人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化制備技術(shù)研究

趙 晶，何 潔，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化制備技術(shù)研究

趙 晶，何 潔，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

目的建立人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；苽浼夹g(shù)。方法在無菌條件下，采集剖腹產(chǎn)嬰兒臍帶30條，長40～50 cm，棄被膜、血管后，剪成1 mm3的組織塊，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行組織塊反復(fù)貼壁培養(yǎng)，采用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞的生長及形態(tài)，對傳代培養(yǎng)的第3代細(xì)胞采用流式細(xì)胞分析法進(jìn)行細(xì)胞周期及表形分析，采用體外定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)觀察多向分化潛能。結(jié)果組織塊貼壁后于第4 d開始向周圍呈放射狀長出細(xì)胞，平均12 d左右長滿瓶底，細(xì)胞形態(tài)呈均一梭形；傳代培養(yǎng)后生長快速，于4～5 d達(dá)80%融合；連續(xù)傳代3次，其生長特性和形態(tài)不變，CD90、CD29陽性率＞99%，CD105陽性率＞81%，不表達(dá)CD34，CD45，在體外能分化成骨、軟骨、脂肪細(xì)胞。平均每條臍帶獲得細(xì)胞數(shù)＞6×109個(gè)。結(jié)論通過多條人臍帶重復(fù)分離培養(yǎng)，建立了體外規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備與鑒定技術(shù)規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)，可為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫建設(shè)和臨床應(yīng)用提供技術(shù)支持和標(biāo)準(zhǔn)化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；制備；鑒定，規(guī)?；粯?biāo)準(zhǔn)化

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一類來源于新生兒臍帶組織的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有向神經(jīng)、血管、肌肉、骨、軟骨、脂肪等多種功能細(xì)胞分化的潛能[1-6]。該類細(xì)胞的特點(diǎn)是[4-5]：（1）來源豐富、取材方便；（2）增殖能力強(qiáng)，易于體外規(guī)?；苽?，標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和儲存；（3）免疫原性低，異體或異種移植無明顯免疫排斥反應(yīng)，臨床應(yīng)用安全性可控；（3）可廣泛用于各種損傷、退變、自身免疫反應(yīng)等疾病治療；（4）比其他來源的干細(xì)胞更具有產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用優(yōu)勢。目前，不同實(shí)驗(yàn)室的hUC-MSCs制備方法和結(jié)果有一定差異，缺乏統(tǒng)一的技術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致培養(yǎng)出來的細(xì)胞質(zhì)量不盡相同，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療結(jié)果有一定差異。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)建立了組織塊多次貼壁法高效制備hUC-MSCs的技術(shù)，本研究在此基礎(chǔ)上，通過重復(fù)和優(yōu)化技術(shù)操作，進(jìn)一步規(guī)范了技術(shù)操作流程和方法，為建立 hUC-MSCs庫，研發(fā)hUC-MSCs的臨床制劑及轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臍帶來源 新生兒臍帶采自本地區(qū)三甲醫(yī)院或省級婦幼保健醫(yī)院，采集前進(jìn)行圍產(chǎn)期孕婦血標(biāo)本的乙型肝炎病毒DNA、丙型肝炎病毒DNA、人類免疫缺陷病毒、梅毒螺旋體抗體、巨細(xì)胞病毒，支原體檢測，均為陰性。同時(shí)留樣4℃儲存2個(gè)月后復(fù)檢，排除潛伏攜帶病原。產(chǎn)前影像學(xué)和遺傳代謝性疾病篩查，胎兒發(fā)育良好，無先天性畸形。采集臍帶長度40～50 cm，采集后立即轉(zhuǎn)送到細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室。采集臍帶前，均告知產(chǎn)婦，征得家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 主要設(shè)備和試劑 DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone），胎牛血清（FBS）和 0.25%trypsin-ETDA（BI公司），流式細(xì)胞儀（FACSCalibur,BD公司），流式抗體（Beckma），成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)試劑盒（GIBCO公司）。

1.3 UC-MSC分離和培養(yǎng) 在無菌條件下，將采集的新鮮剖腹產(chǎn)足月胎兒的臍帶放入無菌50 ml的離心管中，于1 h內(nèi)送至細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室。在無菌條件下，用生理鹽水反復(fù)沖洗，去掉殘留血漬、被膜和血管；用含有雙抗的PBS液浸泡2～3 min后，將臍帶剪碎成1 cm長，然后分裝于EP管內(nèi)，用眼科剪將組織塊剪成1 mm3左右，洗滌后再對應(yīng)移至到175 cm2培養(yǎng)瓶中，加入7～8 ml的10%FBS的DMEM/F12，搖晃后使組織塊均勻分布，再將培養(yǎng)瓶放于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3～4 d換液。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出且生長至80%～90%融合時(shí)，用0.25%trypsin-EDTA消化，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)至第3代，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)存活率后凍存。

