己烷體系中磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的研究

楊國(guó)龍 楊若茜 畢艷蘭 孫尚德 陳競(jìng)男

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

己烷體系中磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的研究

楊國(guó)龍 楊若茜 畢艷蘭 孫尚德 陳競(jìng)男

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

在己烷體系中，采用磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂。首先通過單因素試驗(yàn)分別考察了加酶量、加水量、底物比、溫度和溶劑比對(duì)卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的影響，并在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法對(duì)反應(yīng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定最佳工藝條件為：卵磷脂1.5 g，加酶量40 μL/g(磷脂酶A1/卵磷脂)，加水量25 μL/g(水/卵磷脂(PC))，底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)，溫度30 ℃，溶劑比：1∶2(PC/正己烷，W/V)，反應(yīng)時(shí)間3.55 h，溶血磷脂轉(zhuǎn)化率達(dá)98.3%。結(jié)果表明，磷脂酶A1可以催化磷脂酰膽堿乙醇解反應(yīng)制備溶血磷脂酰膽堿。

己烷 磷脂酶A1卵磷脂 乙醇解 溶血卵磷脂

磷脂作為一種脂蛋白載體普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞中，對(duì)調(diào)節(jié)生物膜的生物活性和機(jī)體的代謝有重要功能[1]。磷脂還具有乳化、分散、起泡、降低黏度和保持水分等功能，是天然的離子型表面活性劑，在食品業(yè)、飼料業(yè)、化妝品和洗滌劑等領(lǐng)域都有應(yīng)用[2]。但是未經(jīng)改性的磷脂的HLB值(親水疏水平衡值)較低，在水相中不易分散，只能用做W/O型乳化劑，不適合做O/W型乳化劑，使用范圍被大大限制[3-4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，磷脂被改性后乳化穩(wěn)定性、抗氧化性等都有很大提高[5]。溶血磷脂作為磷脂的改性產(chǎn)物既安全又高效，可應(yīng)用于更加廣泛領(lǐng)域。

根據(jù)磷脂酶催化磷脂水解制備溶血磷脂的反應(yīng)原理[1]，本試驗(yàn)將羥基供體從水改為乙醇，選用專一作用于1-位?；视玩I的磷脂酶A1，在己烷體系中催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂。

1 材料與方法

1.1 主要原料

大豆卵磷脂(PC≥98%)：沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司；磷脂酶A1(Lecitase Ultra，10 KLU/g)：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；三氯甲烷、甲醇：天津科密歐試劑有限公司。

1.2 主要儀器

DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；薄層棒狀色譜-火焰離子化檢測(cè)儀(IATROSCAN MK-6S)：三菱化學(xué)株式會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 磷脂酶A1催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂

準(zhǔn)確稱取1.5 g卵磷脂于50 mL圓底燒瓶中，加入適量的無水乙醇與正己烷(均用分子篩脫水)后放于調(diào)至一定溫度的恒溫磁力攪拌器中混合均勻，然后加入適量的水和磷脂酶A1開始反應(yīng)。定時(shí)取樣分析產(chǎn)物中卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、甘油磷脂酰膽堿(GPC)及其他物質(zhì)含量，并計(jì)算LPC轉(zhuǎn)化率。

LPC轉(zhuǎn)化率=

1.3.2 原料卵磷脂及其醇解產(chǎn)物的組成分析

將樣品溶解于色譜純?nèi)燃淄橹邢♂屩吝m宜濃度，取1 μL溶液點(diǎn)于薄層色譜棒上，在展開液(CHCl3/CH3OH/H2O, 42/22/2.5,V/V/V)中展開后干燥5 min，然后利用火焰離子檢測(cè)器(FID)進(jìn)行檢測(cè)分析[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 加酶量對(duì)溶血磷脂轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可得，當(dāng)加酶量為40 μL時(shí)，由于加酶量較少，LPC轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的增加而緩慢增加，待5 h時(shí)反應(yīng)結(jié)束后，LPC轉(zhuǎn)化率僅為39.7%。當(dāng)加酶量為50 μL時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率的初始增長(zhǎng)速率較加酶量為40 μL時(shí)明顯加快，在反應(yīng)1.5 h時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率快速增至61.9%，而后增長(zhǎng)速度明顯減緩，反應(yīng)5 h結(jié)束后達(dá)到81.4%。當(dāng)加酶量為60和70 μL時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，在反應(yīng)0～1 h期間，LPC轉(zhuǎn)化率分別迅速增長(zhǎng)至81.7%和83.5%，而后增長(zhǎng)速度逐漸減小，在3 h后分別達(dá)到96.0%和95.5%，并維持平衡狀態(tài)。綜合試驗(yàn)成本考慮，加酶量選擇60 μL效果好。

