丹參素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

任清松，李瑞婷，夏良鋒，門茂元，杜偉達(dá)，欒海艷

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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丹參素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

任清松，李瑞婷，夏良鋒，門茂元，杜偉達(dá)，欒海艷

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究丹參素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。方法：用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞，并將其分為A，B和C組。A 組被置于5.5mmol/L 低糖的DMEM 培養(yǎng)基中；B組和C 組則被置于25mmol/L高糖的DMEM 培養(yǎng)基中，與此同時(shí)C組加入0.2mg/mL丹參素進(jìn)行藥物干預(yù)48h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)變化；免疫組織熒光技術(shù)檢測(cè)CK18、α-SMA 和Vimentin的蛋白表達(dá)。結(jié)果：①細(xì)胞形態(tài)變化：A組細(xì)胞呈多邊形或圓形，胞核也呈現(xiàn)橢圓形或圓形；B組的絕大多數(shù)細(xì)胞已失去原有形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，且胞核也呈梭形變；C組的大部分細(xì)胞仍保持到原有的上皮細(xì)胞形態(tài)，僅少量呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形改變。②CK-18、α-SMA和Vimentin 蛋白的表達(dá)：與N組相比，B 組的CK-18蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，α-SMA 和Vimentin的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；而與H 組相比，C組的CK-18蛋白表達(dá)則明顯上升(P<0.05)，α-SMA 和Vimentin的蛋白表達(dá)則明顯下降(P<0.05)，但與N 組相比，仍有明顯差異(P<0.05)，未達(dá)到正常水平。結(jié)論：丹參素能通過升高CK-18和降低α-SMA、Vimentin 的蛋白表達(dá)來抑制高糖環(huán)境對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)作用。

丹參素；腎小管上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)分化

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN) 是最常見的糖尿病慢性并發(fā)癥，是由長(zhǎng)期高血糖所引起的慢性進(jìn)展性腎臟疾病，也是糖尿病患者最常見的器官并發(fā)癥之一，其腎功能的下降程度與腎小管及其間質(zhì)纖維化的關(guān)系極其密切。尤其是近些年來，隨著糖尿病腎病發(fā)生率的逐年上升，導(dǎo)致腎臟慢性疾病(Chronic renal disease，CRD) 的患病率也逐年提高，業(yè)已成為致使糖尿病患者死亡率升高的主要誘因之一，但其發(fā)病機(jī)制至目前為止仍未完全明了。故而明確糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)預(yù)防或延緩其發(fā)病有著十分重要的臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。本研究項(xiàng)目擬采用使腎小管上皮細(xì)胞處于高糖環(huán)境，由高糖誘導(dǎo)使其發(fā)生轉(zhuǎn)分化，然后給予中藥丹參素(danshensu, DSS) 進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，以期為臨床應(yīng)用丹參素治療糖尿病腎病提供充分的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床治療糖尿病腎病提供一個(gè)新的治療途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2) 購(gòu)于上海信裕生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

丹參素(購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，藥物純度：98.0 %)；DMEM 培養(yǎng)基(購(gòu)于Hyclone, USA)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, 購(gòu)于Gibco, USA)；α-SMA(購(gòu)于上海亞培生物科技有限公司)；CK-18、Vimentin(購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

用含10 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞于37℃，5 % CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到融合狀態(tài)(即鋪滿瓶壁80%～90%以上)時(shí)，采用0.05%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，按1:3～1:6密度接種傳代，并取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

實(shí)驗(yàn)共分3組：正常糖對(duì)照組(A組)；高糖對(duì)照組(B組)；丹參素組(C組)。

1.2.2 給藥方案

正常糖對(duì)照組被置于5.5mmol/L低糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖對(duì)照組和丹參素組均被置于25mmol/L高糖的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；但丹參素組同時(shí)加入丹參素(0.2mg/mL) 進(jìn)行藥物干預(yù)48h。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

于倒置顯微鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變情況；免疫組織熒光技術(shù)檢測(cè)CK-18、α-SMA 和Vimentin 的蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，所有數(shù)據(jù)均以表示；組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

正常糖對(duì)照組：細(xì)胞呈多邊形或圓形，胞核也呈現(xiàn)橢圓形或圓形；高糖對(duì)照組：絕大多數(shù)細(xì)胞已失去原有形態(tài)，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，且胞核也呈梭形變；丹參素組：大部分細(xì)胞仍保持到原有的上皮細(xì)胞形態(tài)，僅少量細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形改變。

