes for quinoline degradation were induced by adding quinoline into MSM，which was different with that induced by beef extract peptone medium.

quinoline；Comamonastestosteroni；biodegradation；low temperature

1000-1832(2016)04-0132-06

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.04.028

2016-06-23

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)課題(2014ZX07201-011-004-2)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51108069，51478096)；吉林省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20140520151JH).

陳瑜(1981—)，女，碩士，工程師，主要從事水污染控制研究；通訊作者：朱遂一(1982—)，男，博士，副教授，主要從事污水處理與資源化研究.

X 172 [學(xué)科代碼] 610·1020

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