比較兩種ELISA試劑盒在豬偽狂犬病血清抗體檢測(cè)中的一致性

全炎銘 賈澤穎 劉 鄧 郭又春 劉修權(quán) 劉莉如 伊秀春 陳華林

（北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站，北京 100192）

比較兩種ELISA試劑盒在豬偽狂犬病血清抗體檢測(cè)中的一致性

全炎銘 賈澤穎 劉 鄧 郭又春 劉修權(quán) 劉莉如 伊秀春 陳華林

（北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站，北京 100192）

比較兩種ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性，為流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷篩選適合的商品化試劑盒。采用來自兩個(gè)廠家的野毒抗體 （gE）和免疫抗體 （gB）ELISA檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)362份和392份豬血清，應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性。結(jié)果顯示：兩種豬偽狂犬病抗體 （gE）檢測(cè)試劑盒聯(lián)合檢測(cè)出95份抗體陽(yáng)性和256份陰性，符合率97.24%，結(jié)果一致性為極強(qiáng) （Kappa值0.932）；兩種豬偽狂犬病抗體 （gB）檢測(cè)試劑盒聯(lián)合檢測(cè)出351份抗體陽(yáng)性和9份陰性，符合率91.84%，一致性為弱 （Kappa值0.347）。以上結(jié)果說明，兩種豬偽狂犬病抗體 （gE）檢測(cè)試劑盒都適用于PRV gE抗體檢測(cè)，而兩種豬偽狂犬病抗體 （gB）檢測(cè)試劑盒差異較大，需慎重選擇。

豬偽狂犬??；ELISA試劑盒；比較；Kappa檢驗(yàn)

偽狂犬?。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一種急性傳染病，其特征為發(fā)熱、奇癢及腦膜炎癥狀[1-2]。該病曾得到很好的控制，但2011年至今，從北方向南方，PR疫情再次抬頭，席卷我國(guó)大部分地區(qū)，許多免疫過基因缺失苗的規(guī)?；幮载i場(chǎng)瞬間轉(zhuǎn)陽(yáng)，很多研究[3-6]表明此次大面積的豬場(chǎng)發(fā)病是由變異的PRV引起。雖然近期該病看似得到控制，很多野毒感染陽(yáng)性穩(wěn)定場(chǎng)很少發(fā)病，僅出現(xiàn)混合感染病例，但是在種豬場(chǎng)各個(gè)生長(zhǎng)階段的豬群野毒感染的高陽(yáng)性率，很大程度上影響了國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展，增加了疫病防控的復(fù)雜性[7-9]，同時(shí)PR野毒感染率居高不下，存在疫情暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了保證被檢豬群的安全性和加快陽(yáng)性豬場(chǎng)的野毒凈化措施，有效開展野毒感染抗體與免疫抗體水平的跟蹤監(jiān)測(cè)顯得十分重要[7-8]。

病毒抗體監(jiān)測(cè)的方法較多，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有客觀、敏感、特異、快捷等優(yōu)點(diǎn)，為國(guó)際貿(mào)易中抗體檢測(cè)指定方法之一，目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床診斷和血清學(xué)調(diào)查中[10-12]。本研究通過比較國(guó)內(nèi)運(yùn)用較為廣泛的兩種進(jìn)口PR病毒野毒抗體gE和gB抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)樣本來源清晰的PR陽(yáng)性豬場(chǎng)和陰性豬場(chǎng)血清，對(duì)其檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)估和分析，為合理選擇診斷試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1檢測(cè)樣品

豬血清采自9個(gè)不同的規(guī)?；i場(chǎng)（陽(yáng)性豬場(chǎng)3個(gè)，陰性豬場(chǎng)6個(gè)），為本實(shí)驗(yàn)室保

存的秋季抽檢血清樣本。選取392份生長(zhǎng)階段清晰的血清樣本進(jìn)行免疫抗體檢測(cè)(除25～30日齡哺乳仔豬外，其他均免疫過PRV gE基因缺失弱毒苗)，再?gòu)倪@392份血清中剔除PR陰性場(chǎng)（A豬場(chǎng)）30份血清進(jìn)行野毒抗體檢測(cè)。

