• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用

    2016-12-28 07:32:00韓笑奇白姝史清洪
    生物工程學(xué)報(bào) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)

    韓笑奇,白姝,史清洪,2

    1 天津大學(xué) 化工學(xué)院,天津 300354

    2 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300354

    交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用

    韓笑奇1,白姝1,史清洪1,2

    1 天津大學(xué) 化工學(xué)院,天津 300354

    2 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300354

    韓笑奇, 白姝, 史清洪. 交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(12): 1676?1684.

    Han XQ, Bai S, Shi QH. Structural regulation by calcium ion in preparing cross-linked enzyme aggregates. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1676?1684.

    以葡萄糖氧化酶 (GOx) 為研究對(duì)象,系統(tǒng)地研究了鈣離子對(duì)交聯(lián)酶聚集體 (CLEA) 粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用以及酶催化性能和實(shí)用性的影響。研究結(jié)果表明,GOx酶沉淀過程中引入鈣離子可顯著降低CLEA粒子尺寸并導(dǎo)致粒子內(nèi)納米孔道結(jié)構(gòu)逐步消失。在0.1 mmol/L鈣離子濃度下,GOx酶的CLEA仍保有清晰的納米孔道結(jié)構(gòu)。以葡萄糖為底物的GOx酶CLEA催化結(jié)果顯示,該CLEA粒子的酶活性為對(duì)照CLEA粒子的2.69倍。即便1.0 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子的GOx酶活性仍高出對(duì)照CLEA粒子約 42%。此外,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA不僅具有更高的底物轉(zhuǎn)化速率和很好的操作穩(wěn)定性,而且CLEA中GOx酶的最大反應(yīng)速度顯著提高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了鈣離子對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用,為制備具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基礎(chǔ)。

    葡萄糖氧化酶,交聯(lián)聚集體酶,鈣離子,擴(kuò)散通道,轉(zhuǎn)化速率

    交聯(lián)酶聚集體 (Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs) 是本世紀(jì)初在交聯(lián)酶晶體 (Cross-linked enzyme crystals,CLECs) 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型無載體固定化酶技術(shù)[1]。相較于CLEC中利用復(fù)雜的酶分子晶體制備固定化酶的方法[2],CLEA通過更加簡便易行的物理沉淀方法使酶分子聚集,進(jìn)而通過戊二醛等交聯(lián)而成穩(wěn)定的超分子結(jié)構(gòu)。因其對(duì)酶純度要求低、制備方法簡單、聚集體穩(wěn)定性高且易于回收和重復(fù)利用等諸多優(yōu)點(diǎn),單酶CLEA技術(shù)在生物催化和生物分離等領(lǐng)域展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景并得到了系統(tǒng)地研究[3-6]。López-Serrano等利用硫酸銨和十二烷基硫酸鈉聯(lián)合沉淀方法制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體具有高于天然脂肪酶1-2倍的催化活性[7]。此后,聚集體粒徑和結(jié)構(gòu)、聚集體穩(wěn)定性等影響CLEA性能的參數(shù)和工藝條件也得到了系統(tǒng)地考察[8]。2014年,Torabizadeh等提出引入鈉鈣雙離子聚集酶分子的陽離子輔助聚集策略。但結(jié)果顯示,α-淀粉酶沉淀中鈉鈣雙離子的存在改善了CLEA的穩(wěn)定性并些許提高了淀粉底物的親和性[9]。相比于單酶催化,生物體內(nèi)更為普遍的代謝產(chǎn)物合成都是通過兩個(gè)或多個(gè)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成的[10-11]。Sheldon教授課題組于2003年提出了多酶CLEAs的“combi-CLEAs”概念[12],進(jìn)而制備了級(jí)聯(lián)催化 (S)-扁桃酰胺合成的 (S)-醇腈酶和腈水解酶雙酶CLEA[13]。此后,該方法也被用于構(gòu)建包括級(jí)聯(lián)[14-15]和非級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]在內(nèi)的多酶催化體系。相對(duì)于單酶CLEA,多酶CLEAs的復(fù)雜性不僅僅在于酶種類的增加,也帶來了底物擴(kuò)散和中間產(chǎn)物通道等諸多問題[17-19]。因此,CLEA合成的調(diào)控技術(shù)成為設(shè)計(jì)和優(yōu)化酶催化體系的重要基礎(chǔ)。

    CLEA的制備通常包括沉淀和交聯(lián)兩個(gè)步驟[20-21],首先在無機(jī)鹽、水溶性有機(jī)溶劑、聚合物乃至有機(jī)酸等作用下溶液中的酶析出形成聚集體[8],聚集體與戊二醛、葡聚糖等交聯(lián)劑反應(yīng)生成不溶性CLEAs。沉淀方法和交聯(lián)劑對(duì)CLEAs中酶活性的影響雖已被廣泛地觀察,但少有涉及CLEAs尺寸和酶分子結(jié)構(gòu)[20,22]。CLEAs的尺寸乃至其中酶分子構(gòu)象與生物催化體系中底物擴(kuò)散、酶的生物活性和生物催化性能是密切相關(guān)的。

