韓笑奇,白姝,史清洪,2
1 天津大學(xué) 化工學(xué)院,天津 300354
2 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300354
交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用
韓笑奇1,白姝1,史清洪1,2
1 天津大學(xué) 化工學(xué)院,天津 300354
2 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300354
韓笑奇, 白姝, 史清洪. 交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(12): 1676?1684.
Han XQ, Bai S, Shi QH. Structural regulation by calcium ion in preparing cross-linked enzyme aggregates. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1676?1684.
以葡萄糖氧化酶 (GOx) 為研究對(duì)象,系統(tǒng)地研究了鈣離子對(duì)交聯(lián)酶聚集體 (CLEA) 粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用以及酶催化性能和實(shí)用性的影響。研究結(jié)果表明,GOx酶沉淀過程中引入鈣離子可顯著降低CLEA粒子尺寸并導(dǎo)致粒子內(nèi)納米孔道結(jié)構(gòu)逐步消失。在0.1 mmol/L鈣離子濃度下,GOx酶的CLEA仍保有清晰的納米孔道結(jié)構(gòu)。以葡萄糖為底物的GOx酶CLEA催化結(jié)果顯示,該CLEA粒子的酶活性為對(duì)照CLEA粒子的2.69倍。即便1.0 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子的GOx酶活性仍高出對(duì)照CLEA粒子約 42%。此外,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA不僅具有更高的底物轉(zhuǎn)化速率和很好的操作穩(wěn)定性,而且CLEA中GOx酶的最大反應(yīng)速度顯著提高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了鈣離子對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用,為制備具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基礎(chǔ)。
葡萄糖氧化酶,交聯(lián)聚集體酶,鈣離子,擴(kuò)散通道,轉(zhuǎn)化速率
交聯(lián)酶聚集體 (Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs) 是本世紀(jì)初在交聯(lián)酶晶體 (Cross-linked enzyme crystals,CLECs) 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型無(wú)載體固定化酶技術(shù)[1]。相較于CLEC中利用復(fù)雜的酶分子晶體制備固定化酶的方法[2],CLEA通過更加簡(jiǎn)便易行的物理沉淀方法使酶分子聚集,進(jìn)而通過戊二醛等交聯(lián)而成穩(wěn)定的超分子結(jié)構(gòu)。因其對(duì)酶純度要求低、制備方法簡(jiǎn)單、聚集體穩(wěn)定性高且易于回收和重復(fù)利用等諸多優(yōu)點(diǎn),單酶CLEA技術(shù)在生物催化和生物分離等領(lǐng)域展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景并得到了系統(tǒng)地研究[3-6]。López-Serrano等利用硫酸銨和十二烷基硫酸鈉聯(lián)合沉淀方法制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體具有高于天然脂肪酶1-2倍的催化活性[7]。此后,聚集體粒徑和結(jié)構(gòu)、聚集體穩(wěn)定性等影響CLEA性能的參數(shù)和工藝條件也得到了系統(tǒng)地考察[8]。2014年,Torabizadeh等提出引入鈉鈣雙離子聚集酶分子的陽(yáng)離子輔助聚集策略。但結(jié)果顯示,α-淀粉酶沉淀中鈉鈣雙離子的存在改善了CLEA的穩(wěn)定性并些許提高了淀粉底物的親和性[9]。相比于單酶催化,生物體內(nèi)更為普遍的代謝產(chǎn)物合成都是通過兩個(gè)或多個(gè)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成的[10-11]。Sheldon教授課題組于2003年提出了多酶CLEAs的“combi-CLEAs”概念[12],進(jìn)而制備了級(jí)聯(lián)催化 (S)-扁桃酰胺合成的 (S)-醇腈酶和腈水解酶雙酶CLEA[13]。此后,該方法也被用于構(gòu)建包括級(jí)聯(lián)[14-15]和非級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]在內(nèi)的多酶催化體系。相對(duì)于單酶CLEA,多酶CLEAs的復(fù)雜性不僅僅在于酶種類的增加,也帶來(lái)了底物擴(kuò)散和中間產(chǎn)物通道等諸多問題[17-19]。因此,CLEA合成的調(diào)控技術(shù)成為設(shè)計(jì)和優(yōu)化酶催化體系的重要基礎(chǔ)。