1.4 細(xì)胞表型分析 采用第3代細(xì)胞，用0.9%生理鹽水洗滌反復(fù)離心3次，分成含1×106個(gè)細(xì)胞/管，加入 10 μl抗 CD90-FITC、CD105-PE、CD-29FITC、CD34-PE、CD45-PC5，避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行相關(guān)表型分析。

1.5 細(xì)胞分化潛能檢測

1.5.1 成脂誘導(dǎo)分化 取P3生長良好的細(xì)胞，按1×104個(gè)/cm2接種到12孔板中，放置5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，至細(xì)胞100%融合時(shí)，去除上清，用生理鹽水換洗2次，加人成脂誘導(dǎo)分化試劑培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，培養(yǎng)14～21 d后，采用多聚甲醛固定，油紅O染色觀察。

1.5.2 成骨誘導(dǎo) 用第3代細(xì)胞按5×103/cm2接種到6孔板中，放置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，至細(xì)胞60%融合時(shí)，去除上清，用生理鹽水換洗2次，加人成骨分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)（GIBCO，美國，成骨誘導(dǎo)試劑盒）；每3 d換一次液，培養(yǎng)至第21 d，用4%多聚甲醛固定，茜素紅染色5～10 min，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 成軟骨誘導(dǎo)分化 利用第3代生長良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，吸取5 μl接種到6孔板中，放置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，加入2 ml成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每3 d換液1次；培養(yǎng)第14 d，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，阿新藍(lán)染色，顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 UC-MSCs的生長及形態(tài) 組織塊貼壁法原帶在4～6 d時(shí)，可見組織快周圍有纖維樣細(xì)胞呈放射狀爬出，呈菱形、星形或多邊形等(圖1A)；12～15 d可見大量克隆狀細(xì)胞生長（圖1B），細(xì)胞生長融合至80%～90%。按1∶3的比例消化傳代后，傳代4 d可見纖維樣細(xì)胞長滿瓶壁，呈菱形旋窩狀，增殖速度快，活性好，形態(tài)均一。

圖1 體外培養(yǎng)的UC-MSCs

2.2 UC-MSCs的表型 對P3代細(xì)胞進(jìn)行免疫抗原表達(dá)檢測，結(jié)果顯示，CD90和CD29表達(dá)率＞99%，CD105表達(dá)率為80%，CD34表達(dá)率低于1%，符合UC-MSCs表型標(biāo)準(zhǔn)。見圖2。

圖2 第3代hUC-MSCs表型

2.3 UC-MSC的分化潛能 成脂分化：P3細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化14～21 d后，可見胞漿內(nèi)充滿脂滴3；成骨分化：P3細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化21 d，可見紅色的鈣質(zhì)結(jié)節(jié)3；成軟骨分化：P3成軟骨誘導(dǎo)分化14～28 d后，可見藍(lán)色的軟骨膠原基質(zhì)3。見圖3。

圖3 UC-MSC的誘導(dǎo)分化結(jié)果

2.4 hUC-MSCs的獲得量 本組實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)組織塊反復(fù)3次培養(yǎng)并傳代3次，每條臍帶獲得的第3代臍帶間充數(shù)量≥6×109個(gè)，可滿足臨床100例次治療用；若傳代到第5代，可滿足900例次使用。按此方法繼續(xù)傳代，預(yù)計(jì)每條臍帶可制備出滿足上千例次使用的標(biāo)準(zhǔn)化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

3 討論

鑒于hUC-MSCs的多向分化潛能和強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能[6]，預(yù)計(jì)將在各種損傷、退變、中毒和自身免疫性疾病治療中發(fā)揮重要作用，特別是對放射傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷修復(fù)治療具有特別重要的軍事醫(yī)學(xué)價(jià)值。涉及hUC-MSCs的臨床應(yīng)用，首先必須獲得足夠數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞。本研究組經(jīng)過多年摸索，建立了一套高效、規(guī)?；苽鋒UC-MSCs的技術(shù)方法，在本研究的基礎(chǔ)上，完成了治療多種疾病的療效與安全性評價(jià)及機(jī)制研究，并建立了種子細(xì)胞庫，初步解決了臨床前關(guān)鍵技術(shù)問題。

與國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道相比，本研究的結(jié)果更具有系統(tǒng)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可作為體外高效、規(guī)?；苽錁?biāo)準(zhǔn)化hUC-MSCs的參考方法，也可為建立干細(xì)胞庫提供技術(shù)支撐。本課題參照Bruyn和本研究組前期建立的方法，進(jìn)一步改進(jìn)和完善了多次貼壁法高效制備hUC-MSCs的方法，建立了組織塊多次貼壁制備hUC-MSCs的方法，獲得率更高，結(jié)果更穩(wěn)定、可靠。經(jīng)過免疫表達(dá)和誘導(dǎo)分化檢測，均符合間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)和國際細(xì)胞學(xué)會制訂的間充質(zhì)干細(xì)胞評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，與國家衛(wèi)計(jì)委和國家食品監(jiān)督管理局于2015年8月聯(lián)合發(fā)布了《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》的要求一致。

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國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B0）；國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）；云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com