Vinculin和GFAP在大鼠肝纖維化中纖維母細胞的表達

張 輝,劉東璞,李 堯，王景霞，王淑英

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

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Vinculin和GFAP在大鼠肝纖維化中纖維母細胞的表達

張 輝,劉東璞,李 堯，王景霞，王淑英

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

目的:肝臟內(nèi)有兩種纖維母細胞,一種稱之為肝星形細胞(hepatic stellate cell HSC),另一種是位于門脈周圍的纖維母細胞。對這兩種細胞在形成肝纖維化(hepatic fibrosis HF)后的細胞形態(tài)采用免疫組化方法進行組織學鑒別。方法: Wistar大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(160～210)g。隨機選取24只,分為4組，每組6只，使用30% CCl4/mineral oil(1mL/kg)行腹腔內(nèi)注射,并且分別于注射1d，2d，3d，4d后麻醉處死，取新鮮肝臟。其余24只,同樣隨機分為4組，每組6只 ,分別行膽總管結(jié)扎術(shù)1d,2d,4d,7d后麻醉處死，取新鮮肝臟。用SABC法來進行檢測，一抗分別為Vinculin及GFAP。結(jié)果:CCl4腹腔注射后2d中央靜脈周圍的HSCs在Vinculin和GFAP染色中呈相同的強陽性表達; BDL處置4d后門脈區(qū)纖維母細胞在Vinculin染色中顯示陽性結(jié)果,而在GFAP染色中呈現(xiàn)陰性結(jié)果。結(jié)論: Vinculin在HSCs和門脈區(qū)域的纖維母細胞陽性表達結(jié)果相同, GFAP可對有活性的HSCs和門脈區(qū)域的纖維母細胞進行檢測鑒別。

肝星形細胞;肝纖維化;CCl4;BDL; Vinculin;GFAP

肝纖維化是繼發(fā)于肝臟各種慢性損傷之后進行組織修復過程中的創(chuàng)傷愈合反應,而且它也是形成肝硬化所必經(jīng)的病理過程。經(jīng)研究顯示,HSCs的激活與增生在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起到了極其重要的作用[1]。并且經(jīng)研究表明,HSCs在肝纖維化過程中屬于關(guān)鍵介導環(huán)節(jié)。用四氯化碳誘導的方法來制作Wistar大鼠急性肝損害模型,能夠?qū)е虏⒂^察到細胞外基質(zhì)的形態(tài)變化[2]。而且根據(jù)相關(guān)報道顯示，用膽總管結(jié)扎術(shù)誘導的方法來制作Wistar大鼠急性肝損害模型,使門脈周圍的纖維母細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞[3]。在對這兩種細胞群進行比較分析發(fā)現(xiàn), HSC的細胞質(zhì)內(nèi)的脂滴內(nèi)含有維生素A,而在門脈周圍的纖維母細胞內(nèi)卻沒有觀察到,因此在形態(tài)學上可以利用此特點對二者進行分析鑒別,但是在形成肝纖維化后，從形態(tài)學角度上已經(jīng)不能區(qū)分這兩類細胞群。本研究首先用兩種方法制作大鼠急性肝損害模型,而后采用免疫組化方法對HSC和門脈周圍的肌纖維母細胞形態(tài)進行檢測和觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(160～210)g。由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑

Vinculin單抗、GFAP單抗、SABC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝纖維化動物模型的制作

Wistar大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(160～210)g。隨機選取24只,分為4組，每組6只，使用30% CCl4/mineral oil(1mL/kg)行腹腔內(nèi)注射,并且分別于注射1d，2d，3d，4d后麻醉處死，取新鮮肝臟。其余24只,同樣隨機分為4組，每組6只 ,分別行膽總管結(jié)扎術(shù)1d,2d,4d,7d后麻醉處死，取新鮮肝臟。

1.2.2 肝組織病理學觀察及免疫組化染色

摘除的肝臟進行常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,常規(guī)HE染色后進行病理學觀察肝纖維化程度。而后,運用免疫組織化學方法進行染色,所用一抗為Vinculin和GFAP。其染色結(jié)果由兩名經(jīng)驗豐富的病理學專家觀察并評估各組染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GFAP免疫組化結(jié)果

在CCl4注射后所形成的大鼠急性肝損害模型中，注射2d后，對中心靜脈周圍的HSC進行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)GFAP 強陽性染色(圖1)。在對BDL方法所形成的大鼠肝纖維化模型的觀察中，在對肝實質(zhì)周邊以及位于膽小管增生區(qū)域的HSCs進行觀察發(fā)現(xiàn)， GFAP表達呈現(xiàn)弱陽性，而在對門脈區(qū)域內(nèi)的纖維母細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)其 GFAP呈現(xiàn) 陰性表達(圖2)。

