大劑量人臍帶間充質(zhì)干細胞制劑給予CD-1小鼠的安全性評價

何 潔，趙 晶，王金祥，蔡學敏，朱向情，馬麗花，龐榮清，潘興華

大劑量人臍帶間充質(zhì)干細胞制劑給予CD-1小鼠的安全性評價

何 潔，趙 晶，王金祥，蔡學敏，朱向情，馬麗花，龐榮清，潘興華

目的觀察單次大劑量輸入自制的人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)制劑的急性反應，為臨床研究提供安全保障。方法60只SPF級CD-1小鼠隨機分為陰性對照組、溶劑對照組和制劑組，每組雌雄各半（n=10），制劑組按1×108個細胞/kg的劑量給CD-1小鼠單次靜脈注射hUC-MSCs制劑，陰性對照組和溶劑對照組分別輸注同等容量的0.9%氯化鈉注射液和勃脈力A溶液。輸注后連續(xù)觀察小鼠的臨床表現(xiàn)、體重和攝食量。觀察15 d后，將動物安樂死，進行大體解剖，觀察并行組織病理學分析。結(jié)果實驗期間，制劑組1只小鼠輸注細胞的尾尖靜脈處出現(xiàn)細胞堆積，引起局部毛細血管堵塞，從而導致尾尖部組織壞死。其余動物均未見異常表現(xiàn)和體重、食量差異，大體解剖和組織學觀察未見明顯與輸注細胞相關的病理改變。結(jié)論hUCMSCs制劑單次靜脈注射給予CD-1小鼠無急性毒性反應。

臍帶；間充質(zhì)干細胞；急性毒性實驗；CD-1小鼠

人臍帶間充質(zhì)干細胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)來源于臍帶的膠狀結(jié)締組織，具有一定的多向分化潛能及抗炎和免疫調(diào)控能力[1-3]。動物模型治療實驗和一些臨床研究證實，hUC-MSCs對肝損傷、脊髓損傷、退行性病變、移植物抗宿主排斥反應（GVHD）以及自身免疫性疾病等有治療意義[4-5]。為推進hUC-MSCs的臨床轉(zhuǎn)化應用，本課題組按臨床生物制劑標準研發(fā)出1種“hUC-MSCs注射液”，為保證臨床應用的安全性，本實驗觀察了單次靜脈給予較大劑量hUC-MSCs制劑的急性毒性反應。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 hUC-MSCs制劑來源于本院生物治療中心干細胞庫，批號為P20131101，濃度為2× 106個/ml，性狀為微黃色細胞懸液，保存條件為液氮保存；含5%人血白蛋白（廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司）和10%DMSO（Bioniche Pharma USA LLC）的復方電解質(zhì)溶液（上海百特醫(yī)療用品公司）。

1.2 實驗動物 60只SPF級的CD-1(ICR)小鼠，雌雄各半，雌性體重19.4～22.1 g，雄性17.8～22.4 g，同性別動物的體重均在平均體重的20%范圍內(nèi)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。小鼠飼養(yǎng)于裝有墊料的聚丙烯鼠盒中，鼠盒規(guī)格為295 mm×195 mm×125 mm，雌雄分養(yǎng)，每盒最多飼養(yǎng)同性別5只動物。動物自由攝食，自由攝水。

1.3 hUC-MSCs制劑制備 陰性對照劑為市售0.9%氯化鈉注射液；溶劑對照劑為用勃脈力A配制終濃度含有1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/ 10 ml(約1050 IU/4×107細胞)低分子肝素鈣的溶液。hUC-MSCs制劑的配制：首先用勃脈力A配制成含有1%人血白蛋白的制劑A溶液。將細胞凍存袋自液氮中取出，迅速置于40℃水浴中，快速融化后，將細胞用適量制劑A稀釋，使細胞充分混懸后，用臺盼藍染色，計數(shù)細胞活率≥90%。加入約10倍體積的制劑A，離心洗滌細胞3次，用終濃度含1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/4×107個細胞的低分子肝素鈣的勃脈力A溶液稀釋細胞濃度為4× 106個/ml，冰盒保存和運輸。配制后4 h內(nèi)完成輸注。