    本研究以葡萄糖氧化酶 (GOx) 為研究對(duì)象,考察了鈣離子對(duì)CLEAs尺寸的調(diào)控作用以及對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)、催化活性和CLEAs穩(wěn)定性的影響,從而為優(yōu)化葡萄糖氧化酶CLEA的合成提供指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    GOx酶購于Sigma公司;無水乙醇、十二水合磷酸氫二鈉 (Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O)、氯化鈣 (CaCl2) 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 均為購于本地的分析純?cè)噭?0% (V/V) 戊二醛和靛藍(lán)胭脂紅購于光復(fù)精細(xì)化工研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 GOx酶CLEA的制備

    GOx酶CLEA的制備步驟如下:稱取GOx酶4 mg置于1.5 mL離心管中,然后加入1 mL蒸餾水溶解,制得4 mg/mL的GOx酶溶液;稱取27.75 mg氯化鈣溶于1 mL蒸餾水中制得250 mmol/L的氯化鈣濃縮液,濃縮液經(jīng)蒸餾水依次稀釋制得濃度為25、2.5和0.25 mmol/L的氯化鈣工作液。然后,分別量取60 μL的GOx酶溶液置于5個(gè)1.5 mL離心管中后,再依次向GOx酶溶液中加入40 μL的蒸餾水和不同濃度的氯化鈣工作液,各離心管中鈣離子終濃度依次為100、10、1、0.1和0 mmol/L。上述溶液混合均勻后,加入900 μL無水乙醇并靜置30 min沉淀GOx酶,沉淀后向離心管中加入50% (V/V)的戊二醛各42 μL,在2% (V/V) 戊二醛終濃度下交聯(lián)3 h。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后,在3 000 r/min離心回收GOD酶CLEA并用蒸餾水反復(fù)置換除去殘留戊二醛、乙醇和游離鈣離子。制備的GOx酶CLEA經(jīng)LABCONCO FreeZone冷凍干燥機(jī)凍干后稱重,計(jì)算GOD酶CLEA的產(chǎn)率。使用前,將GOx酶CLEA溶解于600 μL的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中 (pH 7.0)。

    1.2.2 GOx酶CLEA活性測定

    GOx酶CLEA的活性采用靛藍(lán)胭脂紅褪色法測定[23]。過氧化氫濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法如下:向裝有5 mL含1 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中分別加入0、0.5、1、1.5、2和2.5 mL的10 mg/L過氧化氫溶液并用蒸餾水稀釋至15 mL配成過氧化氫濃度依次為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/L的靛藍(lán)胭脂紅溶液。上述溶液在沸水中煮沸10 min后用自來水冷卻至室溫,在波長615 nm處測定其吸光度,繪制過氧化氫濃度與靛藍(lán)胭脂紅吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    GOx酶CLEA活性測定方法如下:向裝有1 mL含5 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液;混合均勻并反應(yīng)1 min后,加入5 mL含1 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 并加蒸餾水稀釋至15 mL;上述溶液在沸水中煮沸10 min后用自來水冷卻至室溫,測定其在615 nm處吸光度。根據(jù)上述繪制的過氧化氫濃度與靛藍(lán)胭脂紅吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到過氧化氫的產(chǎn)量。GOx酶CLEA活性 (A) 通過下式計(jì)算,

    1.2.3 GOx酶CLEA催化底物轉(zhuǎn)化速率常數(shù)測定

    向6只分別裝有1 mL含5 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液,混合均勻后在25 ℃下反應(yīng)。反應(yīng)過程中每間隔10 min取出一支試管,向其中加入5 mL含1 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 并加蒸餾水稀釋至15 mL。上述溶液置于沸水中煮沸10 min后用自來水冷卻至室溫,測定其在615 nm處吸光度。根據(jù)過氧化氫濃度與靛藍(lán)胭脂紅吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到不同時(shí)刻過氧化氫產(chǎn)量,計(jì)算出相應(yīng)的葡萄糖消耗量。GOx酶CLEA的底物轉(zhuǎn)化速率由下式計(jì)算,

    1.2.4 GOx酶CLEA動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

    GOx酶CLEA的最大反應(yīng)速率(Vmax) 和米氏常數(shù)(Km) 采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法獲得[24]。首先,向分別裝有1 mL含5、10、15、20和25 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液;然后,依據(jù)GOx酶CLEA活性測定方法測定不同底物濃度下的轉(zhuǎn)化速率。最后,采用Lineweaver-Burk作圖法求出GOx酶CLEA的Km值和Vmax值。

    1.2.5 觀測GOx酶CLEA粒徑大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)

