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    N-乙酰半胱氨酸對(duì)新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎保護(hù)作用

    2016-12-29 11:44:38蔣月娟
    西南國(guó)防醫(yī)藥 2016年12期
    關(guān)鍵詞:壞死性生理鹽水結(jié)腸炎

    蔣月娟,陳 霞

    N-乙酰半胱氨酸對(duì)新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎保護(hù)作用

    蔣月娟,陳 霞

    目的探討N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)SD新生大鼠模型腸道損傷的保護(hù)作用。方法3日齡SD大鼠40只隨機(jī)分為4組:NEC模型組、NAC對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組、NEC模型+NAC組,每組10只。通過缺氧復(fù)氧冷刺激5 d制備NEC模型,此后,除NEC模型組外,其余3組給予NAC(100 mg/次)或生理鹽水(5 ml/次)灌胃,1次/d,共5 d。各組在實(shí)驗(yàn)第5、10 d分別處死5只大鼠,解剖回盲部近端腸管行病理學(xué)檢查,靜脈血測(cè)定血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物酶(SOD)水平。結(jié)果NEC模型組實(shí)驗(yàn)中共死亡2只,其余組無(wú)死亡。NEC模型+NAC組和NEC模型組第10 d腸道組織病理評(píng)分均高于生理鹽水對(duì)照組和NAC對(duì)照組(P<0.05),NEC模型+NAC組評(píng)分低于NEC模型組(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)后第5 d及第10 d,NEC模型組血清抗氧化活顯著低于NAC對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組(P<0.05),也顯著低于NEC模型+NAC組(P<0.05),提示NAC可明顯提高血清抗氧化活性(P<0.05)。結(jié)論NAC可以減輕NEC大鼠模型腸道組織病理?yè)p傷,提高機(jī)體抗氧化水平,具有良好的腸道保護(hù)作用。

    小腸結(jié)腸炎;壞死性;N-乙酰半胱氨酸;抗氧化;大鼠

    壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是新生兒階段嚴(yán)重的胃腸道疾病,雖然近年來(lái)新生兒救治技術(shù)不斷提高,但該病死亡率仍居高不下,因此,尋求對(duì)NEC安全、有效的干預(yù)措施,已成為全世界新生兒科醫(yī)師研究的熱點(diǎn)之一[1]。近年來(lái),NEC的致病機(jī)制研究已取得較大進(jìn)展,其中氧自由基產(chǎn)生過多在NEC病情進(jìn)展中起著重要作用[2]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)因具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3],使其用于NEC的防治成為可能。本研究通過對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎新生鼠模型給予NAC治療,探求NEC的新防治措施。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用3日齡SD新生大鼠40只,雌雄不限,體重5~10 g,室溫15~25℃飼養(yǎng)(均人工喂養(yǎng)),自然采光,由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所提供(合格證編號(hào)SCXK渝2007-0005)。40只大鼠隨機(jī)分為NEC模型+NAC組、NEC模型組、生理鹽水對(duì)照組、NAC對(duì)照組4組,每組10只。

    1.2 主要試劑和儀器 N-乙酰半胱氨酸(海南贊邦制藥有限公司),丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所),CY-12C型袖珍式數(shù)顯測(cè)氧儀(建德市梅電化分析儀器廠)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自制有機(jī)玻璃密閉缺氧艙及新生鼠保育箱。

    1.3 方法

    1.3.1 模型制備 按照既往研究方法[4]和本課題組的經(jīng)驗(yàn)。NEC模型+NAC組和NEC模型組行缺氧復(fù)氧冷刺激:密閉缺氧箱入氣孔充入純氮,流量15 L/min,將實(shí)驗(yàn)鼠立即置于箱內(nèi),持續(xù)充入氮?dú)猓S持100%氮?dú)?0 min后,置于室內(nèi)復(fù)氧10 min,立即置于4℃冰箱內(nèi)10 min。每日定時(shí)刺激1次,連續(xù)5 d。模型制備成功后,NEC模型+NAC組繼續(xù)給予NAC灌胃,100 mg/次,1次/d,連續(xù)5 d;NEC模型組不給予任何治療。生理鹽水對(duì)照組和NAC對(duì)照組不給予缺氧復(fù)氧冷刺激,5 d后生理鹽水對(duì)照組給予生理鹽水灌胃,3 ml/次,1次/d;NAC對(duì)照組給予NAC灌胃,100 mg/次,1次/d,兩組均連續(xù)給予5 d。

