響應(yīng)面法優(yōu)化油茶籽多肽制備的工藝研究

葉 展 胡傳榮，2，3 羅 質(zhì)，2,3 何東平，2，3

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023)(湖北省肽類物質(zhì)工程技術(shù)研究中心2，武漢 430023)(湖北省校企共建油茶籽深加工研發(fā)中心3，武漢 430023)

響應(yīng)面法優(yōu)化油茶籽多肽制備的工藝研究

葉 展1胡傳榮1，2，3羅 質(zhì)1，2,3何東平1，2，3

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023)(湖北省肽類物質(zhì)工程技術(shù)研究中心2，武漢 430023)(湖北省校企共建油茶籽深加工研發(fā)中心3，武漢 430023)

針對(duì)油茶籽加工副產(chǎn)物利用率低，油茶籽多肽制備得率和純度不高等問(wèn)題，本研究利用中性蛋白酶對(duì)油茶籽蛋白進(jìn)行水解，研究了酶解pH、酶解溫度、底物濃度、加酶量和酶解時(shí)間5個(gè)單因素對(duì)油茶籽多肽制備的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取了底物濃度、酶解溫度和加酶量3個(gè)因素，采用綜合平衡法，以酶解后油茶籽蛋白的水解度、游離氨基酸濃度和多肽濃度隸屬度的綜合分為指標(biāo)，進(jìn)行三因素二次旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行響應(yīng)面分析，以優(yōu)化油茶籽多肽的制備條件，優(yōu)化結(jié)果底物濃度3.00%、酶解溫度47.0 ℃、加酶量6 440 u/g底物，在該優(yōu)化條件下的試驗(yàn)顯示，油茶籽蛋白水解度19.25%、游離氨基酸濃度76.60 μmol/mL、油茶籽多肽濃度61.35 mg/mL，綜合分0.985，優(yōu)化結(jié)果理想，說(shuō)明該工藝可生產(chǎn)質(zhì)量較好的小分子多肽，為油茶籽多肽的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

油茶籽多肽 制備 優(yōu)化 響應(yīng)面分析

油茶素有 “綠色油庫(kù)”、“綠色金庫(kù)”、“鐵桿莊稼”等美譽(yù)，與油橄欖、油棕、椰子并稱為“世界四大木本油料樹(shù)種”[1]，是山茶科山茶屬植物，我國(guó)有豐富的油茶資源，年產(chǎn)油茶籽100多萬(wàn)t[2]。

油茶籽多肽是油茶籽蛋白經(jīng)酸、堿或酶水解得到的由不同氨基酸組成的多肽鏈的通稱。從已有報(bào)道可知[3]，很多種植物蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽除了具有易被人體消化吸收的特性外，還具有很強(qiáng)的抗氧化、降低膽固醇、促進(jìn)鈣吸收等功能特性。據(jù)研究[4]，脫脂處理后的油茶籽粕中，含水分4.82%、粗脂肪1.58%、灰分5.21%，粗纖維14.65%、粗蛋白13.6%、糖類38.17%、差皂素14.8%、其他7.17%，但是，由于一直未對(duì)油茶籽粕的開(kāi)發(fā)利用加以重視，過(guò)去油茶籽粕一直用于肥田、作為動(dòng)物飼料或者被丟棄[5]，其利用率相當(dāng)?shù)?，造成資源極大浪費(fèi)。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)油茶籽多肽的制備和純化研究報(bào)道較少，因此對(duì)油茶籽粕制備油茶籽蛋白多肽進(jìn)行研究，提高多肽得率和純度，為油茶籽多肽的生產(chǎn)及油茶籽粕的高值化利用提供相關(guān)基礎(chǔ)資料，這對(duì)于加強(qiáng)油茶籽副產(chǎn)物的綜合利用，開(kāi)發(fā)新型優(yōu)質(zhì)蛋白資源，滿足市場(chǎng)需求，都具有極為重要的意義[6-7]。本研究對(duì)油茶籽粕制備油茶籽多肽的酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并對(duì)多肽的純度分析進(jìn)行了簡(jiǎn)述，從而為油茶籽粕的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用油茶籽粕制備油茶籽蛋白，制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]，產(chǎn)物中油茶籽蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.37%；水分8.52%；灰分7.21%。

中性蛋白酶：160 000 u/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

層析柱(1.6 cm×60 cm)：上海嘉鵬科技有限公司；LM-125超濾試驗(yàn)裝置：北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽：北京六一儀器廠；Freezone 6 冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油茶籽多肽的制備