1.2檢測(cè)試劑

ELISA進(jìn)口試劑盒分別購(gòu)買于美國(guó)愛德士（IDEXX）公司和西班牙海博萊（HIPRA）公司。PRV-gpI（gE）抗體檢測(cè)試劑盒：IDEXX（批號(hào)為99-09836 FM349），HIPRA（批號(hào)為 CAE.IM90）；gB抗體檢測(cè)試劑盒：IDEXX（批號(hào)為99-09732 EM176），HIPRA（批號(hào)為FS6397）。

1.3檢測(cè)方法及結(jié)果判定

豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。IDEXX：讀取OD650值，用S/N值來判定結(jié)果（S/N=樣品OD值/陰性對(duì)照平均OD值），其中S/N≤0.6判為陽(yáng)性，S/N＞0.7為陰性，0.6＜S/N≤0.7為可疑；HIPRA：讀取OD450值，采用IN%值判定（IN%=（陰性對(duì)照平均OD值-樣品OD值）/陰性對(duì)照平均OD值*100%），其中IN%＞45為陽(yáng)性，IN%＜40為陰性，40≤IN%≤45為可疑。

豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)方法也按試劑盒說明書進(jìn)行。IDEXX：讀取OD650值，用S/N值來判定結(jié)果，其中S/N≤0.5為陽(yáng)性，S/N＞0.6為陰性，0.5＜S/N≤0.6為可疑；HIPRA：測(cè)定OD405值并計(jì)算S/P值，S/P= (樣品OD值-陰性對(duì)照平均OD值）/（陽(yáng)性對(duì)照平均OD值-陰性對(duì)照平均OD值），其中S/P≥0.5為陽(yáng)性，S/P＜0.5為陰性。

如有結(jié)果差異，選取兩試劑盒檢測(cè)結(jié)果不一致的血清樣本，再檢測(cè)1次，取2次平均OD值作為最終結(jié)果判定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和判定指標(biāo)

采用EXCEL處理數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)判定一致性，其中Kappa值＜0，提示一致性極差；Kappa值在0～0.2，表示一致性微弱；Kappa值在0.21～0.4，一致性弱；Kappa值在0.41～0.6，中度一致；Kappa值在0.61～0.80，較高一致性；Kappa值＞0.80，極強(qiáng)一致性。通過符合率、Kappa值等統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)，并結(jié)合送檢豬場(chǎng)流行病學(xué)情況綜合評(píng)價(jià)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Kappa檢驗(yàn)比較豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒

采用兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果見表1，總體樣品結(jié)果的符合率為97.24%。根據(jù)Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.932，表明兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果有極強(qiáng)的一致性。

表1 兩種gE抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性分析 （份）

兩種豬偽狂犬病病毒gpI（gE）抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，362份樣品中有10份樣品結(jié)果不一致，分析發(fā)現(xiàn)這10份血清樣品的IDEXX檢測(cè)結(jié)果S/N值都是介于0.4～0.7之間，且分別來源于1份種公豬樣品（B033-1），1份哺乳仔豬樣品（B033-P5），1份母豬樣品（B036-8）和7份育成育肥豬樣品。不相符合豬血清樣品檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 兩種gE抗體試劑盒檢測(cè)不相符合血清樣品結(jié)果比較

2.2 Kappa檢驗(yàn)比較豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒

豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果見表3，總體樣品檢測(cè)結(jié)果的符合率為91.84%。Kappa值為0.347，判定結(jié)果為弱，表明兩種產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果存在較弱的一致性。

表3 兩種gB抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性分析 （份）

兩種gB ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果可見，392份豬血清樣品中，有33份樣品結(jié)果不一致，分析檢測(cè)差異主要集中在育成育肥豬群（中大豬），4份育仔豬。參考送檢豬場(chǎng)的送樣信息可看出,用這兩種試劑盒檢測(cè)PR陰性場(chǎng)和陽(yáng)性場(chǎng)一部分中大豬血清樣品出現(xiàn)了明顯差異，見表4。

3 分析與討論

Kappa統(tǒng)計(jì)量是Cohen在1960年首先提出的一種旨在校正機(jī)遇可能后衡量一致性的方法，也是一種用于檢驗(yàn)分類變量資料的一致性和重現(xiàn)性的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)[13]。具體而言，在研究工作中，可用來檢驗(yàn)比較兩種檢查或測(cè)定方法結(jié)果的一致性，以及評(píng)估臨床診斷結(jié)果或調(diào)查結(jié)果的重現(xiàn)性問題[14]。近幾年來，該方法在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究、流行病學(xué)及臨床資料可靠性考察衡量方面的應(yīng)用越來越廣泛[14-16]，但在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中較少。隨著國(guó)家對(duì)一些重大動(dòng)物疫病防控的高度重視，在強(qiáng)制免疫成為防疫的關(guān)鍵一環(huán)后，臨床診斷和抗體跟蹤監(jiān)測(cè)顯得尤為重要，于是市面上很多獸醫(yī)臨床診斷試劑盒，如雨后春筍不斷涌現(xiàn)，可以應(yīng)用Kappa一致性檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行比較和評(píng)估[10-12,17]。

