補(bǔ)血生津顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立

毛盛芳

（江西省南昌市洪都中醫(yī)院制劑中心，南昌 330008）

補(bǔ)血生津顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立

毛盛芳

（江西省南昌市洪都中醫(yī)院制劑中心，南昌 330008）

目的 建立補(bǔ)血生津顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 用薄層色譜法(TLC)對補(bǔ)血生津顆粒中的黃芪、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測定補(bǔ)血生津顆粒中當(dāng)歸的主要活性成分阿魏酸的含量，結(jié)果 TLC法專屬性強(qiáng)，斑點(diǎn)清晰；HPLC法測當(dāng)歸中阿魏酸的含量，條件適宜，分離效果好，阿魏酸在0.0382～0.382 ug范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為94.0%，RSD值為0.37%。結(jié)論 所建立的方法專屬性強(qiáng)，操作簡單，穩(wěn)定靈敏，重現(xiàn)性好，可作為補(bǔ)血生津顆粒的質(zhì)量控制方法。

補(bǔ)血生津顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；黃芪；當(dāng)歸

補(bǔ)血生津顆粒是由黃芪、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、熟地黃等八味中藥材組成，主要有益氣，補(bǔ)血，養(yǎng)血，生津等功效，用于治療氣血兩虧，面色萎黃，食欲不振，四肢乏力等癥。在骨折愈合、養(yǎng)血補(bǔ)血方面有著獨(dú)特的療效。為確保補(bǔ)血生津顆粒的質(zhì)量，采用薄層色譜法對方中黃芪和當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，以高效液相色譜法分析測定當(dāng)歸藥材中阿魏酸的含量，方法專屬性強(qiáng)，操作簡單，穩(wěn)定靈敏，重現(xiàn)性好，能有效地控制補(bǔ)血生津顆粒的質(zhì)量。具體方法如下。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters高液相色譜儀（2487檢測器、Empower工作站），Diamonsil C18 5um反相色譜柱 (4.6×250 mm)，Apollo C18 5um反相色譜柱 (4.6×250 mm)，F(xiàn)A2004電子分析天平，TG332A半微量分析天平、Sartorius BT25S電子天平、UV-2101紫外分光光度計(jì)、SK250H超聲清洗儀。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品（批號：110781-201309）為中國藥品生物制品檢定所提供。阿魏酸對照品（批號：110773-201313）購自中國藥品生物制品檢定所。補(bǔ)血生津顆粒批號：20150314、20150321、20150329（本院自制），硅膠G（青島海洋化工廠），D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm） （上海摩速科學(xué)器材公司），乙腈、甲醇為色譜純；乙酸乙酯、磷酸為分析純；水為超純水，所用試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪薄層鑒別 取本品15 g，研細(xì)，加甲醇50 ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20 ml，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，通過D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm），依次用水100 ml、40%乙醇100 ml洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇100 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液15 μl和對照品溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.2 當(dāng)歸薄層鑒別 取本品5 g，研細(xì)，加水30 ml，用0.5 mol/L的硫酸溶液調(diào)節(jié)PH至2～3，用乙酸乙酯提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液15 μl和對照品溶液2～5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正已烷-三氯甲烷-冰醋酸（6∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵和1%鐵氰化鉀混合溶液（用時(shí)等量混合）。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）為流動(dòng)相，檢測波長為320 nm，柱溫為35℃。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液： 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含阿魏酸10 μg的溶液，即得對照品溶液。供試品溶液：取本品研細(xì)，取約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水50 ml，超聲處理（功率250 W，頻率59 kHz）20分鐘，濾過，用少量水洗滌殘?jiān)蜑V器，合并濾液，用磷酸調(diào)PH值為1～2，再用乙酸乙酯振搖提取4次，每次25 ml，合并乙酸乙酯提取液，80℃水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙庵? ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。陰性對照溶液：除當(dāng)歸藥材外，取處方中其它各味藥材，按處方比例及生產(chǎn)工藝制成不含阿魏酸的陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μl，分別進(jìn)行高效液相色譜實(shí)驗(yàn)，并記錄色譜圖，見圖1、圖2、圖3。結(jié)果表明：本色譜條件下，阿魏酸主峰與其他組分峰完全分離，保留時(shí)間適宜；而不含阿魏酸的陰性溶液色譜中，在對照品相應(yīng)位置無色譜峰，說明陰性樣品無干擾。