1.4 hUC-MSCs制劑輸注方法 輸注細胞前1 d，從66只動物中挑選檢疫合格、體重相近的60只動物（雌雄各半），用區(qū)段隨機分組法，按性別分為兩個區(qū)段，用Excel軟件給予每只動物一個隨機數(shù)，并按照隨機數(shù)從小到大的排序，將小鼠分為3組，每組雌雄動物各10只。制劑組輸注劑量為1×108個細胞/kg、濃度為4×106個細胞/ml，3組輸注容量均為25 m l/kg。臨床擬用劑量為1×106個細胞/kg體重，制劑組用量相當于臨床擬用劑量的100倍。陰性對照組和溶劑對照組分別輸注同等容量的0.9%氯化鈉注射液和勃脈力A溶液（含1%人血白蛋白、2%DMSO和1050 IU/4×107個細胞的低分子肝素鈣）。用1 ml一次性無菌注射器輸注，吸取細胞液前輕輕搖晃，經(jīng)小鼠尾靜脈注射，輸注細胞速度約為3～4 min/只，單次輸注。

1.5 觀察指標 輸注后籠旁觀察，1 h內(nèi)每15 min觀察記錄1次，1～4 h內(nèi)每1 h觀察1次。輸注第8 d和第15 d觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為活動、皮膚、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛門、四肢、足和呼吸等情況。

輸注后次日開始，每天上午和下午各1次，籠旁觀察動物死亡或瀕死情況、精神狀態(tài)、行為活動、進食情況、糞便性狀等，連續(xù)觀察14 d。

分別在輸注前1 d（D1）和輸注后的第 8 d（D8）、第15 d（D15），測定動物體重。每周加料1次，第8 d、第15 d稱量剩余飼料，據(jù)加料量和剩余飼料計算平均每天每只動物食量。食量以±s表示，但不進行統(tǒng)計學分析，根據(jù)動物體重和食量的變化趨勢以及臨床觀察結(jié)果和病理檢查，綜合判斷制劑的急性毒性反應情況。

1.6 病理學觀察 輸入細胞15 d后，小鼠經(jīng)CO2麻醉后，股動脈放血安樂死，進行大體解剖。對所有組織臟器進行原位觀察，記錄肉眼可見異常，并對異常組織或器官進行組織病理學檢查。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS15.00軟件對不同組別動物的體重進行統(tǒng)計學分析，雌雄分開，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，假設檢驗水準為α=0.05，結(jié)果分析時同時考慮統(tǒng)計學意義和生物學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)動態(tài)觀察情況 制劑組1只雄性小鼠于給藥后4 min，出現(xiàn)精神不振、俯臥和自主活動減少，于輸注次日恢復；輸注后22 min注射局部血管呈紫黑色線狀，輸注次日尾部呈紫黑色，輸注后第4 d尾部基本恢復正常，僅尾尖部略呈紫黑色，之后變?yōu)楹谏?；輸注后?0 d尾尖部黑色區(qū)域脫落，斷開部位略呈紅色腫脹，持續(xù)至觀察期結(jié)束。除此之外，實驗期間，其他動物各時間段均未見異常臨床反應。

2.2 體重變化 與同期同性別陰性對照組相比，其他兩組的體重均呈正常增長，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

2.3 食量變化 與同期同性別陰性對照組相比，其他兩組的食量未見明顯差異（P＞0.05，表2）。

2.4 病理學變化 制劑組出現(xiàn)異常反應的雄性小鼠大體觀察可見尾尖部略腫脹，鏡下主要表現(xiàn)為尾尖部皮膚表皮細胞腫脹，皮下水腫伴中性粒細胞浸潤，局灶皮膚全層壞死結(jié)痂，但尾部注射部位血管及其周圍組織未見明顯異常改變?？紤]該病變可能是由于輸注局部細胞堆積，引起局部毛細血管堵塞，從而導致尾尖部組織壞死（圖1）。除此之外，其他動物大體觀察均未見明顯異常。