CLEA的制備通常包括沉淀和交聯(lián)兩個(gè)步驟[20-21],首先在無(wú)機(jī)鹽、水溶性有機(jī)溶劑、聚合物乃至有機(jī)酸等作用下溶液中的酶析出形成聚集體[8],聚集體與戊二醛、葡聚糖等交聯(lián)劑反應(yīng)生成不溶性CLEAs。沉淀方法和交聯(lián)劑對(duì)CLEAs中酶活性的影響雖已被廣泛地觀察,但少有涉及CLEAs尺寸和酶分子結(jié)構(gòu)[20,22]。CLEAs的尺寸乃至其中酶分子構(gòu)象與生物催化體系中底物擴(kuò)散、酶的生物活性和生物催化性能是密切相關(guān)的。
本研究以葡萄糖氧化酶 (GOx) 為研究對(duì)象,考察了鈣離子對(duì)CLEAs尺寸的調(diào)控作用以及對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)、催化活性和CLEAs穩(wěn)定性的影響,從而為優(yōu)化葡萄糖氧化酶CLEA的合成提供指導(dǎo)。
1.1 材料
GOx酶購(gòu)于Sigma公司;無(wú)水乙醇、十二水合磷酸氫二鈉 (Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O)、氯化鈣 (CaCl2) 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 均為購(gòu)于本地的分析純?cè)噭?0% (V/V) 戊二醛和靛藍(lán)胭脂紅購(gòu)于光復(fù)精細(xì)化工研究所。
1.2 方法
1.2.1 GOx酶CLEA的制備
GOx酶CLEA的制備步驟如下:稱取GOx酶4 mg置于1.5 mL離心管中,然后加入1 mL蒸餾水溶解,制得4 mg/mL的GOx酶溶液;稱取27.75 mg氯化鈣溶于1 mL蒸餾水中制得250 mmol/L的氯化鈣濃縮液,濃縮液經(jīng)蒸餾水依次稀釋制得濃度為25、2.5和0.25 mmol/L的氯化鈣工作液。然后,分別量取60 μL的GOx酶溶液置于5個(gè)1.5 mL離心管中后,再依次向GOx酶溶液中加入40 μL的蒸餾水和不同濃度的氯化鈣工作液,各離心管中鈣離子終濃度依次為100、10、1、0.1和0 mmol/L。上述溶液混合均勻后,加入900 μL無(wú)水乙醇并靜置30 min沉淀GOx酶,沉淀后向離心管中加入50% (V/V)的戊二醛各42 μL,在2% (V/V) 戊二醛終濃度下交聯(lián)3 h。交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后,在3 000 r/min離心回收GOD酶CLEA并用蒸餾水反復(fù)置換除去殘留戊二醛、乙醇和游離鈣離子。制備的GOx酶CLEA經(jīng)LABCONCO FreeZone冷凍干燥機(jī)凍干后稱重,計(jì)算GOD酶CLEA的產(chǎn)率。使用前,將GOx酶CLEA溶解于600 μL的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中 (pH 7.0)。
1.2.2 GOx酶CLEA活性測(cè)定
GOx酶CLEA的活性采用靛藍(lán)胭脂紅褪色法測(cè)定[23]。過氧化氫濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法如下:向裝有5 mL含1 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中分別加入0、0.5、1、1.5、2和2.5 mL的10 mg/L過氧化氫溶液并用蒸餾水稀釋至15 mL配成過氧化氫濃度依次為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/L的靛藍(lán)胭脂紅溶液。上述溶液在沸水中煮沸10 min后用自來(lái)水冷卻至室溫,在波長(zhǎng)615 nm處測(cè)定其吸光度,繪制過氧化氫濃度與靛藍(lán)胭脂紅吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
GOx酶CLEA活性測(cè)定方法如下:向裝有1 mL含5 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液;混合均勻并反應(yīng)1 min后,加入5 mL含1 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 并加蒸餾水稀釋至15 mL;上述溶液在沸水中煮沸10 min后用自來(lái)水冷卻至室溫,測(cè)定其在615 nm處吸光度。根據(jù)上述繪制的過氧化氫濃度與靛藍(lán)胭脂紅吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到過氧化氫的產(chǎn)量。GOx酶CLEA活性 (A) 通過下式計(jì)算,
1.2.3 GOx酶CLEA催化底物轉(zhuǎn)化速率常數(shù)測(cè)定