圖1 陰性對照溶液色譜圖

圖2 對照品溶液色譜圖

圖3 供試品溶液色譜圖

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線形范圍 精密稱定阿魏酸對照品1.91 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇至刻度；精密量取1 ml、3 ml、5 ml、7 ml、10 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液各20 μl，在上述色譜條件下測定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=6000000x-21404，R=0.9998。阿魏酸在0.0382～0.382 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取阿魏酸對照品溶液（9.55 ug/ml），按“2.2.1”色譜條件，每隔2 h進(jìn)樣一次，測定阿魏酸峰面積，得到其峰面積的RSD為2.0%，結(jié)果表明阿魏酸峰面積在8 h內(nèi)無明顯變化，阿魏酸對照品穩(wěn)定性好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品精密稱定5份，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制樣，按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，樣品重復(fù)性良好，測得該批樣品阿魏酸含量分別為0.0136，0.0136，0.0135，0.0136，0.0137 mg/ g，RSD為0.37%。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的阿魏酸對照品溶液（9.55 μg/ml），依照“2.2.1”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測定阿魏酸的峰面積，求其六次峰面積的RSD值均為1.8%，證明儀器精密度良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量 (0.0136 mg/g）的本品約0.5 g，共五份，分別加入一定量的對照品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，計(jì)算回收率，平均回收率為94.0%，符合要求。

2.2.9 樣品測定 分別取七批補(bǔ)血生津顆粒，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中阿魏酸的含量，結(jié)果見表1。

表1 七批樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶劑的制備

3.1.1 溶劑的選擇 分別以甲醇和稀乙醇、水飽和的正丁醇、乙酸乙酯、乙醚4種溶劑提取供試品溶液，對其提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果用乙酸乙酯溶劑所提取的供試品溶液較純凈，色譜圖中雜峰少，樣品分離好，色譜圖中阿魏酸主峰峰面積大，峰形較好，基線平穩(wěn)，出峰時(shí)間適宜。

3.1.2 超聲時(shí)間的比較 提取供試品溶液時(shí)，比較了超聲振蕩時(shí)間對阿魏酸含量的影響，分別超聲處理10、20、30 min，結(jié)果三種超聲時(shí)間中超聲20 min與超聲30 min含量結(jié)果基本一致，考慮到樣品中阿魏酸見光不穩(wěn)定易分解，因此選擇超聲20 min作為提取條件。

3.2 流動(dòng)相的選擇 分別采用乙腈-0.05 mol/l磷酸二氫鉀溶液（15∶85）和乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）作為流動(dòng)相，比較出峰情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）為流動(dòng)相的主峰保留時(shí)間適宜，峰形較好。故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）為本方法的流動(dòng)相。

4 結(jié)論

采用薄層色譜法對方中黃芪、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，能有效控制制劑質(zhì)量。

采用高效液相色譜法測定當(dāng)歸的含量，方法穩(wěn)定、靈敏，重現(xiàn)性良好，故可作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)“2.2.9”樣品測試結(jié)果，同時(shí)考慮到當(dāng)歸藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)的差異及批量生產(chǎn)中各種因素的影響，我們制定本品每袋含阿魏酸不得少于0.10 mg。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:338-401.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:408-418.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典中藥薄層色譜彩圖集[M]廣州：.廣東科技出版社，2008:230-234.

[4]呂武清.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997: 268-280.

[5]徐禮.中草藥有效成分分析法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1984:188-192.

[6]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)出版社，1985:235-240

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[8]高萬山.中藥材理化鑒別手冊[M].南京：南京大學(xué)出版社，1993:138-140.

Quality Standards Establishment on Buxue Shengjin Granule

MAO Chengfang
(Preparations Center,Hongdu Hospital of TCM,Nanchang 330008,China)

Objective To establish the quality standards of Buxue Shengjin granule.Methods Using thin layer chromatography (TLC),qualitative identification of astragalus and angelica in Buxue Shengjin granule was carried out,and high performance liquid chromatography (HPLC)was developed for the determination of main active ingredient ferulic acid of angelica sinensis in Buxue Shengjin granule.Results The TLC method is specific,and the spots are clear.HPLC method for angelica ferulic acid content,the condition is appropriate,the separation effect is good,within the scope of ferulic acid in 0.0382~0.382 ug,has good linear relationship,the average recovery is 94.0%,and RSD values is 3.7%.Conclusion The method is specific,simple,sensitive and stable,reproducible,and can control the quality of Buxue Shengjin granule.

Buxue Shengjin granule;quality standards;chemistry of Chinese materia medica;thin layer chromatography

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.23.063

1672-2779（2016）-23-0138-03

李海燕 本文校對：張 潔

2016-07-31）