注：PC：1.5 g；加水量：40 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；溫度：45 ℃；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖1 加酶量對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 加水量對(duì)溶血磷脂轉(zhuǎn)化率的影響

酶促反應(yīng)的進(jìn)行需要適量的水，研究表明，在疏水性溶劑體系中，酶表現(xiàn)最高活性所需的水要少于在親水性溶劑時(shí)所需要的量[7]。本試驗(yàn)選用具有疏水性的正己烷為溶劑，雖然酶必需水的量有所降低，但過低的加水量會(huì)使酶分子的柔性變差，從而抑制酶的活性。反之，如果加水量過多，會(huì)造成過多水解副反應(yīng)，同樣不利于試驗(yàn)進(jìn)行。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；溫度：45 ℃；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖2 加水量對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可得，當(dāng)加水量為20 μL/g時(shí)，醇解反應(yīng)進(jìn)程緩慢，水分的不足嚴(yán)重抑制了磷脂酶的活性，反應(yīng)5 h后，LPC轉(zhuǎn)化率僅為54.2%。當(dāng)加水量為25 μL/g時(shí)，酶的活性較加水量為20 μL/g的情況有所改善，LPC轉(zhuǎn)化率初始增長(zhǎng)速率明顯加快，待反應(yīng)2 h后，LPC轉(zhuǎn)化率已增長(zhǎng)至52.8%，隨后醇解反應(yīng)進(jìn)程明顯減緩，反應(yīng)5 h結(jié)束后LPC轉(zhuǎn)化率較低，僅為70.4%。當(dāng)加水量為30 μL/g時(shí)，一開始反應(yīng)，LPC轉(zhuǎn)化率就迅速增加，僅僅2 h，就已經(jīng)增長(zhǎng)至79.4%，待反應(yīng)5 h結(jié)束后增至90.9%，已處于平衡狀態(tài)。當(dāng)加水量為35 μL/g時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率的初始增長(zhǎng)速率較加水量為30 μL/g時(shí)更快，反應(yīng)2 h時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率就已達(dá)到83.7%，反應(yīng)5 h結(jié)束時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步增長(zhǎng)至94.9%，并且表現(xiàn)出持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