向6只分別裝有1 mL含5 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液,混合均勻后在25 ℃下反應(yīng)。反應(yīng)過程中每間隔10 min取出一支試管,向其中加入5 mL含1 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 并加蒸餾水稀釋至15 mL。上述溶液置于沸水中煮沸10 min后用自來(lái)水冷卻至室溫,測(cè)定其在615 nm處吸光度。根據(jù)過氧化氫濃度與靛藍(lán)胭脂紅吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到不同時(shí)刻過氧化氫產(chǎn)量,計(jì)算出相應(yīng)的葡萄糖消耗量。GOx酶CLEA的底物轉(zhuǎn)化速率由下式計(jì)算,
1.2.4 GOx酶CLEA動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
GOx酶CLEA的最大反應(yīng)速率(Vmax) 和米氏常數(shù)(Km) 采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法獲得[24]。首先,向分別裝有1 mL含5、10、15、20和25 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液;然后,依據(jù)GOx酶CLEA活性測(cè)定方法測(cè)定不同底物濃度下的轉(zhuǎn)化速率。最后,采用Lineweaver-Burk作圖法求出GOx酶CLEA的Km值和Vmax值。
1.2.5 觀測(cè)GOx酶CLEA粒徑大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)
GOx酶CLEA的粒徑和形態(tài)分別采用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡 (SEM) 進(jìn)行觀測(cè)。步驟如下:20 μL的GOx酶CLEA溶液均勻滴至載玻片上后,置于倒置顯微鏡下觀察本研究制備的GOx酶CLEA粒徑大小。此外,20 μL的GOx酶CLEA溶液均勻滴至錫箔紙上后自然風(fēng)干;風(fēng)干樣品噴金處理后在SEM下掃描CLEA的結(jié)構(gòu)形態(tài)。
2.1 GOx酶CLEA的制備和性質(zhì)
不同鈣離子濃度下制備GOx酶CLEA的收率如圖1所示。從中可以看出,GOx酶CLEA收率隨著鈣離子濃度的升高而降低;當(dāng)GOx酶沉淀中鈣離子濃度達(dá)到100 mmol/L 時(shí),GOx酶CLEA得率僅為40.2%。這一得率遠(yuǎn)低于沒有鈣離子條件下的GOx酶CLEA得率 (對(duì)照CLEA,95.5%)。造成這一結(jié)果的原因可能在于如下兩個(gè)方面:鈣離子引入可能抑制了GOx酶分子間的聚集,促進(jìn)更小粒徑的GOx酶CLEA生成。最終結(jié)果是,離心和清洗條件下收集的GOx酶CLEA產(chǎn)品減少,損失增大。
圖1 GOx酶CLEA收率隨鈣離子濃度的變化Fig. 1 Effect of calcium concentration on the CLEA yield of GOx enzyme.
不同鈣離子濃度下制備的GOx酶CLEA形態(tài)如圖2所示。圖2 (A) 為0.0 mmol/L鈣離子濃度下GOx酶CLEA形態(tài),其不僅具有較大的聚集體尺寸,而且呈現(xiàn)出一定的透光性。但隨著沉淀過程中鈣離子的引入GOx酶CLEA不僅透光性逐步喪失而且聚集體的表觀尺寸 (粒徑)顯著減小。通常,較小的CLEA粒徑有利于底物的擴(kuò)散,進(jìn)而提高酶的催化效率。圖3中不同鈣離子濃度下制備的CLEA粒子表面的掃描電鏡 (SEM) 照片更清晰地顯示出這種變化。從SEM結(jié)果可以看出,鈣離子引起了GOx酶CLEA的納米孔道結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變。圖3A顯示,作為對(duì)照CLEA具有明顯的納米孔道結(jié)構(gòu)。當(dāng)鈣離子濃度由0.0增至1.0 mmol/L后,CLEA不僅粒子尺寸降低 (圖2C所示),CLEA粒子的納米孔道結(jié)構(gòu)也漸趨消失 (圖3C所示)。這種變化與光鏡下CLEA粒子透光性改變相一致。從上述顯微鏡結(jié)果可知,鈣離子濃度為0.1 mmol/L時(shí),GOx酶CLEA仍然具有明顯的納米孔道結(jié)構(gòu) (圖3B所示),從而有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散。同時(shí),酶分子呈現(xiàn)較為緊密的結(jié)合,有利于維持酶的穩(wěn)定性。此前,Wang等通過淀粉與木瓜蛋白酶的共沉淀獲得了更大的微米級(jí)孔道結(jié)構(gòu)以改善底物的傳遞[24]。隨著鈣離子濃度進(jìn)一步增大,CLEA粒子內(nèi)的納米孔道結(jié)構(gòu)漸趨消失 (圖3C-E)。
圖2 光學(xué)顯微鏡下GOx酶CLEAs形態(tài)照片F(xiàn)ig. 2 CLEA to pographies of GOx enzymes. The concentrations of calcium were (A) 0.0 mmol/L, (B) 0.1 mmol/L, (C) 1.0 mmol/L, (D) 10 mmol/L and (E) 100 mmol/L.
