全自動(dòng)生化檢驗(yàn)微量反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用

唐敬強(qiáng)，姚思薇，劉麗梅

(樂(lè)昌市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 樂(lè)昌 512200)

?

全自動(dòng)生化檢驗(yàn)微量反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用

唐敬強(qiáng)，姚思薇，劉麗梅

(樂(lè)昌市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 樂(lè)昌 512200)

目的 在滿足儀器的最大性能基礎(chǔ)上，對(duì)全自動(dòng)生化檢驗(yàn)微量反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行研究探討。方法 通過(guò)對(duì)最小樣本量、最小試劑量的設(shè)置，定標(biāo)曲線數(shù)據(jù)對(duì)比，質(zhì)控品回收測(cè)定，測(cè)定試劑比例改變后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。收集樂(lè)昌市中醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的患者新鮮血清30份，進(jìn)行比對(duì)分析，每份血清分裝兩份按要求保存，且在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)線性范圍內(nèi)。結(jié)果 CysC測(cè)定參數(shù)修改前后實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；擬合直線回歸方程及R2值，得到Y(jié)=1.008 3X+15.645，R2=0.986，R2>0.950，符合線性評(píng)價(jià)要求，參數(shù)改變前后的測(cè)定具有良好的一致性。結(jié)論 試劑比例的相近改變后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與原來(lái)的對(duì)比不存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，仍然能符合臨床需求。

全自動(dòng)生化分析儀； 生化檢驗(yàn)； 微量； 反應(yīng)檢測(cè)

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床檢驗(yàn)中全自動(dòng)生化檢驗(yàn)得到了廣泛應(yīng)用，全自動(dòng)生化分析儀的主要原理是根據(jù)光電比色來(lái)對(duì)受檢標(biāo)本中某種特定的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)量，具有準(zhǔn)確性高、速度快、節(jié)省試劑等優(yōu)勢(shì)。本研究在滿足儀器最大性能的前提下，選取30份新鮮血清，通過(guò)對(duì)最小樣本量、最小試劑量的設(shè)置，對(duì)全自動(dòng)生化檢驗(yàn)微量反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行研究探討。

1 材料

1.1 儀器

全自動(dòng)生化分析儀由邁瑞公司提供，型號(hào)為BS-420，性能介紹：BS-420恒速400/H，樣本量2～45 μL，0.1 μL遞增；第一試劑最小吸液量150～350 μL，1 μL遞增；第二、三、四試劑最小吸液量均為20～350 μL，1 μL遞增；反應(yīng)杯5 mm×5 mm×30 mm(長(zhǎng)×寬×高),光徑5 mm，反應(yīng)杯容量750 μL；光學(xué)系統(tǒng)為靜態(tài)光纖傳光系統(tǒng)，全息凹面平場(chǎng)光柵后分光；分析原理為比色法和透射比濁法。分析方法：終點(diǎn)法，固定時(shí)間法，動(dòng)力學(xué)法，支持雙試劑、雙波長(zhǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

廣州科方生物試劑有限公司生產(chǎn)的胱氨酸蛋白酶抑制劑(CysC)，試劑盒R1試劑為40 mL、R2試劑10 mL(試劑盒要求R1試劑設(shè)置為200 μL，R2試劑50 μL)。生產(chǎn)批號(hào)：150807，有效期1年。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

收集樂(lè)昌市中醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的患者新鮮血清30份，具有高、中、低濃度，且在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)線性范圍內(nèi)，每份血清分裝兩份按要求保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)原理與檢測(cè)方法