2.3 底物比對(duì)溶血磷脂轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，當(dāng)?shù)孜锉葹?∶2時(shí)，由于乙醇含量較低，羥基供體不足，醇解反應(yīng)無法充分進(jìn)行，LPC轉(zhuǎn)化率的增長(zhǎng)速度一直比較緩慢，在反應(yīng)5 h結(jié)束時(shí)，僅為52.2%。但是，由于乙醇是種親水性有機(jī)溶劑，會(huì)奪取酶分子的必需水，從而抑制酶活性，因此如果乙醇含量較高，也會(huì)降低磷脂醇解率[8-9]。正如底物比為1∶4時(shí)顯示出的情況，雖然LPC轉(zhuǎn)化率較底物比為1∶2時(shí)有所增加，但是醇解反應(yīng)仍不充分，待反應(yīng)進(jìn)行5 h結(jié)束時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率僅能達(dá)到76.9%。當(dāng)?shù)孜锉葹?∶3時(shí)，乙醇含量較為適宜，LPC轉(zhuǎn)化率的增長(zhǎng)情況較1∶2和1∶4時(shí)大大提高，僅反應(yīng)3 h，轉(zhuǎn)化率已快速增至87.7%，并基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；溫度：45 ℃；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖3 底物比對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 溫度對(duì)溶血磷脂轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可知，在反應(yīng)溫度僅為30 ℃時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率在0～20 min呈現(xiàn)出近乎直線的增長(zhǎng)形式，迅速達(dá)到60.3%，僅經(jīng)過2 h，已達(dá)到了97.9%，并保持平衡。當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率的初始增長(zhǎng)速率較溫度為30 ℃時(shí)更快，反應(yīng)進(jìn)行20 min時(shí)LPC轉(zhuǎn)化率為78.2%，隨后于反應(yīng)1.5 h時(shí)增長(zhǎng)至96.7%，并保持平衡狀態(tài)。Wang等[10]在水解大豆磷脂時(shí)對(duì)Lecitase Ultra進(jìn)行了熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，證明了水解磷脂時(shí)，磷脂酶A1是一種在較低溫度下就能表現(xiàn)較高酶活性的酶，這與本試驗(yàn)所表現(xiàn)出來的情況基本一致。當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率的初始增長(zhǎng)速率較溫度為30 ℃時(shí)有所減緩，反應(yīng)進(jìn)行20 min時(shí)LPC轉(zhuǎn)化率為50.7%，在反應(yīng)3 h時(shí)增長(zhǎng)至97.7%，并維持平衡狀態(tài)。雖然溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，但當(dāng)反應(yīng)溫度升至45 ℃時(shí)，LPC轉(zhuǎn)化率的增長(zhǎng)情況較30、35和40 ℃時(shí)已有明顯降低，反應(yīng)5 h后，LPC轉(zhuǎn)化率才增長(zhǎng)至90.9%，說明酶的分子結(jié)構(gòu)已開始受到破壞。當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)酶活性已顯著下降，整個(gè)反應(yīng)過程中LPC轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)速度都十分緩慢，待5 h反應(yīng)結(jié)束后，LPC轉(zhuǎn)化率只能達(dá)到31.0%。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖4 溫度對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 溶劑比對(duì)溶血磷脂轉(zhuǎn)化率的影響

磷脂乙醇溶液黏度較大，為了提高磷脂的溶解性，本試驗(yàn)選取正己烷為溶劑[11]。由圖5可得，當(dāng)溶劑比為1∶1時(shí)，因體系中的傳質(zhì)阻力大，LPC轉(zhuǎn)化率持續(xù)緩慢增長(zhǎng)，反應(yīng)5 h后僅增至44.9%。當(dāng)溶劑比為1∶2時(shí)，體系中傳質(zhì)阻力明顯減小，LPC轉(zhuǎn)化率初始增長(zhǎng)速率顯著加快，在反應(yīng)0.5 h后LPC轉(zhuǎn)化率迅速增加至67.4%，隨后增長(zhǎng)速率趨于平緩，在反應(yīng)2 h后達(dá)到98.0%，保持平衡狀態(tài)。當(dāng)溶劑比為1∶3時(shí)，體系中傳質(zhì)阻力進(jìn)一步減小，LPC轉(zhuǎn)化率的初始增長(zhǎng)速率較底物比為1∶2時(shí)更加迅速，在反應(yīng)0.5 h后LPC轉(zhuǎn)化率達(dá)到78.0%，于2 h后增長(zhǎng)至98.2%，也處于平衡狀態(tài)。溶劑越多，分子密度越小，分子碰撞概率降低，因此當(dāng)溶劑比為1∶5和1∶10時(shí)LPC轉(zhuǎn)化率的初始增長(zhǎng)速率均有所降低，LPC轉(zhuǎn)化率在反應(yīng)0.5 h時(shí)分別為55.1%和33.5%，在3 h后達(dá)到平衡狀態(tài)并增至98.2%和98.4%。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；30 ℃。

圖5 溶劑比對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

綜合考慮5個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的影響，使用Design Expert 8.0軟件對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的優(yōu)化選取四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 試驗(yàn)方案和結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果

注：**：極顯著(P<0.001)；*：顯著(P<0.05)。

優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證如表3。由表3可知，理論值與實(shí)際值相差不大，說明利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝條件真實(shí)可靠，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)作用。

圖6 因素間的交互作用對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響

加酶量/μL/g加水量/μL/g溫度/℃時(shí)間/h理論LPC轉(zhuǎn)化率/%實(shí)際LPC轉(zhuǎn)化率/%4025303.5599.4%(98.3±0.8)%