油茶籽蛋白→粉碎→過(guò)80目篩→3%(W/V)懸浮液→熱變性處理(90 ℃，20 min)→調(diào)pH值→酶解→滅酶→離心(4 000 r/min，15 min)→取上清液→樹(shù)脂脫鹽→SephadexG-25柱層析→離心→取上清液冷凍干燥→油茶籽多肽。

1.3.2 酶解過(guò)程的評(píng)價(jià)

水解度(DH)測(cè)定，以水解液中總氨基態(tài)氮與所加油茶籽白的總氮的百分比表示，參照趙新淮等[9]對(duì)水解度的測(cè)定方法；游離氨基酸含量測(cè)定，按照文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行茚三酮顯色測(cè)定；多肽得率測(cè)定，采用三氯乙酸沉淀法進(jìn)行測(cè)定，參照參考文獻(xiàn)[11]。

1.3.3 蛋白酶的選擇

由于酶具有特異性和選擇性，要使酶解反應(yīng)充分進(jìn)行，首先要選用適宜的酶，其次要使酶顯示出足夠的活性。酶的活性與酶解反應(yīng)的溫度、pH、時(shí)間和激活劑有關(guān)。酶解反應(yīng)程度還與酶濃度、料水比和反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。本試驗(yàn)中選用中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶作對(duì)比試驗(yàn)。使用3種酶以水解度為指標(biāo)在各自最適條件下水解油茶籽蛋白，篩選出最佳用酶，4種蛋白酶的水解條件見(jiàn)表1。

表1 4種蛋白酶的水解條件

1.3.4 油茶籽蛋白酶解反應(yīng)的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究顯示[12-13]，用酶水解法制備多肽，僅用蛋白質(zhì)水解度1個(gè)指標(biāo)進(jìn)行描述評(píng)價(jià)是不太合理的，并不是水解度越高，多肽含量和質(zhì)量就會(huì)越高，因此在進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)中采用油茶籽蛋白水解度、氨基酸含量和多肽得率3個(gè)指標(biāo)為目標(biāo)，進(jìn)行試驗(yàn)。

為確定油茶籽多肽制備的影響因素，以油茶籽蛋白水解度、氨基酸含量和多肽得率3個(gè)為指標(biāo)，分別研究酶解pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、底物質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50、60、70 mg/mL)、加酶量(1 300、2 600、3 900、5 200、6 500、7 800、9 100 u/g 底物)和酶解時(shí)間(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h)對(duì)目標(biāo)值的影響，繪制曲線圖。

1.3.5 油茶籽多肽制備最佳工藝條件響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在對(duì)工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)，把3個(gè)試驗(yàn)指標(biāo)水解度、氨基酸濃度、多肽濃度轉(zhuǎn)化為三者的隸屬度，即水解度隸屬度、氨基酸濃度隸屬度、多肽濃度隸屬度。按照綜合平衡法，將3個(gè)隸屬度綜合，用綜合分對(duì)油茶籽多肽制備條件進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中，水解度、氨基酸濃度、多肽濃度3個(gè)指標(biāo)的重要性之比定義為4∶3∶3[14]。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)油茶籽多肽制備影響最大的底物濃度(A)、酶解溫度(B)、加酶量(C)3個(gè)因素為3個(gè)試驗(yàn)因子，以隸屬度的綜合分為目標(biāo)，用Design-Expert 7.1.3中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)模塊中的二次回歸正交中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[15-16]，設(shè)計(jì)了1組三因素五水平共計(jì)23次的試驗(yàn)(Full CCD設(shè)計(jì))，其中析因部分試驗(yàn)次數(shù)為14次，星點(diǎn)數(shù)為5次，為了保證均一精密性并且減小試驗(yàn)誤差，將中心重復(fù)數(shù)手動(dòng)調(diào)整為9次，共計(jì)23個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，來(lái)確定油茶籽多肽制備的最優(yōu)條件組合。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平見(jiàn)表2。

表2 三因素二次旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的確定

該試驗(yàn)是以從冷榨油茶籽餅中提取的蛋白質(zhì)為底物，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%。以 DH 為指標(biāo)，可以看出幾種酶對(duì)油茶籽蛋白的酶解效果，4種蛋白酶的水解效果比較見(jiàn)表3。由表3可知，酶解油茶籽蛋白效果如下：中性蛋白酶>堿性蛋白酶>胰蛋白酶>木瓜蛋白酶，因此，本研究針對(duì)中性白酶水解油茶籽蛋白進(jìn)行單因素分析，確定各參數(shù)的最適條件，同時(shí)對(duì)酶水解條件進(jìn)行二次回歸正交中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)[13]，并結(jié)合響應(yīng)面分析，以確定各條件參數(shù)的最佳組合。