    GOx酶CLEA的粒徑和形態(tài)分別采用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡 (SEM) 進(jìn)行觀測。步驟如下:20 μL的GOx酶CLEA溶液均勻滴至載玻片上后,置于倒置顯微鏡下觀察本研究制備的GOx酶CLEA粒徑大小。此外,20 μL的GOx酶CLEA溶液均勻滴至錫箔紙上后自然風(fēng)干;風(fēng)干樣品噴金處理后在SEM下掃描CLEA的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GOx酶CLEA的制備和性質(zhì)

    不同鈣離子濃度下制備GOx酶CLEA的收率如圖1所示。從中可以看出,GOx酶CLEA收率隨著鈣離子濃度的升高而降低;當(dāng)GOx酶沉淀中鈣離子濃度達(dá)到100 mmol/L 時(shí),GOx酶CLEA得率僅為40.2%。這一得率遠(yuǎn)低于沒有鈣離子條件下的GOx酶CLEA得率 (對(duì)照CLEA,95.5%)。造成這一結(jié)果的原因可能在于如下兩個(gè)方面:鈣離子引入可能抑制了GOx酶分子間的聚集,促進(jìn)更小粒徑的GOx酶CLEA生成。最終結(jié)果是,離心和清洗條件下收集的GOx酶CLEA產(chǎn)品減少,損失增大。

    圖1 GOx酶CLEA收率隨鈣離子濃度的變化Fig. 1 Effect of calcium concentration on the CLEA yield of GOx enzyme.

    不同鈣離子濃度下制備的GOx酶CLEA形態(tài)如圖2所示。圖2 (A) 為0.0 mmol/L鈣離子濃度下GOx酶CLEA形態(tài),其不僅具有較大的聚集體尺寸,而且呈現(xiàn)出一定的透光性。但隨著沉淀過程中鈣離子的引入GOx酶CLEA不僅透光性逐步喪失而且聚集體的表觀尺寸 (粒徑)顯著減小。通常,較小的CLEA粒徑有利于底物的擴(kuò)散,進(jìn)而提高酶的催化效率。圖3中不同鈣離子濃度下制備的CLEA粒子表面的掃描電鏡 (SEM) 照片更清晰地顯示出這種變化。從SEM結(jié)果可以看出,鈣離子引起了GOx酶CLEA的納米孔道結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變。圖3A顯示,作為對(duì)照CLEA具有明顯的納米孔道結(jié)構(gòu)。當(dāng)鈣離子濃度由0.0增至1.0 mmol/L后,CLEA不僅粒子尺寸降低 (圖2C所示),CLEA粒子的納米孔道結(jié)構(gòu)也漸趨消失 (圖3C所示)。這種變化與光鏡下CLEA粒子透光性改變相一致。從上述顯微鏡結(jié)果可知,鈣離子濃度為0.1 mmol/L時(shí),GOx酶CLEA仍然具有明顯的納米孔道結(jié)構(gòu) (圖3B所示),從而有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散。同時(shí),酶分子呈現(xiàn)較為緊密的結(jié)合,有利于維持酶的穩(wěn)定性。此前,Wang等通過淀粉與木瓜蛋白酶的共沉淀獲得了更大的微米級(jí)孔道結(jié)構(gòu)以改善底物的傳遞[24]。隨著鈣離子濃度進(jìn)一步增大,CLEA粒子內(nèi)的納米孔道結(jié)構(gòu)漸趨消失 (圖3C-E)。

    圖2 光學(xué)顯微鏡下GOx酶CLEAs形態(tài)照片F(xiàn)ig. 2 CLEA to pographies of GOx enzymes. The concentrations of calcium were (A) 0.0 mmol/L, (B) 0.1 mmol/L, (C) 1.0 mmol/L, (D) 10 mmol/L and (E) 100 mmol/L.

    2.2 鈣離子對(duì)CLEA粒子GOx酶活性的影響

    在明確沉淀過程中鈣離子的引入對(duì)GOx酶CLEA形態(tài)和孔道結(jié)構(gòu)影響的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了這種變化對(duì)CLEA粒子GOx酶活性的影響。本文研究中定義對(duì)照CLEA粒子的GOx酶活性為100%。不同CLEA粒子中GOx酶的相對(duì)活性如圖4所示。CLEA酶活性分析中,反應(yīng)液內(nèi)無游離鈣離子,因此GOx酶活性變化與CLEA粒子尺寸及納米孔道結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。從圖4中可以看出,低鈣離子濃度下制備的CLEA粒子中GOx酶的活性顯著提高。相較于對(duì)照CLEA,鈣離子濃度為0.1 mmol/L條件下制備的CLEA粒子具有更高的GOx酶活性,其相對(duì)活性為對(duì)照CLEA的269% (圖4)。當(dāng)鈣離子濃度進(jìn)一步提高至1.0 mmol/L時(shí),制備的CLEA粒子中GOx酶活性仍比對(duì)照CLEA高42%。進(jìn)一步研究顯示,這種CLEA粒子中GOx酶活性的提高與鈣離子的結(jié)合密切相關(guān)。0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子經(jīng)10 mmol/L EDTA溶液處理除去結(jié)合鈣離子后,CLEA粒子GOx酶活性降低了56%。這一結(jié)果表明,低濃度鈣離子的引入不僅調(diào)控了CLEA粒子的尺寸和納米孔道結(jié)構(gòu),也對(duì)酶的活性位點(diǎn)起到了保護(hù)作用。這種保護(hù)作用很有可能是通過穩(wěn)定GOx酶構(gòu)象等方式實(shí)現(xiàn)的。

