固定化脂肪酶催化大豆油酯交換制備生物柴油

陳俊燕 陸向紅 聶 勇 計(jì)建炳

(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程; 浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014)

固定化脂肪酶催化大豆油酯交換制備生物柴油

陳俊燕 陸向紅 聶 勇 計(jì)建炳

(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程; 浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014)

以大豆油為原料，以Novozym 435固定化脂肪酶為催化劑，采用滴加甲醇的方法制備生物柴油。考察了甲醇滴加速度、水的添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)級(jí)數(shù)對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響。結(jié)果表明，甲醇滴加可以減弱甲醇對(duì)酶的毒害，達(dá)到添加叔戊醇相同的效果。甲醇的滴加速度、反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酸甲酯收率有很大影響，可以調(diào)節(jié)甲醇的滴加速度和反應(yīng)溫度提高脂肪酸甲酯收率，甲醇滴加速度3.43×10-4g甲醇/(g油·min)，反應(yīng)溫度60 ℃是適宜的反應(yīng)條件，在此條件下，產(chǎn)物收率可以達(dá)到98.75%。反應(yīng)生成的甘油會(huì)影響酶的活性和產(chǎn)物收率，采用二級(jí)反應(yīng)，級(jí)間脫除甘油，有利于產(chǎn)物收率的提高。對(duì)于Novozym 435固定化脂肪酶，水的添加不利于產(chǎn)物收率的提高。

滴加甲醇法 Novozym 435 酯交換 脂肪酸甲酯

生物柴油是一種可再生的清潔能源，能替代礦物柴油直接用于柴油發(fā)動(dòng)機(jī)[1-2]。在當(dāng)前能源和環(huán)境的雙重壓力下，發(fā)展生物柴油有利于經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和國(guó)家能源安全[3]。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯，是由動(dòng)植物油通過(guò)酯化/酯交換方法制備得到[4]。目前生物柴油的生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)催化法、酶催化法和高溫高壓法。化學(xué)催化法主要使用酸、堿為催化劑，堿催化法對(duì)原料中游離脂肪酸和水含量有嚴(yán)格限制；酸催化法存在醇油比高、腐蝕設(shè)備和污染環(huán)境等問(wèn)題；高溫高壓法存在能耗高、設(shè)備投資大等缺點(diǎn)。酶催化法具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)過(guò)程清潔等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。但酶成本高，若能采用固定化酶，易于分離、可實(shí)現(xiàn)多次循環(huán)使用，降低酶的消耗[7]；并且酶的活性易受反應(yīng)物甲醇和副產(chǎn)物甘油的影響，若能在操作工藝上降低甲醇/甘油對(duì)酶活性的影響，酶催化法將成為具有前景的生物柴油生產(chǎn)方法[8]。

李俐林等[9]以菜籽油作原料，反應(yīng)介質(zhì)叔丁醇和油脂的體積比為 1∶1，甲醇與油脂的摩爾比為4∶1，1%的Novozym 435和3%的Lipozyme TLIM結(jié)合使用，35 ℃下反應(yīng)12 h，生物柴油得率可達(dá)95%，試驗(yàn)證明加入有機(jī)溶劑以及分批加入甲醇等均能有效提高反應(yīng)體系中脂肪酶的催化活性。鄭妍等[10]以叔戊醇作為反應(yīng)介質(zhì)，固定化脂肪酶Novozym 435催化大豆油與甲醇的酯交換反應(yīng)制備生物柴油，在40 ℃條件下反應(yīng)15 h，生物柴油得率可達(dá)97%。在前人的研究工作中，脂肪酸甲酯得率可觀，為了進(jìn)一步探索反應(yīng)過(guò)程中分離甘油能否促進(jìn)反應(yīng)向正方向進(jìn)行，縮短反應(yīng)時(shí)間，試驗(yàn)考察了級(jí)間脫除甘油反應(yīng)對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響；為了降低能源損耗，簡(jiǎn)化后續(xù)分離步驟，研究了無(wú)溶劑體系下采用滴加甲醇法制備脂肪酸甲酯。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆油：食品級(jí)；甲醇(分析純)：上海振興試劑一廠；Novozym 435固定化脂肪酶：諾維信公司；十一酸甲酯標(biāo)樣、十七酸甲酯標(biāo)樣：阿拉丁試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BT100-2J型蠕動(dòng)泵：保定蘭格恒流泵有限公司；SHA-B恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；Agilent7890A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；電子天平：莫多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶的預(yù)處理