3 結(jié)論

對(duì)正己烷體系中磷脂酶A1(Lecitase Ultra)催化磷脂酰膽堿乙醇解制備溶血磷脂的反應(yīng)條件進(jìn)行了深入研究，然后利用響應(yīng)面軟件建立了該反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，并對(duì)模型進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最優(yōu)工藝條件：卵磷脂1.5 g，加酶量/40 μL/g，加水量25 μL/g，底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)，溫度30 ℃，溶劑比：1∶2(PC/正己烷，W/V)，反應(yīng)時(shí)間3.55 h，使得LPC轉(zhuǎn)化率可高達(dá)98.3%。結(jié)果表明，磷脂酶A1(Lecitase Ultra)可以催化磷脂酰膽堿乙醇解反應(yīng)制備溶血磷脂酰膽堿。

[1]畢艷蘭. 油脂化學(xué)[M]. 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005：131, 136-137

[2]齊文娟, 岳紅衛(wèi), 王偉. 大豆磷脂的理化特性及其開發(fā)與應(yīng)用[J]. 中國(guó)油脂, 2005, 30(8): 35-37

[3]謝文磊. 磷脂的精制, 改性及其應(yīng)用[J]. 天津商學(xué)院學(xué)報(bào), 1998, 18(2): 50-55

[4]吳偉, 李維琳, 喻子牛, 等. 大豆卵磷脂的酶法改性研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2006, 20(6): 71-75

[5]朱秀清, 許慧, 陳昊, 等. 酶改性大豆磷脂性能研究[J]. 大豆科學(xué), 2004, 23(3): 192-195

[6]王渝鷺, 楊國(guó)龍, 畢艷蘭, 等. Lipozyme RMIM 催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2012, 33(2): 35-38

[7]Zaks A, Klibanov A M. The effect of water on enzyme action in organic media[J]. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263(17): 8017-8021

[8]Laane C, Boeren S, Vos K, et al. Rules for optimization of biocatalysis in organic solvents[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1987, 30(1): 81-87

[9]Millqvist A, Adlercreutz P, Mattiasson B. Lipase-catalyzed alcoholysis of triglycerides for the preparation of 2-monoglycerides[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1994, 16(12): 1042-1047

[10]Wang Y, Zhao M, Song K, et al. Partial hydrolysis of soybean oil by phospholipase A1(Lecitase Ultra)[J]. Food Chemistry, 2010, 121(4): 1066-1072

[11]Haas M J, Scott K, Jun W, et al. Enzymatic phosphatidylcholine hydrolysis in organic solvents: An examination of selected commercially available lipases[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1994, 71(5): 483-490.

Preparation of the Lysophosphatidylcholine by Phospholipase A1-Catalyzed Ethanolysis of Soybean Phosphatidylcholine in Hexane

Yang Guolong Yang Ruoxi Bi Yanlan Sun Shangde Chen Jingnan

(Grain School,Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

Preparation of the lysophosphatidylcholine (LPC) applying ethanolysis of soybean phosphatidylcholine (PC) by phospholipase A1(Lecitase Ultra) in hexane has been studied in the paper. Effects of the reaction factors including phospholipase A1dosage, water content, substrate ratio, reaction temperature and solvent content on the LPC conversion of the phospholipase A1-catalyzed ethanolysis of soybean phosphatidylcholine have also been studied. Based on the single-factor experiments, the reaction conditions were optimized with Response Surface Method. The optimal conditions were as follows: PC of 1.5 g, phospholipase A1dosage of 40 uL/g (phospholipase A1/PC,V/W), water content of 25 uL/g (water/PC,V/W), substrate ratio of 1∶3 (PC/ethanol, mol/mol), solvent content of 1∶2 (PC/hexane,W/V), reaction temperature at 30 ℃, reaction time for 3.55 h. On these conditions, the convertion rate of LPC could be 98.3%. The results showed that the phospholipase A1(Lecitase Ultra) was able to catalyze ethanolysis of PC to prepare LPC.

hexane, phospholipase A1, phosphatidylcholine, ethanolysis, lysophosphatidylcholine

TS229

A

1003-0174(2016)03-0064-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071558)，河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃(2011GGJS-079)

2014-07-24

楊國(guó)龍，男，1974年出生，副教授，脂質(zhì)化學(xué)與生物技術(shù)