2.2 CK-18、α-SMA和Vimentin的表達(dá)

與正常糖對(duì)照組相比，高糖對(duì)照組細(xì)胞的CK-18蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；而與高糖對(duì)照組相比，丹參素組則明顯上升(P<0.05)，但與正常糖對(duì)照組相比，仍有明顯差異(P<0.05)。見表1。

與正常糖對(duì)照組相比，高糖對(duì)照組的α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；而與高糖對(duì)照組相比，丹參素組則明顯降低(P<0.05)，但與正常糖對(duì)照組相比，仍未達(dá)到正常水平(P<0.05)。見表1。

表1 CK-18、α-SMA和Vimentin在各組中的表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞比率，

A組vs B組，*P <0.05；A組vs C組，#P <0.05。

3 討論

研究表明，無論從發(fā)病時(shí)間或機(jī)制來說，腎小管結(jié)構(gòu)或功能的改變對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展均具有十分重要的作用。腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度與糖尿病腎病的腎功能損害密切相關(guān)，是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)。腎小管及其間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制主要是細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix, ECM) 的分泌與降解失衡，此外還有成纖維細(xì)胞的增生，以及腎小管的萎縮和消失[1]，其中ECM的增多更是直接導(dǎo)致了腎纖維化的進(jìn)行性發(fā)展。肌成纖維細(xì)胞是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生過程中產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，但正常腎組織中幾乎沒有肌成纖維細(xì)胞，大量的研究表明腎小管上皮細(xì)胞在病理?xiàng)l件下則可發(fā)生轉(zhuǎn)分化成為肌成纖維細(xì)胞，喪失了上皮細(xì)胞黏附特性，即表皮黏附分子—E-cadherin 的表達(dá)減少；而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin) 等間充質(zhì)細(xì)胞表型蛋白表達(dá)增多[2,3]。

丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.) 是藥理活性廣泛、高效、低毒的化合物，能夠拮抗動(dòng)脈粥樣硬化，改善由缺血缺氧所引起的細(xì)胞代謝障礙，改善微循環(huán)障礙，保護(hù)心肌細(xì)胞[4]，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[5]，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，保護(hù)肝臟細(xì)胞及防治肝臟的纖維化[6]。此外，丹參在對(duì)腎結(jié)構(gòu)和功能也有十分顯著的影響，能清除腎組織中的氧自由基，進(jìn)而保護(hù)腎血管內(nèi)皮細(xì)胞；通過降低血黏稠度，抑制血小板聚集，來改善腎臟的血液微循環(huán)；增加SOD 的表達(dá)活性，降低空腹血糖和糖化血紅蛋白的水平，抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化，內(nèi)源性膽固醇(Ch)、Ⅳ型膠原和血漿內(nèi)皮素的合成[7]，最終改善糖尿病腎病的糖脂代謝紊亂[8]。丹參注射液還能下調(diào)大鼠腎皮質(zhì)層黏連蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)水平，改善由阿霉素所致的腎小球硬化；降低腎梗阻手術(shù)后梗阻側(cè)大鼠腎臟α-SMA 和TGF-β1 的表達(dá)水平，并減少Ⅰ型膠原蛋白的沉積，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。雖然丹參對(duì)糖尿病腎病和腎纖維化有一定的療效，但作為一種組成成分復(fù)雜的傳統(tǒng)中藥，對(duì)其發(fā)揮防治作用的最佳活性成分和具體作用機(jī)制的研究并不十分清楚和透徹，這就造成了丹參的使用效率不高和藥物副作用較大的弊端。因此，本研究著重選取了丹參主要的水溶性成分—丹參素作為我們的研究對(duì)象。我們的研究發(fā)現(xiàn)丹參素具有抑制高糖環(huán)境對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)作用，減少腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為成纖維細(xì)胞的比率，維持腎小管上皮細(xì)胞的正常形態(tài)。與糖尿病模型組相比，丹參素組腎小管上皮細(xì)胞當(dāng)中的CK-18 蛋白表達(dá)升高，而Vimentin、α-SMA 的蛋白表達(dá)降低，所以丹參素對(duì)高糖環(huán)境對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的抑制作用可能是通過抑制上皮細(xì)胞的特異蛋白CK-18 表達(dá)的降低和Vimentin、α-SMA 的蛋白升高來實(shí)現(xiàn)的。這不但為丹參防治糖尿病腎病提供了更有力的理論依據(jù)，也提高了其利用效率，并降低其副作用，更好的發(fā)揮了祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的作用。

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佳木斯大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：2014xj03。

任清松(1991～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士。

欒海艷(1979～)女，黑龍江佳木斯人，博士，講師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:luanhaiyan@jmsu.edu.cn。

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1008-0104(2016)06-0070-02

2016-06-19)