表3 4種蛋白酶的水解效果比較

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果[17-20]

2.2.1 pH值對(duì)油茶籽多肽制備的影響

底物質(zhì)量濃度30 mg/mL，中性蛋白酶加酶量 E∶S=5 200 u/g 底物，溫度為45 ℃，在pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 水解2 h。以水解度、氨基酸濃度、多肽濃度為指標(biāo)，確定pH 對(duì)油茶籽多肽制備的影響。pH對(duì)指標(biāo)的影響如圖1所示。

圖1 pH對(duì)油茶籽多肽制備的影響

由圖1可知，隨著pH 的增加，油茶籽蛋白水解度、氨基酸濃度、多肽濃度逐漸升高，達(dá)到一定程度，三者開(kāi)始下降，當(dāng)pH 在7.0左右時(shí)，水解度、氨基酸濃度和多肽濃度最高，這也進(jìn)一步說(shuō)明了中性蛋白酶的最適酶解pH為7.0，同時(shí)，也說(shuō)明了水解度的增大，反應(yīng)體系中，油茶籽蛋白酶解程度越高，也就使導(dǎo)致酶解液中游離氨基酸和多肽的濃度的增加。

2.2.2 底物濃度對(duì)油茶籽蛋白水解度的影響

中性蛋白酶加酶量 E∶S=5 200 u/g底物，pH7.0，底物濃度分別為10、20、30、40、50、60、70 mg/mL水解2 h。以水解度、氨基酸濃度、多肽濃度為指標(biāo)，確定底物濃度對(duì)油茶籽多肽制備的影響。底物濃度對(duì)指標(biāo)的影響如圖2所示。由圖2可知，底物濃度在小于30 mg/mL時(shí)，油茶籽蛋白的水解度、氨基酸濃度、多肽濃度與底物濃度呈正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0 mg/mL時(shí)，三者與底物濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，底物濃度約在30 mg/mL時(shí)，油茶籽蛋白的水解度、氨基酸濃度、多肽濃度最高，但是，底物濃度還影響到多肽制備的時(shí)間、速率等多個(gè)因素，因此，選擇底物濃度在30 mg/mL范圍左右做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 底物濃度對(duì)油茶籽多肽制備的影響

2.2.3 酶解溫度對(duì)油茶籽蛋白水解度的影響

底物濃度30 mg/mL，中性蛋白酶5 200 u/g 底物，pH為7.0，分別在35、40、45、50、55、60、65 ℃水解2 h。以油茶籽蛋白的水解度、氨基酸濃度、多肽濃度為指標(biāo)，確定溫度對(duì)油茶籽多肽制備的影響。酶解溫度對(duì)指標(biāo)的影響如圖3所示。

圖3 酶解溫度對(duì)油茶籽多肽制備的影響

由圖3可知，酶解溫度低于45 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，油茶籽蛋白的水解度、氨基酸濃度、多肽濃度不斷增大；溫度超過(guò)45 ℃后，隨著溫度的升高指標(biāo)值逐漸減小，溫度在45 ℃左右時(shí)，油茶籽蛋白制備多肽的效果較好，由于溫度對(duì)中性蛋白酶的酶解效果影響最大，在不失活的前提下，溫度稍高，會(huì)加快酶解速率，但是溫度太高又增加了油茶籽多肽的制備成本，因此，對(duì)于最適溫度，也需在45 ℃左右進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.4 加酶量對(duì)油茶籽蛋白水解度的影響

底物濃度30 mg/mL，溫度45 ℃，中性蛋白酶pH 7.0，加酶量分別為1 300、2 600、3 900、5 200、6 500、7 800、9 100 u/g 底物，水解2 h。以油茶籽蛋白的水解度、氨基酸濃度、多肽濃度為指標(biāo)，確定加酶量對(duì)油茶籽多肽制備的影響。加酶量對(duì)指標(biāo)的影響如圖4所示。

圖4 加酶量對(duì)油茶籽多肽制備的影響

由圖4可知，隨著加酶量的增加，水解度、氨基酸濃度、多肽濃度逐漸增大，但達(dá)到5 000 u/g左右時(shí)，水解度、氨基酸濃度、多肽濃度隨著加酶量的增加先后趨于平衡，多肽產(chǎn)量增加不明顯。但是，考慮到生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本、操作性和油茶籽多肽得率，加酶量還需要在5 200 u/g左右進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而確定酶的最適用量。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)油茶籽蛋白水解度的影響

