CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測在創(chuàng)傷性肺損傷中的作用①

潘鴻錦，劉銀環(huán)，陳 輝，洪國粦

(福州市第二醫(yī)院胸外科， 福建 福州 350007)

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CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測在創(chuàng)傷性肺損傷中的作用①

潘鴻錦，劉銀環(huán)，陳 輝，洪國粦

(福州市第二醫(yī)院胸外科， 福建 福州 350007)

目的：探究CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測在創(chuàng)傷性肺損傷中作用及臨床意義。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合直接免疫熒光法檢測30例創(chuàng)傷性肺損傷患者外周血T細(xì)胞表面CXCR3和CD4+CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平。結(jié)果：創(chuàng)傷性肺損傷患者趨化因子受體CXCR3表達(dá)陽性率明顯高于正常對照組，分別為(35.72±3.49)%和(12.19±3.89)%(P<0.05)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+、CD25+ 、CD127low)陽性率明顯低于正常對照組，分別為(11.27±1.59)%和(13.75±1.72)%(P<0.05)。結(jié)論：CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可參與創(chuàng)傷性肺損傷炎癥的發(fā)生和發(fā)展，有可能為疾病的預(yù)防和治療提供新思路和新途徑。

CXCR3；CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；創(chuàng)傷性肺損傷

創(chuàng)傷性肺損傷是創(chuàng)傷患者中較常見的并發(fā)癥之一，以呼吸困難、 難治性低氧血癥和非心源性肺水腫為臨床特征。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤以及激活及血管內(nèi)皮損傷是肺損傷的重要表現(xiàn)，而且肺損傷在分子水平表現(xiàn)上，主要體現(xiàn)在：眾多促炎因子、粘附分子以及趨化因子的表達(dá)水品過高，并且往往伴隨多種炎性介質(zhì)(炎性級聯(lián)反應(yīng)——因炎性介質(zhì)產(chǎn)生，容易導(dǎo)致肺組織廣泛損傷)的產(chǎn)生。另外，肺損傷發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，因此，探究CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測在創(chuàng)傷性肺損傷中作用及臨床意義具有重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。為此，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測30例創(chuàng)傷性肺損傷外周血CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的水平，探討CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在創(chuàng)傷性肺損傷表達(dá)特點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2013-11～2016-01門診和重癥ICU 30例創(chuàng)傷性肺損傷患者作為本次調(diào)查的研究對象， 30例健康體檢組。患者組30例中，男19例，女11例，年齡27～86歲，平均(49.7±3.5)歲；健康體檢組30例患者中，男18例，女12例，年齡26～85歲，平均(49.0±3.7)歲。本次調(diào)查研究的所有患者均符合創(chuàng)傷性肺損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)(1992歐美聯(lián)席會議通過的診斷標(biāo)準(zhǔn))，并且所有患者在臨床醫(yī)療之前，簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑：IgG1-FITC同型對照、IgG1-PE同型對照、IgG1- PC7同型對照、IgG1-ECD同型對照、CD3-PE、CXCR3-FITC、CD45-PC7、CD4- PE、 CD25-ECD、 CD127-PC7、FACS lysing solution等，本次調(diào)查研究所使用的試劑均由美國BD公司提供。

1.2.2 T直接免疫熒光標(biāo)記法檢測淋巴細(xì)胞表面CXCR3水平。首先，選取2支試管，即試管1、試管2。然后，將100μL的全血放置于試管中，并且在試管1中添加10μL的IgG1-FITC、10μL的IgG1-PE以及10μL的CD45- PC7；在試管2中添加10μL的 CD3-PE、10μL的CXCR3-FITC以及10μL的CD45-PC7，將2支試管均室溫避光30min；隨后，在溫室避光后的2支試管中添加2mL 1×溶血素，再室溫避光10min，待溶血徹底完成之后，采取1000r/min離心5min，并且棄用上清，最后，利用2mL PBS洗滌2遍，并且重懸于0.5mL PBS中，進(jìn)行最后的上機(jī)檢測。

1.2.3 T直接免疫熒光標(biāo)記法檢測淋巴細(xì)胞表面CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 。首先，選取2支試管，即試管1、試管2。然后，將100μL的全血放置于試管中，并且在試管1中添加10μL的 IgG1-ECD、10μL的IgG1-PE以及10μL的IgG1- PC7，在試管2中添加10μL的 CD4-PE、10μL的CD25- ECD以及10μL的CD127- PC7，將2支試管均室溫避光30min，其他操作與淋巴細(xì)胞表面CXCR3水平測試方法相同。

1.2.4 淋巴細(xì)胞群檢測分析(使用側(cè)向散射角(SSC)及CD45設(shè)門法)，確定檢測細(xì)胞數(shù)—10 000個，然后，利用CELLQuest軟件，對CD3+T淋巴細(xì)胞中CXCR3+細(xì)胞的百分率以及CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分率進(jìn)行計(jì)算分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)：CXCR3與創(chuàng)傷性肺損傷程度呈正相關(guān)關(guān)系，即：CXCR3表達(dá)水平越高，則創(chuàng)傷性肺損傷程度越重；CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平與創(chuàng)傷性肺損傷程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即：CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平越高，則創(chuàng)傷性肺損傷程度越輕。趨化因子受體CXCR3和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+CD127low)表達(dá)水平在創(chuàng)傷性肺損傷過度炎癥反應(yīng)中具有重要作用；為臨床早期判斷創(chuàng)傷性肺損傷和預(yù)后觀察提供新指標(biāo)，為臨床治療方案提供新的理論依據(jù)。兩組患者的CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low的陽性率。見表1。