圖1 GFAP在CCl4注射2d后的表達(×400)

圖2 GFAP在BDL處置2d后的表達(×400)

圖3 Vinculin在CCl4注射1d后的表達(×400)

圖5 Vinculin在CCl4注射3d后的表達(×400)

圖6 Vinculin在BDL處置2d后的表達(×400)

圖7 Vinculin在BDL處置4d后的表達(×400)

2.2 Vinculin免疫組化結(jié)果

在CCl4注射后所形成的大鼠急性肝損害模型中，注射一天后，發(fā)現(xiàn)HSCs的表達呈現(xiàn)弱陽性(圖3)；而注射2d后，對中央靜脈附近區(qū)域的HSC進行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)Vinculin強陽性表達(圖4)；而在

注射3d后，對肝實質(zhì)內(nèi)的HSCs進行觀察，發(fā)現(xiàn)其Vinculin表達呈現(xiàn)弱陽性(圖5)。而在對BDL方法所形成的大鼠肝纖維化模型的觀察中，并且在BDL 2d(圖6)及4d(圖7)后，對門脈區(qū)域內(nèi)已活化的纖維母細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)Vinculin陽性表達。

3 討論

肝纖維化是由多方因素協(xié)同作用所導致的慢性肝損害病理改變，其主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細胞外基質(zhì)成分的沉積量有所失衡[4]，而且可以對肝的正常功能有所損害，在各種臨床慢性肝病發(fā)展為肝硬化的過程中，肝纖維化屬于其所必經(jīng)的階段。本研究利用CCl4腹腔注射及BDL兩種實驗方法制作急性大鼠肝損害模型，并制備病理切片標本，使用免疫組化方法對Vinculin和GFAP在大鼠肝纖維化中纖維母細胞的表達進行檢測。

經(jīng)病理組織學切片觀察顯示，在CCl4肝纖維化模型組中，腹腔注射2d后，對中心靜脈周圍的HSCs進行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)GFAP 強陽性染色；而對中央靜脈附近區(qū)域的HSCs進行觀察，發(fā)現(xiàn)Vinculin同樣呈現(xiàn)強陽性表達。而在BDL大鼠肝纖維化模型中，在行BDL術(shù)4d 后，對門脈區(qū)域內(nèi)的纖維母細胞進行觀察，未發(fā)現(xiàn)GFAP有陽性細胞表達，呈現(xiàn)GFAP陰性。在對門脈纖維母細胞的觀察中發(fā)現(xiàn)，并且對門脈以及增生的膽小管上皮細胞間隙中進行觀察，發(fā)現(xiàn)門脈纖維母細胞可轉(zhuǎn)化為MF。同時對門脈區(qū)域和肝實質(zhì)細胞進行觀察，在其間發(fā)現(xiàn)有已經(jīng)活化的HSCs，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)Vinculin陽性表達，從此可以證明Vinculin抗體可以成為門脈區(qū)域纖維母細胞被活化的一種標記。

CCl4肝纖維化模型以及BDL肝纖維化模型，這兩種實驗方法雖然有所不同，但在處置并形成肝纖維化后，對HSCs和門脈區(qū)域纖維母細胞進行免疫組化染色并進行比較觀察，發(fā)現(xiàn)Vinculin染色均呈現(xiàn)陽性表達，而GFAP染色表達卻有所差別。由此可知，對成功的肝纖維化模型制作常規(guī)病理石蠟切片標本，在對有活性的HSCs和門脈纖維母細胞之間進行鑒別分析，GFAP抗體可以作為檢測這兩種纖維母細胞的一個指標。

[1]Fowell AJ, Collins JE, Duncombe DR, et al. Silencing tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs) with short interfering RNA reveals a role for TIMP-1 in hepatic stellate cell proliferation[J].Biochem biophys Res commun, 2011,407(2):277-282

[2]Friedman SL.Seminars in medicine of the Beth Hospital,Boston.The cellular basis of the hepatic fibrosis,mechanisms and treatment strategies[J].N Engl J Med,1993,328:1828-1835

[3]Desmouliere A,Darby I,Costa AMA,et al.Extracellular matrix deposition, lysyl oxidation expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat[J].Lab Invest,1997,76:765-778

[4]Zhao J,Zhang Z,Luan Y, et al. Pathological functions of interleukin-22 in chronic liver inflammation and fibrosis with hepatitis B virus infection by promoting T helper 17 cell recruitment [J]. Hepatology, 2014,59(4):1331-1342

1.黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題,編號:2011-428；2.佳木斯大學指導項目，編號：S2009-074。

張輝(1976～)男,黑龍江佳木斯人,碩士,副教授。

劉東璞(1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士,副教授,碩士研究生導師。E-mail:liudongpu1220@163.com。

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1008-0104(2016)06-0022-02

2016-07-11)