2.2 鈣離子對(duì)CLEA粒子GOx酶活性的影響
在明確沉淀過程中鈣離子的引入對(duì)GOx酶CLEA形態(tài)和孔道結(jié)構(gòu)影響的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了這種變化對(duì)CLEA粒子GOx酶活性的影響。本文研究中定義對(duì)照CLEA粒子的GOx酶活性為100%。不同CLEA粒子中GOx酶的相對(duì)活性如圖4所示。CLEA酶活性分析中,反應(yīng)液內(nèi)無(wú)游離鈣離子,因此GOx酶活性變化與CLEA粒子尺寸及納米孔道結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。從圖4中可以看出,低鈣離子濃度下制備的CLEA粒子中GOx酶的活性顯著提高。相較于對(duì)照CLEA,鈣離子濃度為0.1 mmol/L條件下制備的CLEA粒子具有更高的GOx酶活性,其相對(duì)活性為對(duì)照CLEA的269% (圖4)。當(dāng)鈣離子濃度進(jìn)一步提高至1.0 mmol/L時(shí),制備的CLEA粒子中GOx酶活性仍比對(duì)照CLEA高42%。進(jìn)一步研究顯示,這種CLEA粒子中GOx酶活性的提高與鈣離子的結(jié)合密切相關(guān)。0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子經(jīng)10 mmol/L EDTA溶液處理除去結(jié)合鈣離子后,CLEA粒子GOx酶活性降低了56%。這一結(jié)果表明,低濃度鈣離子的引入不僅調(diào)控了CLEA粒子的尺寸和納米孔道結(jié)構(gòu),也對(duì)酶的活性位點(diǎn)起到了保護(hù)作用。這種保護(hù)作用很有可能是通過穩(wěn)定GOx酶構(gòu)象等方式實(shí)現(xiàn)的。
圖3 GOx酶CLEA的SEMFig. 3 SEM images of GOx enzymes CLEA. The concentrations of calcium were (A) 0.0 mmol/L, (B) 0.1 mmol/L, (C) 1.0 mmol/L, (D) 10 mmol/L and (E) 100 mmol/L.
2.3 CLEA粒子的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率
在上述研究工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備CLEA粒子的GOx酶底物轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明,制備的CLEA粒子獲得了更高的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率,轉(zhuǎn)化速率達(dá)到0.28 mol/(g·h)。隨著葡萄糖的消耗,底物濃度降低,底物轉(zhuǎn)化速率逐步下降。而在相同條件下,對(duì)照CLEA粒子的底物轉(zhuǎn)化速率僅為0.10 mol/(g·h),并隨著催化反應(yīng)時(shí)間而降低。
圖4 不同GOx酶CLEA的相對(duì)活性變化Fig. 4 Relative activities of CLEAs of GOx enzymes.
圖5 CLEA的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率隨時(shí)間變化情況Fig. 5 The relationship of turnover rate of CLEA of GOx enzyme and time.
GOx酶的CLEA粒子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的Lineweaver-Burk圖見圖6。結(jié)果顯示,CLEA粒子中GOx酶的Km值為51.06 mmol/L,僅略低于對(duì)照CLEA的Km值 (64.83 mmol/L)。與此同時(shí),0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子的GOx酶Vmax值達(dá)到81.30 mmol/(L·min),其顯著高于對(duì)照CLEA的34.48 mmol/(L·min)。這一結(jié)果不同于鈉鈣雙離子作用下以大分子淀粉為底物的α-淀粉酶的CLEA結(jié)果[9],表明鈣離子存在下的CLEA制備方法對(duì)于促進(jìn)小分子底物 (如葡萄糖等) 的反應(yīng)更加有利。
CLEA粒子的穩(wěn)定性測(cè)定通過CLEA粒子重復(fù)催化相同濃度葡萄糖溶液的方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖7所示。從中可以看出,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA在重復(fù)使用過程中,酶的活性逐步降低,在重復(fù)使用8次后GOx酶活性損失了15%。相較于此,對(duì)照CLEA粒子在重復(fù)使用過程中酶活性的損失更為嚴(yán)重,重復(fù)使用8次后GOx酶活性降低了32%。這一結(jié)果顯示,引入鈣離子能夠起到穩(wěn)定GOx酶活性的作用。這也從另一側(cè)面進(jìn)一步驗(yàn)證了低濃度鈣離子的引入對(duì)GOx酶活性位點(diǎn)和分子構(gòu)象的保護(hù)作用。
圖6 Ca2+對(duì)GOx酶CLEA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響Fig. 6 Effect of calcium ions on the CLEA kinetics of GOx enzyme.Cs is the concentration of the substrate.