底物濃度 3%，中性蛋白酶加酶量為5 200 u/g底物，pH為7.0，45 ℃下分別水解 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h，以水解度、氨基酸濃度、多肽濃度為指標(biāo)，確定時(shí)間對(duì)油茶籽多肽制備的影響。酶解時(shí)間對(duì)指標(biāo)的影響如圖5所示。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多肽制備的影響

由圖5可知，水解反應(yīng)初始1～4 h，油茶籽蛋白的水解度、氨基酸濃度、多肽濃度隨著酶解時(shí)間的增加而迅速升高；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)4.0 h，再增加延長(zhǎng)時(shí)間，反應(yīng)變得緩慢，趨于平衡，多肽含量升高不明顯。所以由上圖分析，最適酶解時(shí)間確定為4 h。

2.3 水解最佳工藝條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

按照響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21-22]，得到試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4(續(xù))

2.3.2 回歸方程的建立與方差分析

依據(jù)表4數(shù)據(jù)，擬合出響應(yīng)值與各因素的數(shù)學(xué)回歸模型如下：

Y=-24.787+0.192A+0.742 6B+1.713E-3C-5.356E-3AB+3.648E-5AC-6.025E-6BC-3.133E-3A2-7.360E-3B2-1.198E-7C2，對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回歸方程方差分析表

注：*為顯著(P<0.05)，**為極顯著(P<0.01)。

經(jīng)過(guò)相應(yīng)曲面法擬合計(jì)算得出該回歸方程的決定系數(shù)R2=0.993 9，表明該回歸方程擬合度較高；校正系數(shù)RAdj=0.994 8，表明油茶籽蛋白水解度總的變異中，有99.48%是由獨(dú)立變量引起的；失擬項(xiàng)不顯著(P=0.140 0>0.05)，說(shuō)明該回歸方程包含了影響油茶籽蛋白水解度的主要因素，可信度高，模型能較好的預(yù)測(cè)和分析油茶籽蛋白水解度。從表5中，可得B、C、AC、A2、B2、C2對(duì)回歸方程影響極為顯著；A、BC對(duì)回歸方程影響顯著[23-24]，再由各因素的F值可知，不同因素對(duì)油茶籽多肽制備的影響大小依次是：酶解溫度>加酶量>底物濃度。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析[25-26]

為研究試驗(yàn)因素之間的交互作用強(qiáng)度以及確定各因素的最佳水平范圍，利用Design-Expert 7.1.3對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，所得到的回歸方程的響應(yīng)面分別見(jiàn)圖6、圖7和圖8。

圖6 底物濃度和酶解溫度交互作用對(duì)油茶籽

圖7 底物濃度和加酶量交互作用對(duì)油茶籽

圖8 酶解溫度和加酶量交互作用對(duì)油茶籽多肽制備的影響響應(yīng)面圖

從圖6～圖8中可以看出，3個(gè)曲面都比較陡峭，這表明底物濃度、酶解溫度和加酶量三因素之間的兩兩因素對(duì)油茶籽多肽制備均具有較顯著影響，每個(gè)響應(yīng)面均有明顯的峰，說(shuō)明底物濃度、酶解溫度和加酶量3個(gè)因素的最佳取值較好地落在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)[27-28]，結(jié)合等高線圖，其最佳值分別位于25～35 mg/mL、45～47.5 ℃、6 250～6 875 u/g底物范圍；而且，由圖7還可以看出，底物濃度和加酶量?jī)梢蛩貙?duì)應(yīng)的曲面與酶解溫度和加酶量?jī)梢蛩貙?duì)應(yīng)的曲面比較陡峭，說(shuō)明他們油茶籽多肽制備結(jié)果影響更加顯著，這與方差的結(jié)果(表5)一致，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了回歸方程方差分析中交互作用項(xiàng)的系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果。

2.3.4 參數(shù)優(yōu)化與驗(yàn)證

在Design-Expert 7.1.3軟件優(yōu)化模塊中，將優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置成為最大值，求解得綜合分Y的最優(yōu)值為0.988，預(yù)測(cè)的最佳試驗(yàn)條件為：底物濃度30.4 mg/mL、酶解溫度46.70 ℃、加酶量6 439.87 u/g底物。為了方便實(shí)際操作，在對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，將最佳工藝條件修正為：底物濃度30 mg/mL、酶解溫度47.0 ℃、加酶量6 440 u/g底物。在該優(yōu)化條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，用同樣方法測(cè)定水解度、氨基酸濃度、多肽濃度3個(gè)指標(biāo)，取平均值，制備的油茶籽多肽指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表6。數(shù)值與預(yù)測(cè)的最優(yōu)值基本吻合，這也表明了模型的有效性。