    圖3 GOx酶CLEA的SEMFig. 3 SEM images of GOx enzymes CLEA. The concentrations of calcium were (A) 0.0 mmol/L, (B) 0.1 mmol/L, (C) 1.0 mmol/L, (D) 10 mmol/L and (E) 100 mmol/L.

    2.3 CLEA粒子的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率

    在上述研究工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備CLEA粒子的GOx酶底物轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明,制備的CLEA粒子獲得了更高的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率,轉(zhuǎn)化速率達(dá)到0.28 mol/(g·h)。隨著葡萄糖的消耗,底物濃度降低,底物轉(zhuǎn)化速率逐步下降。而在相同條件下,對(duì)照CLEA粒子的底物轉(zhuǎn)化速率僅為0.10 mol/(g·h),并隨著催化反應(yīng)時(shí)間而降低。

    圖4 不同GOx酶CLEA的相對(duì)活性變化Fig. 4 Relative activities of CLEAs of GOx enzymes.

    圖5 CLEA的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率隨時(shí)間變化情況Fig. 5 The relationship of turnover rate of CLEA of GOx enzyme and time.

    GOx酶的CLEA粒子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的Lineweaver-Burk圖見圖6。結(jié)果顯示,CLEA粒子中GOx酶的Km值為51.06 mmol/L,僅略低于對(duì)照CLEA的Km值 (64.83 mmol/L)。與此同時(shí),0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子的GOx酶Vmax值達(dá)到81.30 mmol/(L·min),其顯著高于對(duì)照CLEA的34.48 mmol/(L·min)。這一結(jié)果不同于鈉鈣雙離子作用下以大分子淀粉為底物的α-淀粉酶的CLEA結(jié)果[9],表明鈣離子存在下的CLEA制備方法對(duì)于促進(jìn)小分子底物 (如葡萄糖等) 的反應(yīng)更加有利。

    CLEA粒子的穩(wěn)定性測定通過CLEA粒子重復(fù)催化相同濃度葡萄糖溶液的方法進(jìn)行測定,結(jié)果如圖7所示。從中可以看出,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA在重復(fù)使用過程中,酶的活性逐步降低,在重復(fù)使用8次后GOx酶活性損失了15%。相較于此,對(duì)照CLEA粒子在重復(fù)使用過程中酶活性的損失更為嚴(yán)重,重復(fù)使用8次后GOx酶活性降低了32%。這一結(jié)果顯示,引入鈣離子能夠起到穩(wěn)定GOx酶活性的作用。這也從另一側(cè)面進(jìn)一步驗(yàn)證了低濃度鈣離子的引入對(duì)GOx酶活性位點(diǎn)和分子構(gòu)象的保護(hù)作用。

    圖6 Ca2+對(duì)GOx酶CLEA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響Fig. 6 Effect of calcium ions on the CLEA kinetics of GOx enzyme.Cs is the concentration of the substrate.

    圖7 GOx酶CLEA活性隨催化次數(shù)的變化Fig. 7 Relationship of relative activity of CLEA and operational cycles.

    3 結(jié)論

    針對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控,以GOx酶為研究對(duì)象,系統(tǒng)地考察了鈣離子對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)以及酶催化性能和實(shí)用性的影響。研究結(jié)果表明,GOx酶沉淀過程中引入鈣離子顯著降低了CLEA粒子尺寸,同時(shí)CLEA粒子的納米孔道結(jié)構(gòu)也隨之漸趨消失。0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備CLEA粒子仍保有清晰的、有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散的納米孔道結(jié)構(gòu)。以葡萄糖為底物的GOx酶催化結(jié)果顯示,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子GOx酶活性為對(duì)照CLEA的2.69倍;即便1.0 mmol/L鈣離子濃度下制備的GOx酶CLEA活性仍高出對(duì)照CLEA 42%。此外,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子不僅具有更高的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率和很好的操作穩(wěn)定性,而且CLEA中GOx酶的最大反應(yīng)速率顯著提高。研究結(jié)果顯示,這歸功于鈣離子對(duì)GOx酶活性位點(diǎn)和酶分子構(gòu)象的保護(hù)作用。本文的研究結(jié)果明確了鈣離子對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用,為制備具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基礎(chǔ)。

    [1] Cao LQ, van Rantwijk F, Sheldon RA. Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase. Org Lett, 2000, 2(10): 1361-1364.