圖7 GOx酶CLEA活性隨催化次數(shù)的變化Fig. 7 Relationship of relative activity of CLEA and operational cycles.
針對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控,以GOx酶為研究對(duì)象,系統(tǒng)地考察了鈣離子對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)以及酶催化性能和實(shí)用性的影響。研究結(jié)果表明,GOx酶沉淀過程中引入鈣離子顯著降低了CLEA粒子尺寸,同時(shí)CLEA粒子的納米孔道結(jié)構(gòu)也隨之漸趨消失。0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備CLEA粒子仍保有清晰的、有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散的納米孔道結(jié)構(gòu)。以葡萄糖為底物的GOx酶催化結(jié)果顯示,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子GOx酶活性為對(duì)照CLEA的2.69倍;即便1.0 mmol/L鈣離子濃度下制備的GOx酶CLEA活性仍高出對(duì)照CLEA 42%。此外,0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子不僅具有更高的GOx酶底物轉(zhuǎn)化速率和很好的操作穩(wěn)定性,而且CLEA中GOx酶的最大反應(yīng)速率顯著提高。研究結(jié)果顯示,這歸功于鈣離子對(duì)GOx酶活性位點(diǎn)和酶分子構(gòu)象的保護(hù)作用。本文的研究結(jié)果明確了鈣離子對(duì)CLEA粒子尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用,為制備具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基礎(chǔ)。
[1] Cao LQ, van Rantwijk F, Sheldon RA. Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase. Org Lett, 2000, 2(10): 1361-1364.
[2] Quiocho FA, Richards FM. Intermolecular cross linking of a protein in the crystalline state: carboxypeptidase-A. Proc Natl Acad Sci USA, 1964, 52(3): 833-839.
[3] Sheldon RA. Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 92(3): 467-477.
[4] Brady D, Jordaan J. Advances in enzyme immobilisation. Biotechnol Lett, 2009, 31(11): 1639-1650.
[5] Sheldon RA. Engineering a more sustainable world through catalysis and green chemistry. J R Soc Interface, 2016, 13(116), doi: 10.1098/rsif.2016.0087.
[6] Gru?kien? R, Kairys V, Matijo?yt? I. CLEA-based immobilization of methylotropic yeast alcohol oxidase: influence on storage stability and reaction efficiency. Org Process Res Dev, 2015, 19(12): 2025-2033.
[7] López-Serrano P, Cao L, van Rantwijk F, et al. Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases. Biotechnol Lett, 2002, 24(16): 1379-1383.
[8] Talekar S, Joshi A, Joshi G, et al. Parameters in preparation and characterization of cross linked enzyme aggregates (CLEAs). RSC Adv, 2013, 3(31): 12485-12511.
[9] Torabizadeh H, Tavakoli M, Safari M. Immobilization of thermostable α-amylase fromBacillus licheniformisby cross-linked enzyme aggregates method using calcium and sodium ions as additives. J Mol Catal B: Enzym, 2014, 108: 13-20.
[10] Sheldon RA. Fundamentals of green chemistry: efficiency in reaction design. Chem Soc Rev, 2012, 41(4): 1437-1451.
[11] Reetz MT. Biocatalysis in organic chemistryand biotechnology: past, present, and future. J Amer Chem Soc, 2013, 135(34): 12480-12496.
[12] Cao LQ, van Langen L, Sheldon RA. Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier-free? Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(4): 387-394.
[13] Mateo C, Chmura A, Rustler S, et al. Synthesis of enantiomerically pure (S)-mandelic acid using an oxynitrilase-nitrilase bienzymatic cascade: a nitrilase surprisingly shows nitrile hydratase activity. Tetrahedron: Asymmetry, 2006, 17(3): 320-323.
[14] van Rantwijk F, Stolz A. Enzymatic cascade synthesis of (S)-2-hydroxycarboxylic amides and acids: cascade reactions employing a hydroxynitrile lyase, nitrile-converting enzymes and an amidase. J Mol Catal B: Enzym, 2015, 114: 25-30.
