CFTR對(duì)肺腺癌細(xì)胞Calu-3遷移影響的研究

李亞秋，蘇曉薇，黃孫卉，許冬明，郝嘉南，郝利銘

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院解剖教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

CFTR對(duì)肺腺癌細(xì)胞Calu-3遷移影響的研究

李亞秋1，蘇曉薇2，黃孫卉1，許冬明1，郝嘉南1，郝利銘2

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院解剖教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

采用常規(guī)培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞Calu-3的方法，利用MTT和CCK-8法確定囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的激活劑(Genistein)和抑制劑(CFTRinh-172)的最適濃度，用CFTR激活劑和抑制劑的最佳濃度分別處理Calu-3細(xì)胞，然后采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀測(cè)了培養(yǎng)48 h后Calu-3細(xì)胞遷移的差異.結(jié)果表明：MTT法檢測(cè)激活劑的最佳濃度為25 μmol/L；CCK-8法檢測(cè)抑制劑的最佳濃度為10 μmol/L；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得出25 μmol/L 激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)量((74.2±5.79)個(gè))與對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((134.1±10.04)個(gè))相比具有顯著性差異(P=0.00<0.01)；10 μmol/L 抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)量((148.3±17.70)個(gè))與對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((134.1±10.04)個(gè))相比無(wú)顯著性差異(P=0.27>0.05).激活劑通過(guò)促進(jìn)CFTR氯離子通道的開(kāi)放，抑制了肺腺癌腫瘤細(xì)胞Calu-3的遷移.

CFTR；Calu-3細(xì)胞；遷移

目前，腫瘤的治療主要采取手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和生物治療等方式.每一種腫瘤的治療都有不同的治療模式.對(duì)于肺腺癌來(lái)說(shuō)，早期肺腺癌首選手術(shù)治療[1].然而，大多數(shù)患者在肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)，已經(jīng)是肺癌的晚期或中晚期，喪失了手術(shù)的機(jī)會(huì)，因此，會(huì)選擇化學(xué)治療，但化療藥物使用一段時(shí)間后會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的耐藥性；同時(shí)，這些抗癌藥物還具有很大的毒副作用，它們對(duì)正常的細(xì)胞也有毒害作用.因此，人們又開(kāi)始探討免疫療法和其他新的有效治療靶點(diǎn)[2].目前，已有許多晚期的非小細(xì)胞癌患者受益于基于自身體內(nèi)腫瘤可識(shí)別分子特征的個(gè)體免疫療法[2].隨著研究的逐漸深入，特殊分子靶向給藥的方式將逐漸成為肺癌治療的最主要手段，這就需要對(duì)治療有效的靶點(diǎn)進(jìn)行深入的篩選和研究[3].有報(bào)道稱，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)參與腫瘤的發(fā)展，其突變可能影響某些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-11].肺腺癌是肺癌的主要類型之一，CFTR在肺腺癌細(xì)胞有不同程度的表達(dá)，而CFTR對(duì)肺腺癌細(xì)胞的遷移和發(fā)展是否有影響尚未見(jiàn)研究報(bào)道.因此，本研究采用肺腺癌上皮細(xì)胞株Calu-3，通過(guò)添加CFTR特異性抑制劑和CFTR激活劑，分別制作出抑制和激活CFTR基因的細(xì)胞模型；采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移水平，進(jìn)而探討了CFTR是否能夠影響肺腺癌細(xì)胞的遷移，以為肺腺癌的治療提供一些新的線索.

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

Calu-3為高表達(dá)CFTR的肺腺癌細(xì)胞系，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系李學(xué)軍教授贈(zèng)與.細(xì)胞培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)，10%胎牛血清(四季青公司)，1%青鏈霉素混合液.