    1.3.2 人工喂養(yǎng)方法 采用8號(hào)灌胃針進(jìn)行灌胃,確認(rèn)針頭進(jìn)入胃內(nèi)后注入雀巢低出生體重奶,0.3 ml/次,3次/d。

    1.4 觀察指標(biāo)

    1.4.1 生長(zhǎng)情況及一般情況 各組大鼠每日定時(shí)稱量體重,觀察實(shí)驗(yàn)鼠是否有體重增長(zhǎng)緩慢、活動(dòng)減少、倦怠、大便顏色性狀發(fā)生改變,對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)緩慢、皮下脂肪減少,喂養(yǎng)過程是否有喂養(yǎng)困難、吐奶、進(jìn)奶量下降等表現(xiàn)。

    1.4.2 血清MDA、GSH-PX、SOD水平檢測(cè) 各組在缺氧復(fù)氧冷刺激5 d(即模型形成后,8日齡)和10 d(即給予NAC或生理鹽水灌胃5 d后,13日齡)時(shí),分別取5只大鼠處死,取靜脈血測(cè)定血清MDA(化學(xué)比色法,試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)、GSH-PX(化學(xué)比色法,試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)、SOD活力(WST法,試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

    1.4.3 腸組織病理學(xué)觀察 取回盲部近端腸管1~2 cm,立即固定于10%甲醛,再制成組織切塊,在石蠟切片機(jī)上行冠狀切片,約4~5 μm厚度連續(xù)切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察。腸道組織病理評(píng)分參考Nadler標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:0分:腸道絨毛及上皮完整,組織結(jié)構(gòu)正常;1分:輕微黏膜下或固有層腫脹分離;2分:中度黏膜下和/或固有層分離,黏膜下和/或肌層水腫;3分:重度黏膜下和/或固有層分離,黏膜下和/或肌層水腫,局部絨毛脫落;4分:腸絨毛消失伴腸壞死。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組外觀改變及大便情況 NEC模型+NAC組及NEC模型組新生鼠在造模后出現(xiàn)活動(dòng)減少、嗜睡,對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍倦怠,進(jìn)而可見排黃綠色或黑色稀便。繼續(xù)給予NAC喂養(yǎng)后,NEC模型+NAC組逐漸出現(xiàn)活動(dòng)增加,精神恢復(fù),大便顏色逐步轉(zhuǎn)為黃色;而NEC模型組大鼠出現(xiàn)進(jìn)行性活動(dòng)減少,拒奶,有兩只在第7、10 d死亡,有6只出現(xiàn)肉眼可見黑紅色血便。而生理鹽水對(duì)照組生長(zhǎng)發(fā)育良好,體重穩(wěn)定增長(zhǎng),活動(dòng)度及對(duì)刺激反應(yīng)好;NAC對(duì)照組進(jìn)食及排便正常,與生理鹽水對(duì)照組比較無(wú)顯著差異,大便為金黃色顆粒狀,無(wú)腹脹等。

    2.2 腸道組織病理學(xué)檢查 NEC模型+NAC組腸道較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),少量的腸上皮細(xì)胞變性壞死;NEC模型組可見腸上皮細(xì)胞大量變性壞死,肌纖維斷裂,腸絨毛腺體崩落;NAC對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組無(wú)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腸絨毛腺體正常,腸上皮細(xì)胞形態(tài)正常。

    2.3 腸道組織病理學(xué)評(píng)分 各組大鼠第10 d腸道組織病理學(xué)評(píng)分,NEC模型組與NAC對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),也與NEC模型+NAC組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示NAC可明顯改善NEC模型的腸道損傷。見表1。

    表1 各組腸道組織病理學(xué)評(píng)分

    2.4 血清抗氧化活性測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)后第5 d及第10 d,NEC模型組血清抗氧化活顯著低于NAC對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組(P<0.05),也顯著低于NEC模型+NAC組(P<0.05),提示NAC可明顯提高血清抗氧化活性。見表2。

    3 討論

    目前研究表明,多種病因可導(dǎo)致NEC的發(fā)生,缺氧和腸道缺血是其中關(guān)鍵的致病機(jī)制之一[5]。特別是氧自由基在NEC發(fā)病機(jī)制中的作用研究已比較深入,其主要通過細(xì)胞和線粒體膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生作用。新生兒由于不成熟的抗氧化損傷系統(tǒng)和高水平氧自由基產(chǎn)生酶,氧自由基可對(duì)腸道系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重氧化誘導(dǎo)損傷[6]。但是這種損傷可以通過自由基清除劑得到改善[7]。