本院檢驗(yàn)科于2015年3月起采用邁瑞B(yǎng)S-420全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)定CysC為例，通過(guò)透射比濁法檢測(cè)。把R1試劑用量控制在滿足空白R(shí)0點(diǎn)吸光度最小反應(yīng)體積160 μL，調(diào)整R2試劑為30 μL 與樣本為2 μL的檢驗(yàn)項(xiàng)目，參數(shù)設(shè)計(jì)修改后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)論證。采用膠乳增強(qiáng)比濁法，在反應(yīng)體系中R1試劑為甘氨緩沖液，R2試劑為大小均一的聚苯乙烯膠乳顆粒懸液，表面包被抗人CysC特異性抗體，可與樣品中CysC結(jié)合產(chǎn)生凝集，并與CysC的含量成正比，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化并計(jì)算其含量。試劑盒內(nèi)試劑不匹配現(xiàn)象多見(jiàn)于試劑不足量或者儀器本來(lái)防止被稀釋而多吸一點(diǎn)，R1、R2試劑不匹配現(xiàn)象造成了嚴(yán)重的試劑浪費(fèi)[1]。通過(guò)改變R1、R2試劑比例，參照NCCLS-EPA文件[2]，在保證質(zhì)量的前提下[3]，修改檢驗(yàn)參數(shù)前后用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器，每天測(cè)試30份標(biāo)本2次，連續(xù)5 d，在2015年3—6月收集共300個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2 質(zhì)控品回收率分析

本實(shí)驗(yàn)原來(lái)的試劑比例R1:R2：樣本為200:50:3，更改后的試劑比例為160:30:2，是微量檢測(cè)范疇,比例與原來(lái)相近似，試劑R0點(diǎn)吸光度無(wú)太大的區(qū)別，因此定標(biāo)曲線不存在太大差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，修改實(shí)驗(yàn)參數(shù)后利用多點(diǎn)非線性規(guī)則進(jìn)行定標(biāo)，用多濃度的質(zhì)控品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)控回收，每個(gè)濃度進(jìn)行20次的測(cè)試，以求出其檢出均值，回收率在96%～106%，證明該方法有效可行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)控品回收率情況 n=20

2.3 配對(duì)t檢驗(yàn)

將收集到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，t=1.812，自由度為n-1=29,查t值表t0.05(29)=2.045，P>0.05，表明CysC測(cè)定參數(shù)修改前后實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 相關(guān)性分析

以CysC改變前的均值為X軸，改變后的為Y軸，將所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用EXCEL2003軟件作散點(diǎn)圖，擬合直線回歸方程及R2值，得到Y(jié)=1.008 3X+15.645，R2=0.986，R2>0.950，符合線性評(píng)價(jià)要求[4-5]，參數(shù)改變前后的測(cè)定具有良好的一致性。

2.5 臨床可接受評(píng)價(jià)

參數(shù)改變前后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏倚均在醫(yī)學(xué)決定水平范圍內(nèi)，證明預(yù)期偏倚較小，其修改參數(shù)后的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)性能仍符合臨床使用要求。

2.6 自動(dòng)化生化檢驗(yàn)微量反應(yīng)經(jīng)濟(jì)效益分析

以測(cè)定CysC為例，原來(lái)說(shuō)明書(shū)設(shè)定樣本為3 μL，R1為200 μL，R2為50 μL，R1/R2=4/1。試劑盒理論上R1試劑為40 mL、R2試劑10 mL(試劑盒要求R1試劑設(shè)置為200 μL，R2試劑50 μL)，實(shí)際上R2試劑經(jīng)常不足10 mL(多數(shù)在8.5 mL左右)，存在R1與R2試劑不匹配的情況，按原來(lái)試劑盒上的要求只有160人份左右。R2試劑不足就造成了R1試劑的浪費(fèi)，此時(shí)每人份的試劑成本為20.77元。如果對(duì)檢驗(yàn)項(xiàng)目參數(shù)設(shè)計(jì)進(jìn)行修改，把R1試劑用量控制在滿足空白R(shí)0點(diǎn)吸光度最小反應(yīng)體積160 μL，調(diào)整R2試劑為30 μL與樣本為2 μL的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可達(dá)到250人份左右，試劑成本降為12.625元。以每天35人次，全年12 775人工作量進(jìn)行評(píng)估，節(jié)約試劑成本104 052.00元，經(jīng)濟(jì)效益相當(dāng)可觀[6]。