    [2] Quiocho FA, Richards FM. Intermolecular cross linking of a protein in the crystalline state: carboxypeptidase-A. Proc Natl Acad Sci USA, 1964, 52(3): 833-839.

    [3] Sheldon RA. Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 92(3): 467-477.

    [4] Brady D, Jordaan J. Advances in enzyme immobilisation. Biotechnol Lett, 2009, 31(11): 1639-1650.

    [5] Sheldon RA. Engineering a more sustainable world through catalysis and green chemistry. J R Soc Interface, 2016, 13(116), doi: 10.1098/rsif.2016.0087.

    [6] Gru?kien? R, Kairys V, Matijo?yt? I. CLEA-based immobilization of methylotropic yeast alcohol oxidase: influence on storage stability and reaction efficiency. Org Process Res Dev, 2015, 19(12): 2025-2033.

    [7] López-Serrano P, Cao L, van Rantwijk F, et al. Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases. Biotechnol Lett, 2002, 24(16): 1379-1383.

    [8] Talekar S, Joshi A, Joshi G, et al. Parameters in preparation and characterization of cross linked enzyme aggregates (CLEAs). RSC Adv, 2013, 3(31): 12485-12511.

    [9] Torabizadeh H, Tavakoli M, Safari M. Immobilization of thermostable α-amylase fromBacillus licheniformisby cross-linked enzyme aggregates method using calcium and sodium ions as additives. J Mol Catal B: Enzym, 2014, 108: 13-20.

    [10] Sheldon RA. Fundamentals of green chemistry: efficiency in reaction design. Chem Soc Rev, 2012, 41(4): 1437-1451.

    [11] Reetz MT. Biocatalysis in organic chemistryand biotechnology: past, present, and future. J Amer Chem Soc, 2013, 135(34): 12480-12496.

    [12] Cao LQ, van Langen L, Sheldon RA. Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free? Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(4): 387-394.

    [13] Mateo C, Chmura A, Rustler S, et al. Synthesis of enantiomerically pure (S)-mandelic acid using an oxynitrilase-nitrilase bienzymatic cascade: a nitrilase surprisingly shows nitrile hydratase activity. Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17(3): 320-323.

    [14] van Rantwijk F, Stolz A. Enzymatic cascade synthesis of (S)-2-hydroxycarboxylic amides and acids: cascade reactions employing a hydroxynitrile lyase, nitrile-converting enzymes and an amidase. J Mol Catal B: Enzym, 2015, 114: 25-30.

    [15] Chmura A, Rustler S, Paravidino M, et al. The combi-CLEA approach: enzymatic cascade synthesis of enantiomerically pure (S)-mandelic acid. Tetrahedron: Asymmetry, 2013, 24(19): 1225-1232.

    [16] Dalal S, Kapoor M, Gupta MN. Preparation and characterization of combi-CLEAs catalyzing multiple non-cascade reactions. J Mol Catal B: Enzym, 2007, 44(3/4): 128-132.

    [17] Zhang YHP. Substrate channeling and enzyme complexes for biotechnological applications. Biotechnol Adv, 2011, 29(6): 715-725.

    [18] Fu JL, Liu MH, Liu Y, et al. Interenzyme substrate diffusion for an enzyme cascade organized on spatially addressable DNA nanostructures. J Amer Chem Soc, 2012, 134(12): 5516-5519.

    [19] Sheldon RA, van Pelt S. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why, what and how. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6223-6235.

    [20] Schoevaart R, Wolbers MW, Golubovic M, et al. Preparation, optimization, and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). Biotechnol Bioeng, 2004, 87(6): 754-762.

    [21] Wang MF, Qi W, Su RX, et al. Advances in cross-linked enzyme aggregates. Prog Chem, 2010, 22(1): 173-178 (in Chinese).王夢凡, 齊崴, 蘇榮欣, 等. 交聯(lián)酶聚體技術(shù)研究進(jìn)展. 化學(xué)進(jìn)展, 2010, 22(1): 173-178.

    [22] Correia I, Aksu S, Ad?o P, et al. Vanadate substituted phytase: immobilization, structural characterization and performance for sulfoxidations. J Inorg Biochem, 2008, 102(2): 318-329

    [23] Zhou JQ, Chen SH, Wang JW. A simple and convenient method to determine the activity of glucose oxidase. Exp Technol Manage, 2008, 25(12): 58-60 (in Chinese).周建芹, 陳韶華, 王劍文. 測定葡萄糖氧化酶活力的一種簡便方法. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理, 2008, 25(12): 58-60.

    [24] Bu PP, Chen J, Du GC. Purification and characterization of a halophilic urethanase fromKlebsiella pneumoniae. Chin J Biotech, 2014, 30(3): 404?411 (in Chinese).卜攀攀, 陳堅(jiān), 堵國成. 耐鹽氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 404?411.