1.2 MTT測(cè)試

設(shè)置調(diào)零組、對(duì)照組、激活劑組.激活劑的濃度分別為：0，6.25，12.5，25，50，100，200，300，400 μmol/L，共9個(gè)濃度處理，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔.調(diào)整細(xì)胞密度至10 000個(gè)/孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜.棄掉培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液(在激活劑組中加入不同濃度的激活劑).培養(yǎng)時(shí)間分別為24，48和72 h.先加20 μL MTT，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后加150 μL DMSO，室溫震蕩10 min.將96孔板放入酶標(biāo)儀(TECAN SUNRISE，奧地利)測(cè)量D(490).采用下列公式計(jì)算抑制率或增殖率：抑制率或增殖率=((實(shí)驗(yàn)組D(λ)值-調(diào)零組D(λ)值)-(對(duì)照組D(λ)值-調(diào)零組D(λ)值))/(對(duì)照組D(λ)值-調(diào)零組D(λ)值).同時(shí)，采用IC50軟件計(jì)算MTT和CCK-8的IC50值.

1.3 CCK-8測(cè)試

細(xì)胞培養(yǎng)與MTT方法相同，設(shè)置抑制劑的濃度分別為：0，1.25，2.5，5，10，20，40，60，80 μmol/L，共9個(gè)濃度處理.培養(yǎng)時(shí)間分別為24，48和72 h.加入10 μL CCK-8/孔，放于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)試D(450).增殖率或抑制率采用1.2的公式計(jì)算.

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

調(diào)整Calu-3細(xì)胞濃度至200 000個(gè)/孔，鋪至24孔板中，分為CFTRinh172組、激活劑組、對(duì)照組、腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forskolin)+激活劑/抑制劑組、腺苷酸環(huán)化酶激活劑組共6組，放于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細(xì)胞鋪滿孔底，用消毒和滅菌后的10 μL移液器槍頭與直尺劃痕，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔.每24 h換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)加不同濃度的激活劑和抑制劑.觀察培養(yǎng)24，48和72 h三個(gè)時(shí)間段內(nèi)Calu-3細(xì)胞向劃痕中遷移的情況并顯微攝影.采用B.J.Allan等的方法[12]計(jì)算每張照片已遷入劃痕中的細(xì)胞數(shù)量，并運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

加入激活劑，培養(yǎng)Calu-3細(xì)胞24，48和72 h后，根據(jù)所測(cè)的D(λ)值計(jì)算出激活劑對(duì)Calu-3細(xì)胞的抑制率，結(jié)果表明隨著激活劑濃度的增高，細(xì)胞的抑制率增加(見(jiàn)圖1).采用IC50軟件計(jì)算激活劑作用時(shí)間為48 h的半數(shù)致死濃度(IC50值 )約為25 μmol/L.

2.2 CCK-8結(jié)果

加入抑制劑，培養(yǎng)Calu-3細(xì)胞24，48和72 h后，根據(jù)所測(cè)得D(λ)值計(jì)算出CFTRinh172對(duì)Calu-3細(xì)胞作用的增殖率，結(jié)果表明隨著抑制劑濃度的增高，細(xì)胞的增殖率呈現(xiàn)曲線型波動(dòng)(見(jiàn)圖2).從結(jié)果可以看，細(xì)胞培養(yǎng)48 h所顯示的增殖率與細(xì)胞培養(yǎng)所見(jiàn)的趨勢(shì)吻合，因此，劃痕實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)確定為培養(yǎng)48 h，抑制劑的適宜濃度為10 μmol/L.

圖1 MTT法測(cè)試激活劑影響 Calu-3細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 CCK8法測(cè)試抑制劑影響Calu-3細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 細(xì)胞遷移的測(cè)試結(jié)果

劃痕實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(A549肺腺癌細(xì)胞組)和Calu-3實(shí)驗(yàn)組.

A549組作為CFTR的空白對(duì)照組，分為A549對(duì)照、A549激活劑組、A549抑制劑組，培養(yǎng)時(shí)間分為24 h和48 h.劃痕后24 h，25 μmol/L A549激活劑組的細(xì)胞遷移數(shù)量為(132.3±4.16)個(gè)(見(jiàn)圖3a)，與A549對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((133.6±1.10)個(gè))(見(jiàn)圖3A)相比無(wú)顯著性差異(P=0.75>0.05)(見(jiàn)表1)；10 μmol/L A549抑制劑組的細(xì)胞遷移數(shù)量為(138.9±3.190)個(gè)(見(jiàn)圖3aa)，與A549空白對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((133.6±1.10)個(gè))相比無(wú)顯著性差異(P=0.056>0.05)(見(jiàn)表1).劃痕后48 h，細(xì)胞移滿整個(gè)劃痕.