豬偽狂犬病的防治主要依靠疫苗接種和常規(guī)診斷檢測(cè)，豬PR病毒野毒抗體檢測(cè)采用gE抗體檢測(cè)試劑盒，診斷豬群是否感染豬偽狂犬病野毒株。PRV gE和gB抗體檢測(cè)試劑盒可用于PR診斷和該病的綜合防治及PR凈化效果的評(píng)估。本研究根據(jù)Kappa值為0.932這個(gè)判定指標(biāo)，表明兩個(gè)廠家gE-ELISA試劑盒一致性極強(qiáng)，說明兩種試劑盒在血清學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)中差異不顯著，均可用于臨床個(gè)體樣本和群體野毒抗體檢測(cè)，這與楊濤等[17]報(bào)道的基本一致。

表4 兩種gB抗體試劑盒檢測(cè)不相符合血清樣品結(jié)果比較

在規(guī)?；i場(chǎng)豬群PRV gE野毒抗體檢測(cè)的同時(shí)，采用gB抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)豬群免疫后產(chǎn)生的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，能更好地反映豬群PR防疫水平和抵制強(qiáng)毒感染的能力。通過我們對(duì)北京部分規(guī)?；B(yǎng)殖豬場(chǎng)PR的摸底排查和持續(xù)的跟蹤監(jiān)測(cè)，了解到目前豬場(chǎng)普遍使用PRV gE基因缺失弱毒苗防控PR，近一兩年內(nèi)出現(xiàn)很多PR陽(yáng)性穩(wěn)定場(chǎng)，全群受野毒侵蝕，后備豬群表現(xiàn)高的陽(yáng)性率，是母豬群陽(yáng)性率居高不下，其豬群中隱性感染的豬只隨之進(jìn)入后備群，在豬場(chǎng)中形成循環(huán)感染，造成PR難以凈化的重要原因。但是出現(xiàn)的豬群免疫后持續(xù)性抗體水平（gB抗體高達(dá)95%以上）這種奇怪的現(xiàn)象引人深思，而本研究通過比較兩種gB抗體檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果差異較大，一致性為弱，提示兩種試劑盒至少有一種結(jié)果不可靠，對(duì)兩者檢測(cè)結(jié)果存在差異的33份豬血清進(jìn)行分析不難看出，主要集中在中大豬的檢測(cè)樣本中，HIPRA-gB ELISA結(jié)果檢出陰性，符合當(dāng)前豬場(chǎng)中大豬群抗體低,容易感染的實(shí)際背景。表明不管是PR陰性場(chǎng)還是PR陽(yáng)性場(chǎng)部分中大豬群免疫抗體水平低，加上衛(wèi)生環(huán)境差，容易激發(fā)混合感染而發(fā)病，有必要加強(qiáng)育成育肥豬舍的日常消毒衛(wèi)生和生物安全工作。因此建議在開展PR免疫后gB抗體檢測(cè)時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)群體來源和檢測(cè)對(duì)象，慎重選擇不同的診斷試劑盒[10,12]。

當(dāng)然，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)樣本計(jì)算的Kappa值僅僅只是一個(gè)樣本的統(tǒng)計(jì)量，是反映一致性程度的數(shù)值[10]，體現(xiàn)兩種檢查方法或試劑檢測(cè)的一致性水平，可作為可靠性參考，但不是判定試劑盒或方法好壞優(yōu)劣的唯一性指標(biāo)，還需要參考敏感性、特異性和穩(wěn)定性等指標(biāo)[11-12]，以及抽樣誤差和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中不可控的其他影響因素。

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S858.28

A

1673-4645(2016)12-0045-04

2016-12-04

三元種業(yè)自立課題（SYZY20130019）

全炎銘（1984-），湖南湘西人，碩士研究生，E-mail：26326109@qq.com