    [25] Wang MF, Jia CX, Qi W, et al. Porous-CLEAs of papain: application to enzymatic hydrolysis of macromolecules. Bioresour Technol, 2011, 102(3): 3541-3545.

    (本文責(zé)編 陳宏宇)

    Structural regulation by calcium ion in preparing cross-linked enzyme aggregates

    Xiaoqi Han1, Shu Bai1, and Qinghong Shi1,2
    1 School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300354, China
    2Key Laboratory of System Bioengineering of Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300354, China

    We studied the effect of calcium ion on particle size and pore structure of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of glucose oxidase, with activity and stability of the enzyme as evaluation criteria. With calcium ion to prepare CLEA significantly decreased particle sizes of CLEAs whilst the pore structures of CLEAs gradually disappeared with the increase of calcium concentration. When glucose oxidase was precipitated at 0.1 mmol/L Ca2+, glucose oxidase in CLEA showed the definitive pore structure. Moreover, glucose oxidase activity in CLEA with Ca2+was 1.69 times higher than that without Ca2+. Even at Ca2+as high as 1.0 mmol/L, glucose oxidase activity in CLEA was 42% higher than that of CLEA without Ca2+. Furthermore, CLEA prepared with 0.1 mmol/L Ca2+not only exhibited higher substrate conversion and operational stability, but also increased the maximum reaction speed. Therefore, calcium ion improved the performance of glucose oxidase in CLEAs.

    glucose oxidase, cross-linked enzyme aggregates, calcium ion, channeling for diffusion, turnover rate

    Qinghong Shi. Tel: +86-22-27403389; E-mail: qhshi@tju.edu.cn

    Received:April 16, 2016;Accepted:May 24, 2016

    Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 21276189, 21236005), Natural Science Foundation of Tianjin (No. 15JCYBJC48500).

    國家自然科學(xué)基金 (Nos. 21276189, 21236005),天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃 (No. 15JCYBJC48500) 資助。