表1 兩組的CXCR3和CD4+CD25+CD127low的陽性率

另外，CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測結(jié)果見圖1～2。

圖1 CXCR3檢測結(jié)果

圖2 CD4+ CD25+ CD127low檢測結(jié)果

3 討論

創(chuàng)傷性肺損傷的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，涉及失控性炎癥反應(yīng)、凝血/纖溶系統(tǒng)失衡、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、肺泡液體清除異常等多個層面。其中，眾多參與炎癥的細(xì)胞和細(xì)胞因子起著關(guān)鍵作用并成為目前肺損傷發(fā)病機(jī)制研究熱點(diǎn)，但缺少對肺損傷時(shí)免疫狀態(tài)改變及免疫調(diào)節(jié)的深入研究，因此，本課題組將利用流式細(xì)胞術(shù)檢測創(chuàng)傷性肺損傷患者外周血T細(xì)胞表面CXCR3和CD4+CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平，從而反映肺損傷時(shí)免疫狀態(tài)及免疫調(diào)節(jié)的改變特點(diǎn)，揭示他們在肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，通過本研究或許能為臨床診斷和預(yù)后觀察提供免疫學(xué)的輔助指標(biāo)。

趨化因子受體CXCR3是趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的共受體(由368個氨基酸組成)，臨床研究證實(shí)，趨化因子受體CXCR3屬于七次跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)G蛋白偶聯(lián)受體超家族之一，且主要分布在活化的Th1淋巴細(xì)胞上，其次分布在B細(xì)胞、NK細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞上。多年的臨床研究表明：移植排斥反應(yīng)、炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展與CXCR3水平具有密切的聯(lián)系[3]，而且本次調(diào)查研究的結(jié)果顯示：外周血T淋巴細(xì)胞CXCR3的表達(dá)水平與創(chuàng)傷并ALI呈正相關(guān)關(guān)系，且與健康對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 這提示CXCR3與其配體結(jié)合趨化Th1淋巴細(xì)胞及炎癥細(xì)胞向肺部遷移、聚集，并產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)，造成肺部炎癥；CXCR3 的高表達(dá)能夠分泌出更多的炎癥介質(zhì)TNF-α和IFN -γ(可能誘導(dǎo)更多的淋巴細(xì)胞集聚) ，繼而導(dǎo)致炎癥的維持、發(fā)展乃至蔓延，最終導(dǎo)致肺部失控性炎癥。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞本質(zhì)上是一組T細(xì)胞亞群(具有免疫調(diào)節(jié)功能)，而且CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞除能夠真實(shí)的反映出CD4分子和 CD25 分子水平之外，其高表達(dá)能夠有效的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(Foxp3 已被證實(shí)是調(diào)節(jié) T 細(xì)胞最可靠及特異的標(biāo)志，CD127也可視為其可靠及特異的標(biāo)志)[4]。另外，相關(guān)研究證實(shí)：CD127 表達(dá)水平與FOXP3 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[5]，因此， CD127 的低表達(dá)可視為其可靠及特異的標(biāo)志，能夠代替FOXP3，以便檢測調(diào)節(jié) T 細(xì)胞水平，并且CD127+CD4+CD25+CD127 能夠提升Treg 水平檢測的準(zhǔn)確性。除此之外，CD127+CD4+CD25+CD127的顯著特征為無反應(yīng)性和免疫抑制,因此，能夠在調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持自身免疫耐受等方面起到重要的推動作用。本研究顯示，創(chuàng)傷并ALI患者外周血中CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表達(dá)明顯低于健康者，這充分的彰顯出：ALI時(shí)機(jī)體的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)揮了重要作用，而且對免疫反應(yīng)無抑制作用，因此，可能可能會加重炎癥反應(yīng)，從而加劇肺損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明了CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平與創(chuàng)傷性肺損傷之間的相關(guān)性，也反映出：趨化因子受體CXCR3和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+CD127low)表達(dá)水平在創(chuàng)傷性肺損傷過度炎癥反應(yīng)中具有重要作用。這與已有報(bào)道的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[6]。因此可以將檢測CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)水平視為創(chuàng)傷性肺損傷病情診斷和觀察的輔助指標(biāo)，此方面的研究可為今后治療、預(yù)后估計(jì)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。鑒于本實(shí)驗(yàn)研究參與調(diào)查的病例少，其結(jié)果只能是初步的觀察，因而還需要進(jìn)一步更深入的研究。

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福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目，編號：2013-S-W5。

潘鴻錦(1965～)男，福建福州人，學(xué)士，主任醫(yī)師。

R563.8

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1008-0104(2016)06-0089-02

2016-05-10)