Calu-3實(shí)驗(yàn)組中包括Calu-3對(duì)照組、Calu-3激活劑組、Calu-3抑制劑組、腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Forskolin)組.劃痕后48 h，25 μmol/L Calu-3激活劑組細(xì)胞遷移數(shù)量為(74.2±5.79個(gè))(見(jiàn)圖3b)，與其對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((134.1±10.04)個(gè))(見(jiàn)圖3B)相比差異顯著(P=0.00<0.01)(見(jiàn)表2)；10 μmol/L Calu-3抑制劑組的細(xì)胞遷移數(shù)量為(148.3±17.70)個(gè)(見(jiàn)圖3bb)，與其對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((134.1±10.04)個(gè))(見(jiàn)圖3B)相比無(wú)顯著差異(P=0.27>0.05)(見(jiàn)表2).

腺苷酸環(huán)化酶激活劑+激活劑 25 μmol/L組細(xì)胞遷移數(shù)量為(71.8±6.36)個(gè)(見(jiàn)圖3c)，與25 μmol/L 激活劑組的細(xì)胞遷移數(shù)量((74.2±5.79)個(gè))(見(jiàn)圖3b)相比無(wú)顯著差異(P=0.70>0.05)(見(jiàn)表3)；腺苷酸環(huán)化酶激活劑+10 μmol/L抑制劑組細(xì)胞遷移數(shù)量為(127.5±15.88)個(gè)(見(jiàn)圖3cc)，與10 μmol/L抑制劑48 h組細(xì)胞遷移數(shù)量((148.3±17.70)個(gè))(見(jiàn)圖3bb)相比無(wú)顯著差異(P=0.20>0.05).

A：A549 對(duì)照24 h，a：A549激活劑 25 μmol/L 24 h，aa：A549 抑制劑10 μmol/L 24 h；B：對(duì)照48 h，b：激活劑25 μmol/L 48 h，bb：抑制劑10 μmol/L 48 h；C：Forskolin 48 h，c：Forskolin+激活劑25 μmol/L 48 h，cc：Forskolin+抑制劑10 μmol/L 48 h.

指標(biāo)遷移數(shù)量激活劑組對(duì)照組132.3±4.16133.6±1.10抑制劑組對(duì)照組138.9±3.19133.6±1.10P0.750.056

表2 激活劑、抑制劑對(duì)Calu-3細(xì)胞遷移的影響(48 h)

**表示P<0.01，兩組之間差異顯著.

表3 加入激活劑或抑制劑后腺苷酸環(huán)化酶激活劑對(duì)Calu-3細(xì)胞遷移的影響(48 h)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中采用的細(xì)胞系為高表達(dá)CFTR基因的Calu-3肺腺癌細(xì)胞，遺傳背景清楚.在通常情況下，細(xì)胞的CFTR氯離子通道很少開(kāi)放，通過(guò)添加激活劑，使該通道大量開(kāi)放，相當(dāng)于CFTR高表達(dá)；添加CFTR特異性抑制劑，使CFTR氯離子通道特異性關(guān)閉，相當(dāng)于CFTR低表達(dá).這樣，就制作了相對(duì)意義上的肺腺癌上皮細(xì)胞CFTR高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型，進(jìn)而利用該細(xì)胞模型從功能上確定CFTR是否對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移有影響.

劃痕實(shí)驗(yàn)是常用的測(cè)試細(xì)胞遷移的方法.實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)設(shè)立空白對(duì)照組(A549雖然是肺腺癌細(xì)胞，但無(wú)CFTR表達(dá))、陰性對(duì)照組、激活劑組和抑制劑組來(lái)證明CFTR參與肺腺癌細(xì)胞的遷移和腫瘤的發(fā)展.

為了證明激活劑和抑制劑是針對(duì)CFTR 氯離子通道的激活劑和抑制劑，實(shí)驗(yàn)中首先采用A549細(xì)胞作為對(duì)照.在其培養(yǎng)液中添加CFTR激活劑和抑制劑后，細(xì)胞的遷移數(shù)量(分別為(132.3±4.163)個(gè)，(138.9±3.190)個(gè))與其對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((133.6±1.101)個(gè))相比差異均不顯著(P>0.05).該結(jié)果表明，激活劑和抑制劑是針對(duì)CFTR的激活劑和抑制劑.