    時(shí)間:2016-07-14

    http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160714.1436.002.html

    猜你喜歡
    結(jié)構(gòu)
    DNA結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)
    《形而上學(xué)》△卷的結(jié)構(gòu)和位置
    論結(jié)構(gòu)
    中華詩詞(2019年7期)2019-11-25 01:43:04
    新型平衡塊結(jié)構(gòu)的應(yīng)用
    模具制造(2019年3期)2019-06-06 02:10:54
    循環(huán)結(jié)構(gòu)謹(jǐn)防“死循環(huán)”
    論《日出》的結(jié)構(gòu)
    縱向結(jié)構(gòu)
    縱向結(jié)構(gòu)
    我國社會(huì)結(jié)構(gòu)的重建
    人間(2015年21期)2015-03-11 15:23:21
    創(chuàng)新治理結(jié)構(gòu)促進(jìn)中小企業(yè)持續(xù)成長
    欧美日韩一级在线毛片| 久久久精品免费免费高清| kizo精华| 天天操日日干夜夜撸| 免费不卡黄色视频| 久久精品国产综合久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 不卡av一区二区三区| 高清不卡的av网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久久久国产电影| 国产在视频线精品| 久热这里只有精品99| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费av中文字幕在线| 老司机在亚洲福利影院| 99久久99久久久精品蜜桃| 多毛熟女@视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜免费鲁丝| 一级毛片我不卡| 国产精品久久久久成人av| 久久九九热精品免费| 首页视频小说图片口味搜索 | 在现免费观看毛片| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲伊人色综图| 亚洲成人国产一区在线观看 | 婷婷丁香在线五月| 亚洲欧洲国产日韩| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩av不卡免费在线播放| 波野结衣二区三区在线| 午夜福利免费观看在线| 大陆偷拍与自拍| 成在线人永久免费视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 极品人妻少妇av视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费在线观看黄色视频的| 国产99久久九九免费精品| 免费看av在线观看网站| 大香蕉久久网| 欧美黄色淫秽网站| 手机成人av网站| 日韩电影二区| 香蕉丝袜av| 下体分泌物呈黄色| 只有这里有精品99| 90打野战视频偷拍视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久久久久国产电影| 99久久精品国产亚洲精品| 麻豆乱淫一区二区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品久久午夜乱码| 青青草视频在线视频观看| 国产精品免费大片| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美中文综合在线视频| 久久久精品94久久精品| 成人三级做爰电影| 天堂8中文在线网| 久久热在线av| 国产精品一区二区在线不卡| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| av国产久精品久网站免费入址| 国产一级毛片在线| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 老鸭窝网址在线观看| 悠悠久久av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 女性被躁到高潮视频| 丰满少妇做爰视频| 精品国产国语对白av| 国产精品一区二区精品视频观看| 新久久久久国产一级毛片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 男人添女人高潮全过程视频| 婷婷色av中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩一区二区三区影片| 男人舔女人的私密视频| 秋霞在线观看毛片| 亚洲专区国产一区二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜两性在线视频| 欧美日韩精品网址| 国产精品一二三区在线看| 久久久精品区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 捣出白浆h1v1| 色婷婷av一区二区三区视频| 91九色精品人成在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 看免费成人av毛片| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品国产av成人精品| 新久久久久国产一级毛片| 天天添夜夜摸| 国产成人免费观看mmmm| 国产成人免费无遮挡视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丝袜在线中文字幕| 中文字幕色久视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜两性在线视频| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品久久久久久精品古装| 一级黄片播放器| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中文字幕精品免费在线观看视频| 一本综合久久免费| 日韩一区二区三区影片| 婷婷成人精品国产| av福利片在线| 国产成人啪精品午夜网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| xxxhd国产人妻xxx| 下体分泌物呈黄色| 国产爽快片一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 国产日韩欧美在线精品| 天天影视国产精品| 波多野结衣av一区二区av| 国产在线观看jvid| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲av日韩在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品一二三区在线看| 国产真人三级小视频在线观看| 午夜福利,免费看| 天天添夜夜摸| 久久99一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 宅男免费午夜| 黄色视频不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久影院123| 国产精品一二三区在线看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美人与善性xxx| 51午夜福利影视在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美日韩黄片免| 国产免费又黄又爽又色| 国产成人精品久久久久久| 两人在一起打扑克的视频| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 满18在线观看网站| 亚洲欧洲国产日韩| 丰满少妇做爰视频| 无遮挡黄片免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品一区二区在线不卡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 黄片小视频在线播放| 老鸭窝网址在线观看| 少妇的丰满在线观看| 丝袜美足系列| 亚洲专区中文字幕在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成年人黄色毛片网站| 国产精品一区二区在线不卡| 老司机深夜福利视频在线观看 | 欧美人与性动交α欧美软件| 自线自在国产av| 亚洲国产精品999| 免费人妻精品一区二区三区视频| 搡老乐熟女国产| 老司机亚洲免费影院| 日本91视频免费播放| 五月开心婷婷网| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久久久久免费视频了| 久久久久久久精品精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 性色av一级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品免费久久久久久久清纯 | av在线播放精品| 亚洲中文字幕日韩| 99国产精品免费福利视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲久久久国产精品| 中文欧美无线码| www.精华液| 一二三四在线观看免费中文在| 精品视频人人做人人爽| 国产成人欧美| 久久毛片免费看一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 大码成人一级视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩视频在线欧美| 人体艺术视频欧美日本| 女警被强在线播放| 在线观看免费高清a一片| 国产日韩欧美视频二区| 国产91精品成人一区二区三区 | 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人一区二区在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 欧美97在线视频| 亚洲av国产av综合av卡| 成人影院久久| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲男人天堂网一区| 女警被强在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 人妻一区二区av| 成人国产av品久久久| 日韩大码丰满熟妇| 丁香六月欧美| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩电影二区| 18在线观看网站| 男男h啪啪无遮挡| 丁香六月天网| 国产精品 国内视频| 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 黑丝袜美女国产一区| 日韩av免费高清视频| 激情视频va一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 亚洲免费av在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品成人免费网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黄色a级毛片大全视频| 一区二区三区乱码不卡18| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲第一av免费看| 91精品三级在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 午夜老司机福利片| 丝袜脚勾引网站| 精品一区二区三卡| 在线看a的网站| 国产精品 欧美亚洲| 免费在线观看影片大全网站 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久热在线av| 国产在视频线精品| 久久精品久久久久久久性| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 视频区欧美日本亚洲| 欧美xxⅹ黑人| 成人午夜精彩视频在线观看| 九草在线视频观看| 人成视频在线观看免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 国产男人的电影天堂91| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久久久人人人人人| tube8黄色片| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲欧美精品自产自拍| 波多野结衣一区麻豆| 