3 討論

全自動(dòng)生化檢驗(yàn)微量反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)具有廣泛應(yīng)用前景的新技術(shù)，當(dāng)前大部分醫(yī)療衛(wèi)生單位的檢驗(yàn)人員都是按照試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)設(shè)定檢驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，與全自動(dòng)生化檢驗(yàn)儀器的最低檢測(cè)限仍有很大的調(diào)整空間。然而目前很多生化系列儀器的性能非常優(yōu)秀，因此按照試劑盒上的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，會(huì)形成不必要的試劑浪費(fèi)?？s小實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行測(cè)試，對(duì)本研究的檢測(cè)性能重新評(píng)估就尤為重要。通過(guò)對(duì)最小樣本量、最小試劑量的設(shè)置，使實(shí)驗(yàn)的線性不受太大影響，仍能滿足日常檢驗(yàn)需求是今后生化檢驗(yàn)的發(fā)展方向，可有效節(jié)約檢驗(yàn)資源，提高經(jīng)濟(jì)效益。

但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中?？砂l(fā)現(xiàn)，在雙試劑測(cè)試項(xiàng)目中當(dāng)R2試劑用完后R1試劑仍有剩余的情況，而且這種情況隨著檢驗(yàn)次數(shù)增加而顯著增加，這成為檢驗(yàn)科急需解決的問(wèn)題。在雙試劑測(cè)定過(guò)程中，R1試劑作為緩沖劑，其單次使用量較大，而R2試劑單次使用量小。R1、R2試劑混合過(guò)程中，物質(zhì)構(gòu)成比不變，反應(yīng)成分不變，改變的是反應(yīng)物濃度，不同反應(yīng)物濃度并不會(huì)影響反應(yīng)實(shí)質(zhì)，只是影響物質(zhì)反應(yīng)時(shí)的檢測(cè)線性范圍，因此，在樣品使用量不變的情況下，適當(dāng)增加物質(zhì)反應(yīng)濃度時(shí)，反應(yīng)線性范圍則適當(dāng)增加，而減低物質(zhì)濃度時(shí)，可導(dǎo)致線性反應(yīng)范圍變窄。若適當(dāng)減少試劑用量，并不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，只是使得線性范圍變窄，斜率輕微下降，靈敏度稍有降低，但對(duì)線性范圍的影響非常小。因此可按照上述方法調(diào)整原來(lái)試劑用量，從而減少R1試劑浪費(fèi)情況。使用邁瑞公司BS-420全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，修改檢驗(yàn)項(xiàng)目參數(shù)設(shè)計(jì)，保持與原有相近的試劑比例，使實(shí)驗(yàn)的線性不受太大影響，仍能較大程度地滿足日常檢驗(yàn)需求。

此外，本研究所用的儀器保養(yǎng)完好，試劑性能穩(wěn)定。本科經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的工作實(shí)踐，對(duì)儀器的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行了多次的檢測(cè)，參數(shù)的設(shè)計(jì)與修改均符合儀器的性能與檢測(cè)范圍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前對(duì)比不存在明顯差異，檢測(cè)結(jié)果仍能準(zhǔn)確可靠。

[1] 羅萬(wàn)義，王藝霓.改變不配套試劑比在全自動(dòng)分析儀測(cè)定中的一致性分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10(7)：868-869.

[2] National Committee Clinical Laboratory Standards.Method comparison and bias estimation using patient samplesapproved guideline.EP9-A[S].Wayne，PA，USA：NCCLS，1995.

[3] 葉應(yīng)嫵，王毓三.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].2版.南京：東南大學(xué)出版社，1997：329-335.

[4] 馬斌榮.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：36-38.

[5] 楊有業(yè)，張秀明.臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：46-48.

[6] 孫志強(qiáng).AUTOLAB-18全自動(dòng)生化分析儀淀粉酶測(cè)定節(jié)省試劑的方法[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(4)：164.

(責(zé)任編輯：鐘榮梅)

2015-11-05

東昌市衛(wèi)生局科技計(jì)劃項(xiàng)目(韶衛(wèi)計(jì)局Y15136號(hào))

R446.11+2

A

1009-8194(2016)03-0008-02

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.03.003