有文獻(xiàn)報(bào)道，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，功能障礙的CFTR可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮功能的丟失而成為遷移和侵襲的細(xì)胞[13]；CFTR高表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14].本實(shí)驗(yàn)中，25 μmol/L 激活劑組的細(xì)胞遷移數(shù)量((74.2±5.79)個(gè))與其對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((134.1±10.04)個(gè))相比差異顯著(P<0.01)，該結(jié)果表明，添加CFTR激活劑使氯離子通道開(kāi)放，能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移.抑制劑組的細(xì)胞遷移數(shù)量((148.3±17.70個(gè))與陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量((134.1±10.04)個(gè))比較，差異不顯著(P>0.05)，該結(jié)果表明，抑制劑不能抑制Calu-3細(xì)胞的遷移.CFTR是腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)依賴的氯離子通道，正常情況下，細(xì)胞有少量的cAMP，能夠保障該通道的生理功能.Forskolin是腺苷酸環(huán)化酶激活劑，在實(shí)驗(yàn)中加入該試劑可以大幅度提高cAMP的含量，保障CFTR在激活劑的作用下正常開(kāi)放.為了證明上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否是由cAMP數(shù)量變化而引起的異常，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了添加和不添加Forskolin實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明CFTR對(duì)Calu-3細(xì)胞遷移的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加和不添加Forskolin兩組細(xì)胞的遷移數(shù)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，從而證明細(xì)胞自身產(chǎn)生的cAMP能夠保證細(xì)胞的遷移.另外，從理論上說(shuō)，當(dāng)氯離子通道關(guān)閉后，細(xì)胞的遷移速度應(yīng)該加快.但是，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFTR氯離子通道被關(guān)閉后，細(xì)胞的遷移速度沒(méi)有受到明顯的影響.已有的研究證明，Calu-3細(xì)胞除了CFTR外，還表達(dá)CLC氯離子通道，而抑制劑僅關(guān)閉CFTR氯離子通道，對(duì)CLC氯離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子沒(méi)有影響，從而導(dǎo)致添加抑制劑后 Calu-3細(xì)胞的遷移沒(méi)有受到影響.綜上所述，添加CFTR抑制劑和添加CFTR激活劑使Calu-3細(xì)胞遷移具有顯著的差異.這一結(jié)果提示，CFTR可能是腫瘤細(xì)胞遷移的一個(gè)靶點(diǎn).

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(責(zé)任編輯：方 林)

The migration role of CFTR in Calu-3 cell line of lung adenocarcinoma

LI Ya-qiu1，SU Xiao-wei2，HUANG Sun-hui1，XU Dong-ming1，HAO Jia-nan1，HAO Li-ming2

(1.Department of Anatomy，Jilin Medical College，Jilin 132013，China；2.School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China)

Calu-3 were cultured by conventional method in this paper，and the optimal concentrations of activator and inhibitor of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator were determined by MTT and CCK-8 method，the optimal concentrations of the CFTR activator(Genistein) and inhibitor(CFTRinh-172) were added to the cell，detected the migration of cultured Calu3 cells by scratch test in 48 h.The following results were obtained：The optimal concentrations of activator were 25 μmol/L.The optimal concentrations of inhibitor were 10 μmol/L.The results of scratch tests showed that there was significant difference(P=0.00<0.01) between the number of cell migration of activator(25 μmol/L) group(74.2±5.79) and the number of cell migration of control group(134.1±10.04).There was no significant difference(P=0.27>0.05) between the number of cell migration of inhibitor(10 μmol/L) group and the number of cell migration of control group(134.1±10.04).Activator(Genistein) inhibited the migration of lung adenocarcinoma cells by making the CFTR chloride ion channels open.

CFTR；Calu-3 cell；migration

1000-1832(2016)04-0116-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.04.025

2016-04-11

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20100920).

李亞秋(1988—)，女，碩士，助教；通訊作者：郝利銘(1964—)，男，博士，教授，主要從事人體解剖與組織胚胎學(xué)研究.

Q 279 [學(xué)科代碼] 180·2110

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