高清av免费在线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | √禁漫天堂资源中文www| 精品少妇久久久久久888优播| a 毛片基地| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产免费福利视频在线观看| 777米奇影视久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 又大又爽又粗| 脱女人内裤的视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 满18在线观看网站| 视频区图区小说| 国产高清videossex| 亚洲欧美清纯卡通| 蜜桃国产av成人99| 丝袜喷水一区| 五月开心婷婷网| 久久性视频一级片| 国产成人啪精品午夜网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 又紧又爽又黄一区二区| 涩涩av久久男人的天堂| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美精品av麻豆av| a级毛片黄视频| 97在线人人人人妻| 国产精品九九99| 国产精品成人在线| 男女边吃奶边做爰视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 晚上一个人看的免费电影| 久久天堂一区二区三区四区| 51午夜福利影视在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产精品一区二区精品视频观看| 91成人精品电影| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费在线观看日本一区| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产国语露脸激情在线看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 脱女人内裤的视频| 激情视频va一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美xxⅹ黑人| 七月丁香在线播放| 99久久综合免费| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久 成人 亚洲| 婷婷成人精品国产| 亚洲,欧美精品.| 一级片免费观看大全| 色综合欧美亚洲国产小说| 婷婷色综合www| 乱人伦中国视频| 午夜福利免费观看在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲精品国产一区二区精华液| 老司机亚洲免费影院| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黑丝袜美女国产一区| 又大又黄又爽视频免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩电影二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜91福利影院| 嫩草影视91久久| 亚洲av电影在线进入| 国产97色在线日韩免费| 国产日韩欧美视频二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久国产欧美日韩av| 手机成人av网站| 亚洲国产看品久久| 日本a在线网址| 狂野欧美激情性xxxx| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲伊人色综图| 国产高清不卡午夜福利| 少妇人妻久久综合中文| 丰满少妇做爰视频| 国产av一区二区精品久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 中文字幕高清在线视频| videos熟女内射| 午夜福利在线免费观看网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产精品一区三区| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 久久久国产一区二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲欧洲日产国产| 久久人人爽人人片av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 男人操女人黄网站| 中文字幕高清在线视频| 涩涩av久久男人的天堂| 天堂中文最新版在线下载| svipshipincom国产片| 日本91视频免费播放| 国产一区二区在线观看av| 悠悠久久av| 男女边摸边吃奶| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日本a在线网址| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品一区二区三卡| 男人操女人黄网站| 激情视频va一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| 少妇的丰满在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美日韩福利视频一区二区| 一区二区三区激情视频| 久久免费观看电影| 黄色视频在线播放观看不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av | 水蜜桃什么品种好| 男女床上黄色一级片免费看| 国产成人91sexporn| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久99一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 少妇的丰满在线观看| 18禁观看日本| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品免费视频内射| 99国产精品99久久久久| 亚洲国产精品999| 十分钟在线观看高清视频www| 日本五十路高清| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 人成视频在线观看免费观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲成色77777| 黄片播放在线免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 校园人妻丝袜中文字幕| 男女午夜视频在线观看| 国产精品 国内视频| 久久 成人 亚洲| 美女中出高潮动态图| 一区在线观看完整版| 国产一级毛片在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文字幕制服av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产一区二区 视频在线| 亚洲国产精品国产精品| 久久精品成人免费网站| 9191精品国产免费久久| 十八禁网站网址无遮挡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久精品久久久久久久性| 欧美激情高清一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日本色播在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产成人系列免费观看| 超色免费av| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一级毛片 在线播放| 亚洲熟女毛片儿| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 丝袜在线中文字幕| 人成视频在线观看免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 考比视频在线观看| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 丝袜人妻中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 亚洲男人天堂网一区| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美 日韩 精品 国产| 美女大奶头黄色视频| 精品高清国产在线一区| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品人妻久久久影院| 欧美在线黄色| 午夜老司机福利片| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久国产精品人妻一区二区| 成在线人永久免费视频| 一级毛片我不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产在线一区二区三区精| 香蕉国产在线看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 人体艺术视频欧美日本| 一级毛片女人18水好多 | 久久久国产一区二区| 国产主播在线观看一区二区 | 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲美女黄色视频免费看| 手机成人av网站| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日本av手机在线免费观看| h视频一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 超碰成人久久| 波野结衣二区三区在线| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 麻豆国产av国片精品| 国产爽快片一区二区三区| 久久九九热精品免费| 久热爱精品视频在线9| 国产成人精品久久二区二区91| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲一码二码三码区别大吗| av电影中文网址| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久天堂一区二区三区四区| 国产亚洲欧美精品永久| tube8黄色片| e午夜精品久久久久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成人黄色视频免费在线看| 国产日韩欧美视频二区| 麻豆av在线久日| 欧美日韩av久久| 国产精品成人在线| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 水蜜桃什么品种好| 天天操日日干夜夜撸| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品久久久精品久久久| 免费高清在线观看日韩| 国产成人a∨麻豆精品| 啦啦啦 在线观看视频| 精品高清国产在线一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 老汉色∧v一级毛片| 国产一区二区三区av在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久99精品国语久久久| 午夜两性在线视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久国产精品影院| 99精品久久久久人妻精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产高清视频在线播放一区 | 后天国语完整版免费观看| 亚洲三区欧美一区| 在线观看免费日韩欧美大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄色 视频免费看| 首页视频小说图片口味搜索 | 国产成人91sexporn| 涩涩av久久男人的天堂| 一本色道久久久久久精品综合| 波多野结衣av一区二区av| 91麻豆av在线| 欧美黑人精品巨大| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美黑人欧美精品刺激| av电影中文网址| 欧美xxⅹ黑人| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品久久蜜臀av无| 青春草视频在线免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜福利乱码中文字幕| 男女高潮啪啪啪动态图| 黄片小视频在线播放| xxxhd国产人妻xxx| videosex国产| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲人成电影观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| av福利片在线|