表6 油茶籽多肽產(chǎn)品指標(biāo)

2.4 油茶籽多肽純化和分子質(zhì)量分析測(cè)定

多肽的分子質(zhì)量對(duì)多肽的消化吸收、生理功能起著重要作用，因此，對(duì)于制備的油茶籽多肽，還需要對(duì)其分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行分離純化，劉靜[29]分別研究了用于大豆多肽的毛細(xì)管分離、凝膠排阻色譜分離、反相高效液相色譜等多肽的分離純化方法；馬安德等[30]利用ESI-MS測(cè)定多肽化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量，精確度可達(dá)到0.100%～0.01%。比聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠過(guò)濾、蔗糖密度離心法等經(jīng)典的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定技術(shù)更快捷，更精確；張會(huì)翠[31]利用SepHadex G-15凝膠柱層析分析確定花生多肽的分子質(zhì)量分布。這些方法分析效果較好，易于操作，精確度較高，對(duì)于油茶籽多肽的純化和分子質(zhì)量的分析同樣適用。何東平等[18]已利用SepHadex G-50凝膠柱層析方法分析油茶籽多肽的分子質(zhì)量分布，確定了酶法制備油茶籽多肽產(chǎn)物中600～5 000 u約為60%。

由于蛋白質(zhì)、多肽等的相對(duì)分子質(zhì)量較大，器皿、溶劑等帶來(lái)的干擾較小，對(duì)比較純凈的樣品直接進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定即可得到比較好的質(zhì)譜圖；若樣品復(fù)雜，需進(jìn)行液相色譜分離，進(jìn)行LC-MS測(cè)定。對(duì)于油茶籽多肽的分離還可以用大孔樹(shù)脂、納濾膜和超濾膜進(jìn)行過(guò)濾分離[31]。

3 結(jié)論

對(duì)酶解pH、酶解溫度、底物濃度、加酶量和酶解時(shí)間5個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度、氨基酸濃度、多肽濃度為指標(biāo)，用綜合平衡法，把三者按照4∶3∶3比例轉(zhuǎn)化為各自隸屬度，得綜合評(píng)分Y，選取影響最大底物濃度、酶解溫度、加酶量三因素進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果底物濃度3.00 mg/mL、酶解溫度47.0 ℃、加酶量6 440 u/g底物，在該優(yōu)化條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，油茶籽蛋白水解度19.25%、游離氨基酸濃度76.60 μmol/mL、油茶籽多肽濃度61.35 mg/mL，綜合分0.985，表明優(yōu)化結(jié)果理想。

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Optimization of the Camellia Seed Polypeptide Preparation Technology by Response Surface Methodology

Ye Zhan1Hu Chuanrong1,2,3Luo Zhi1,2,3He Dongping1,2,3

(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University1, Wuhan 430023)(Hubei peptides Engineering and Technology Research Center2, Wuhan 430023)(Hubei University-enterprise co-construction Camellia Seed Deep Processing and Development Center3，Wuhan 430023)

In the paper, adopting neutral protease to hydrolyze camellia seed protein in view of the low utilization rate of the by-products from camellia seed and problems about the low yield and purity of camellia peptides preparation technology. The effects of enzymolysis pH, substrate concentration and enzymolysis temperture and enzyme dosage on the preparation of camellia seed polypeptide were studied respectively. On the basis of single factor experiments, the substrate concentration, enzymolysis temperture and enzyme dosage were selected to conduct three factors quadratic rotary experiment design utilizing integrated balance method: meanwhile, the Response Surface Analysis was also applied to optimize the camellia seed polypeptide preparation conditions, optimization results were as follows: substrate concentration 3.00%, enzymolysis temperture 47.0 ℃, and enzyme dosage 6 440 u/g. On the optimization conditions, hydrolysis degree of the camellia seed protein was 19.25%, free amino acid concentration 76.60 μmol/mL, camellia seed polypeptide concentration 61.35 mg/mL, integrated score 0.985; optimization results was ideal to show that the technology could produce fine quality micro-molecule polypeptide, and the paper laid a theoretical foundation for the application and development of the camellia seed peptide.

camellia seed polypeptide, preparation, optimization,response surface method

TS229

A

1003-0174(2016)02-0109-07

國(guó)家糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (201313012)

2014-07-11

葉展，男，1989年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

何東平，男， 1957年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧食、油脂與植物蛋白工程