小牛血清去蛋白提取物的常用分析方法

孫秀娥

(吉林工程技術(shù)師范學(xué)院,吉林 長春130052)

在常用的分析方法中,高效液相色譜法可分析游離氨基酸含量;毛細(xì)管區(qū)帶電泳可得到產(chǎn)品的指紋圖譜;液質(zhì)聯(lián)用可測出初步的相對(duì)分子質(zhì)量信息;加熱、烘烤、酸堿處理、萃取、接種微生物發(fā)酵等方法可以幫助推測產(chǎn)品中成分組成。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中同位素標(biāo)記法可測脂肪生成增加率;微量減壓技術(shù)可測產(chǎn)品促進(jìn)豚鼠肝勻漿耗氧量,得到呼吸活性分析。

丁亞軍,王瑩等對(duì)小牛血清去蛋白提取物的藥理、毒理作用進(jìn)行研究,并將其主要成分和活性指標(biāo)與愛維治比較。研究結(jié)果表明兩藥對(duì)比差異無顯著性。

李愛菊,鄭宏強(qiáng),熊愛琴用異硫氰酸苯酯(Isothiocyanate,PITC)柱前衍生高效液相色譜法(HPLC法)測定小牛血清去蛋白提取物制劑中游離氨基酸。

任淑萍對(duì)小牛血清去蛋白注射液與小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比較研究,采用HPLC法進(jìn)行鑒定分析,用Lowry法測定多肽含量,用瓦氏微量呼吸檢壓儀測定呼吸活力并計(jì)算刺激指數(shù),測定兩者對(duì)小鼠耐缺氧試驗(yàn)的不同影響時(shí)間,比較兩者在主要成分、多肽含量、生物活性等方面的差異。趙宗閣,王尊文等在國內(nèi)小牛血、小牛血清去蛋白提取物注射液質(zhì)量分析及其抗缺氧作用研究中,采用Lowry法測定多肽含量,PITC作為衍生劑的高效液相色譜法測定游離總氨基酸,瓦氏呼吸實(shí)驗(yàn)測定其促進(jìn)豚鼠肝勻漿呼吸活性,HPLC法鑒定雙峰肽圖。體外抗缺氧實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測定其對(duì)缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用。體內(nèi)抗缺氧實(shí)驗(yàn)以小鼠常壓耐缺氧時(shí)間評(píng)價(jià)其抗缺氧能力。

張榮立,王洪新等將小牛血清去蛋白提取物進(jìn)行加熱、加酸、加堿、烘烤、有機(jī)溶劑萃取、接種微生物發(fā)酵等方法處理,然后分別用微量呼吸檢壓法檢測呼吸活性。并據(jù)此推測小牛血清去蛋白提取物中的活性物質(zhì)可能是一種活性脂類。

虞惟俊對(duì)小牛血及血清去蛋白提取物注射液的質(zhì)量控制方法研究,采用了反相高效液相色譜(Reverse phase high－performance liquid,RP－HPLC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)和液質(zhì)聯(lián)用(LC－MS)等分析方法。

任麗萍,虞惟俊等分別采用反相高效液相色譜(RP－HPLC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、液質(zhì)聯(lián)用(LCMS)對(duì)小牛血清去蛋白提取物的特征圖譜進(jìn)行研究。

任麗萍,鄧?yán)甑炔捎没鹧嬖游辗y定小牛血去蛋白提取物濃溶液中的鈉離子和鉀離子,采用原子吸收分光光度法,以氯化銫為電離抑制劑,于589.3nm處對(duì)鈉離子含量進(jìn)行測定;在766.5nm波長處測定鉀離子含量。

薛巧如,鄧鋒等通過超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC/QTOF－MS)方法對(duì)小分子肽類及片段進(jìn)行種屬來源鑒定,并通過已有蛋白質(zhì)庫分析,對(duì)愛維治等15批樣品中肽段進(jìn)行鑒定和比較分析。采用ACQUITY UPLC液相色譜儀,BEH130 C182.1μm×1.7μm,150 mm 色譜柱,以0.1%甲酸溶液－0.1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相梯度洗脫,體積流量0.2m L/min,數(shù)據(jù)采集軟件為Masslynx,數(shù)據(jù)處理軟件為Protein Lynx。樣品中找到牛源性肽段,部分樣品有PEG污染。建立的UPLC/QTOF－MS方法可作為樣品質(zhì)量分析的一個(gè)參考。

董玲玉,杜宏明等在熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針檢測藥物中單磷酸腺苷的方法研究中,認(rèn)為單磷酸腺苷(A-denosine monophosphate,AMP)是小牛血清去蛋白提取物的活性成份之一。研究發(fā)現(xiàn)AMP能夠引起該探針在526nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度的猝滅并且AMP的濃度與探針的熒光強(qiáng)度的Stern－Volmer曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.996,該探針能夠應(yīng)用于藥品中AMP的檢測。研究證實(shí)小牛血清去蛋白提取物中已經(jīng)確定存在的活性成份主要有肌醇、單磷酸腺苷、幾種單糖,初步發(fā)現(xiàn)存在活性成份膽酸和神經(jīng)鞘磷脂,目前研究在進(jìn)一步明確藥物成份。

[1]任淑萍.小牛血清去蛋白注射液與小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比較[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2006,(08).

[2]張榮立,王洪新,楊菁等.小牛血清去蛋白提取物活性物質(zhì)理化性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,(04).

[3]虞惟俊.小牛血及血清去蛋白提取物注射液的質(zhì)量控制方法研究[D].上海：東華大學(xué),2008.

[4]任麗萍,虞惟俊,廖海明等.采用 HPLC、CZE、LC/MS法對(duì)國內(nèi)外小牛血及小牛血清去蛋白注射液的特征圖譜分析[J].藥物分析雜志,2009,(02).

[5]任麗萍,鄧?yán)?范慧紅.火焰原子吸收法測定小牛血去蛋白提取物濃溶液中的鈉離子和鉀離子[J].藥物分析雜志,2014,(04).

[6]薛巧如,鄧鋒,梁蔚陽.UPLC－QTOF質(zhì)譜分析小牛血去蛋白提取物的多肽來源及組成[J].藥物生物技術(shù),2015,(02).

[7]董玲玉,杜宏明,王鵬等.熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針檢測藥物中單磷酸腺苷的方法研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2015,(11).

[8]國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂件[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2014,(01).