[15] Chmura A, Rustler S, Paravidino M, et al. The combi-CLEA approach: enzymatic cascade synthesis of enantiomerically pure (S)-mandelic acid. Tetrahedron: Asymmetry, 2013, 24(19): 1225-1232.
[16] Dalal S, Kapoor M, Gupta MN. Preparation and characterization of combi-CLEAs catalyzing multiple non-cascade reactions. J Mol Catal B: Enzym, 2007, 44(3/4): 128-132.
[17] Zhang YHP. Substrate channeling and enzyme complexes for biotechnological applications. Biotechnol Adv, 2011, 29(6): 715-725.
[18] Fu JL, Liu MH, Liu Y, et al. Interenzyme substrate diffusion for an enzyme cascade organized on spatially addressable DNA nanostructures. J Amer Chem Soc, 2012, 134(12): 5516-5519.
[19] Sheldon RA, van Pelt S. Enzyme immobilisation in biocatalysis: why, what and how. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6223-6235.
[20] Schoevaart R, Wolbers MW, Golubovic M, et al. Preparation, optimization, and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). Biotechnol Bioeng, 2004, 87(6): 754-762.
[21] Wang MF, Qi W, Su RX, et al. Advances in cross-linked enzyme aggregates. Prog Chem, 2010, 22(1): 173-178 (in Chinese).王夢(mèng)凡, 齊崴, 蘇榮欣, 等. 交聯(lián)酶聚體技術(shù)研究進(jìn)展. 化學(xué)進(jìn)展, 2010, 22(1): 173-178.
[22] Correia I, Aksu S, Ad?o P, et al. Vanadate substituted phytase: immobilization, structural characterization and performance for sulfoxidations. J Inorg Biochem, 2008, 102(2): 318-329
[23] Zhou JQ, Chen SH, Wang JW. A simple and convenient method to determine the activity of glucose oxidase. Exp Technol Manage, 2008, 25(12): 58-60 (in Chinese).周建芹, 陳韶華, 王劍文. 測(cè)定葡萄糖氧化酶活力的一種簡(jiǎn)便方法. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理, 2008, 25(12): 58-60.
[24] Bu PP, Chen J, Du GC. Purification and characterization of a halophilic urethanase fromKlebsiella pneumoniae. Chin J Biotech, 2014, 30(3): 404?411 (in Chinese).卜攀攀, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成. 耐鹽氨基甲酸乙酯水解酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 404?411.
[25] Wang MF, Jia CX, Qi W, et al. Porous-CLEAs of papain: application to enzymatic hydrolysis of macromolecules. Bioresour Technol, 2011, 102(3): 3541-3545.
(本文責(zé)編 陳宏宇)
Structural regulation by calcium ion in preparing cross-linked enzyme aggregates
Xiaoqi Han1, Shu Bai1, and Qinghong Shi1,2
1 School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300354, China
2Key Laboratory of System Bioengineering of Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300354, China
We studied the effect of calcium ion on particle size and pore structure of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of glucose oxidase, with activity and stability of the enzyme as evaluation criteria. With calcium ion to prepare CLEA significantly decreased particle sizes of CLEAs whilst the pore structures of CLEAs gradually disappeared with the increase of calcium concentration. When glucose oxidase was precipitated at 0.1 mmol/L Ca2+, glucose oxidase in CLEA showed the definitive pore structure. Moreover, glucose oxidase activity in CLEA with Ca2+was 1.69 times higher than that without Ca2+. Even at Ca2+as high as 1.0 mmol/L, glucose oxidase activity in CLEA was 42% higher than that of CLEA without Ca2+. Furthermore, CLEA prepared with 0.1 mmol/L Ca2+not only exhibited higher substrate conversion and operational stability, but also increased the maximum reaction speed. Therefore, calcium ion improved the performance of glucose oxidase in CLEAs.
glucose oxidase, cross-linked enzyme aggregates, calcium ion, channeling for diffusion, turnover rate
Qinghong Shi. Tel: +86-22-27403389; E-mail: qhshi@tju.edu.cn
Received:April 16, 2016;Accepted:May 24, 2016
Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 21276189, 21236005), Natural Science Foundation of Tianjin (No. 15JCYBJC48500).
國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 21276189, 21236005),天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃 (No. 15JCYBJC48500) 資助。
時(shí)間:2016-07-14
http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160714.1436.002.html