    表2 各組血清抗氧化活性測(cè)定

    NAC是一種含硫的混合物,具有清除自由基功能,可作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑,已被用于多種疾病的預(yù)防和治療[8]。研究證實(shí),NAC可減輕氧自由基造成的細(xì)胞損傷,通過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)脫乙酰基后形成谷胱甘肽的前體,后者是組織抗氧化損傷的重要內(nèi)源性防御物質(zhì)。其作用機(jī)制可能與間接抑制細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶caspase-3的活性有關(guān)[9]。目前NAC在臨床主要作為痰液的稀釋劑,以及對(duì)乙酰氨基酚的中毒解毒劑[10],在新生兒的臨床應(yīng)用鮮見報(bào)道。

    本研究通過給NEC大鼠模型NAC治療5 d后,新生鼠活動(dòng)增加,精神恢復(fù),大便顏色逐步轉(zhuǎn)為黃色。腸道病理學(xué)提示腸道缺血減輕,只有少量的腸上皮細(xì)胞變性壞死,由此可見,NAC能有效降低NEC大鼠的腸道損傷。進(jìn)一步測(cè)定各組大鼠血清的氧化應(yīng)激水平,可以看出NAC主要通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),提高血清SOD、GSH-Px水平好降低MDA水平,達(dá)到保護(hù)腸道缺血缺氧性損傷。

    目前國(guó)內(nèi)有曾用姜黃素治療NEC大鼠模型的報(bào)道,也取得了一定療效[11]。姜黃素通過降低促炎因子TNF-α及炎性介質(zhì)COX-2的表達(dá),相對(duì)增加抑炎因子IL-10的表達(dá),從而對(duì)NEC大鼠具有保護(hù)作用。但是NAC具有清除自由基和抗氧化雙重作用,減輕缺血導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷療效更加明顯。

    綜上所述,NAC可提高體內(nèi)抗氧化水平,具有良好的NEC保護(hù)作用,能明顯減輕腸道損傷。但是NAC是否可在新生兒期長(zhǎng)期應(yīng)用,以及長(zhǎng)期應(yīng)用的療程和使用方法、副作用等還需進(jìn)一步明確。

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    Protective effects of NAC against necrotizing enterocolitis in neonatal rats

    Jiang Yuejuan1,Chen Xia21.Department of Pediatrics,the Second People's Hospital of Zigong,Zigong,Sichuan,643000,China;2. Department of Pediatrics,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China

    Objective To explore the protective effects of N-acetylcysteine (NAC)against the intestinal injury in SD neonatal rats with necrotizing enterocolitis (NEC)model.MethodsA total of 40 SD rats aged three days were randomly divided into four groups:NEC model group,NAC control group,normal saline group,and NEC model+NAC group(n=10,respectively).NEC models were prepared by means of hypoxia and re-oxygenation cold stimulation for five days.Therefore,except for NEC model group,the other three groups received lavage with NAC(100 mg/time)or normal saline(5 m l/time),once a day for total five days.Five rats in each group were killed on the fifth and tenth day of the experiment respectively.The anatomy of the ileocecal valve in the proximal intestine was conducted for pathological examination.The levels of serum MDA,GSH-PX and SOD were detected via the venous blood.ResultsTwo rats in NEC model groups died in the experiment.No rat died in other groups.The intestinal tissue pathology scores on the 10th day in NEC model+NAC group and NEC group were higher than those in the normal saline control group and NAC control group(P<0.05).The scores in NEC model+NAC group were lower than those in NEC model group(P<0.05).On the fifth and tenth day of the experiments,the serum antioxidant activity in NEC model group was much lower than that in NAC control group and normal saline group(P<0.05),and significantly lower than that in NEC model+NAC group(P<0.05),indicating that NAC could significantly improve serum antioxidant activity(P<0.05).ConclusionNAC can mitigate the intestinal histologic injury in NEC rats and increase the antioxidative level,and can provide excellent intestinal protection.

    enterocolitis;necrotizing,NAC;antioxidation;rat

    R 516.1

    A

    1004-0188(2016)12-1416-03

    10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.018

    2015-11-22)

    益普生腹瀉基金(IDF-2012-04)

    643000四川自貢,自貢市第二人民醫(yī)院兒科(蔣月娟);解放軍324醫(yī)院兒科(陳 霞)

    陳 霞,電話13983202719;E-mail:06chenxia@163. com

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