圖1 尾部病理組織結(jié)構(gòu)（HE染色，×40）

3 討論

基于間充質(zhì)干細胞廣泛的應用前景，本研究在前期開發(fā)了一種復蘇后可直接應用于臨床的hUC-MSCs制劑的基礎上，進行了hUC-MSCs制劑的急性毒性試驗。本研究采用的是高于臨床擬使用劑量的100倍靜脈回輸動物體內(nèi)，觀察其急性毒性反應。在動物選擇方面，CD-1小鼠遺傳背景清楚，對藥物的反應比較穩(wěn)定，個體差異較小，飼養(yǎng)方便，體形較小，便于實驗操作，是毒理學試驗中常用的實驗動物之一。實驗期間，僅有制劑組1只動物因為輸注細胞局部堆積引起局部毛細血管堵塞，從而導致尾尖部組織壞死，其余均未出現(xiàn)與輸注細胞相關的急性毒性反應。本實驗結(jié)果表明，單次靜脈注射給予CD-1小鼠最大耐受劑量（MTD）≥1×108個細胞/kg，為臨床安全使用提供可靠的動物實驗依據(jù)。

表1 各組不同性別小鼠不同時間體重變化(g）

表2 各組不同性別小鼠不同時間食量變化［g/（只·d）］

[1] Seshareddy K，Tro yer D，Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord[J]．Methods Cell Biol，2008，86(1):102-118.

[2] Mitchell KE,Weiss ML,Mitchell BM,et al.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia[J].Stem Cells,2003,21: 50-60.

[3] Chamberlain G,Fox J,Ashton B,et al.Concise review: mesenchymal stem cells:their phenotype,differentiation capacity, immunological features,and potential for homing[J].Stem Cells, 2007,25(11):2739-2749.

[4] Ringden O,Le Blanc K.Mesenchymal stem cells for treatment of acute and chronic graft-versus-host disease，tissue toxicity and hemorrhages[J].Best Pract Res Clin Haematol，2011，24（1）：65-72.

[5] MacDonald GI，Augello A，De Bari C.Role of mesenchymal stem cells in reestablishing immunologic tolerance in autoimmune rheumatic diseases[J].Arthritis Rheum，2011，63（9）：2547-2557.

[6] Kadivar M,Khatami S,Mortazavi Y,et al.In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,340(2):639-647.

[7] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for cellular therapy position statement[J]. Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[8] Wakitani S,Saito T,Caplan AI.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine[J]. Muscle Nerve,1995,18(12):1417-1426.

[9] Pittenger MF,Martin BJ.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics[J].Circ Res,2004,95(1):9-20.

[10] 唐欣,王巖,易海波,等.人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導分化為心肌細胞的特異性基因表達[J].中國組織工程研究,2013,17(27):4988-4991.

Safety evaluation of hUC-MSCs agent after large dose injection administered to CD-1 mice

He Jie,Zhao Jing,Wang Jinxiang,Cai Xuemin,Zhu Xiangqing,Ma Lihua,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming, Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the acute reaction after large dose injection of self-prepared human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)to provide safety guarantee for clinical research.MethodsA total of 60 SPF-grade CD-1 mice are random ly divided into negative control group,solvent control group and preparation group.The number of each group was equally split between male and female mice (n=10).The CD-1 mice in the preparation group were administrated with hUC-MSCs preparation by single intravenous injection according to 1×108cell/kg.The negative control group and the solvent control group were infused with 0.9%sodium chloride injection and Plasmalyte-A solution with equivalent capacity respectively.The clinical presentation,body weight and food intake of mice were continuously observed after the infusion.After 15 days of observation,euthanasia was conducted on the animals and gross anatomy was carried out for observation and histopathological analysis.ResultsDuring the experiment,one mouse in the preparation group had accumulation of infused cells in the vein at the tail tip,which caused local capillary blockage and necrosis of the tail tip.Other animals had no abnormal reaction and difference in body weight and food intake.No obvious pathological change relevant to infused cells was discovered in Gross anatomy and histological observation.ConclusionThe administration of hUC-MSCs preparation to CD-1 mice by single intravenous injection causes no acute toxic reaction.

UC;MSC;acute toxicity experiment;CD-1 mice

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1362-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.003

2016-06-28)

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B0）；國家973計劃項目（2012CB5181060）；云南省科技計劃重點項目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明市干細胞與再生醫(yī)學研究重點實驗室

潘興華，E-mail：xinghuapan@aliyun.com;龐榮清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com