將2%(基于大豆油的質(zhì)量)的Novozym 435固定化酶浸入10 g大豆油中過(guò)夜，大豆油起到活化酶的作用，使酶的活性中心暴露在表面，提高催化活性。

1.2.2 酶催化酯交換反應(yīng)

把裝有大豆油和酶的100 mL錐形瓶放入恒溫振蕩水槽中，再用蠕動(dòng)泵以恒定的速度向錐形瓶中加入甲醇，進(jìn)行酯交換反應(yīng)。每隔1 h取樣，用氣相色譜分析產(chǎn)物中脂肪酸甲酯的含量。

1.2.3 分析和計(jì)算方法

采用氣相色譜分析大豆油脂肪酸甲酯組成。根據(jù)標(biāo)樣和脂肪酸甲酯組分的峰面積，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得出混合脂肪酸甲酯的含量。氣相色譜條件和甲酯含量的計(jì)算方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

由氣相色譜分析獲得的脂肪酸甲酯的含量及反應(yīng)體系的質(zhì)量計(jì)算反應(yīng)體系中生成的脂肪酸甲酯的質(zhì)量，并按式(1)計(jì)算脂肪酸甲酯的收率。

收率=反應(yīng)生成的脂肪酸甲酯質(zhì)量/原料大豆油質(zhì)量×100%

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 稀釋劑種類(lèi)及甲醇加入方式對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

為了降低甲醇對(duì)脂肪酶的毒害作用，一般在反應(yīng)體系中加入體積為大豆油1～1.5倍的叔戊醇稀釋。加入的叔戊醇必須在反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)蒸餾的方法脫除，既提高了設(shè)備投資又增加了能耗。為了在不增加能耗的前提下降低甲醇對(duì)脂肪酶的毒害，以反應(yīng)產(chǎn)物之一的棕櫚酸甲酯代替叔戊醇作為稀釋劑，或者采用甲醇滴加的方式降低反應(yīng)體系中甲醇的濃度，試驗(yàn)比較了幾種操作方式對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：□0.875 g叔戊醇/g油，甲醇一批加入；△0.956 g棕櫚酸甲酯/g油，甲醇一批加入；◇無(wú)溶劑，甲醇滴加，滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)；○無(wú)溶劑，甲醇一批加入；其他反應(yīng)條件：溫度40 ℃，含水量0%。

圖1 稀釋劑種類(lèi)及甲醇加入方式對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

從圖1可以看出，在不加稀釋劑的情況下，甲醇一次性加入致使體系中甲醇濃度過(guò)高，脂肪酶受甲醇的影響而喪失催化活性，脂肪酸甲酯的收率極低；叔戊醇的加入不僅降低了體系中甲醇濃度，稀釋了甲醇對(duì)脂肪酶的毒害，而且叔戊醇增加了甲醇和油的互溶度，除固定化酶外，反應(yīng)呈均相體系，醇油接觸面增加，反應(yīng)速率提高。以棕櫚酸甲酯為稀釋劑，能在一定程度上稀釋甲醇對(duì)酶的毒害，但和叔戊醇為稀釋劑的情況相比，脂肪酸甲酯的收率要低很多，可能的原因是甘油酯與甲醇的酯交換反應(yīng)是可逆反應(yīng)，體系中加入棕櫚酸甲酯，雖然減弱了甲醇對(duì)酶的毒害，保持了酶的催化活性，但提高了產(chǎn)物的濃度，抑制了正反應(yīng)的進(jìn)行，使脂肪酸甲酯收率下降。甲醇滴加入反應(yīng)體系，可以降低反應(yīng)體系中甲醇濃度，減弱甲醇對(duì)酶的毒害，有效提高脂肪酸甲酯的收率。因?yàn)闆](méi)有稀釋劑的加入，后續(xù)處理簡(jiǎn)單，能耗降低，甲醇滴加是一種酶催化生產(chǎn)生物柴油較合理的操作方式。

2.2 甲醇滴加速度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

考慮到體系中的甲醇濃度會(huì)從脂肪酶的活性和反應(yīng)物間的碰撞次數(shù)2個(gè)方面影響反應(yīng)速率和產(chǎn)物收率，并且這2種影響是相反的，當(dāng)甲醇滴加速度過(guò)快，體系中大量的甲醇會(huì)加速酶的失活，而甲醇滴加速度過(guò)慢，體系中甲醇濃度過(guò)低，甘油酯分子與甲醇分子的碰撞次數(shù)過(guò)少，甘油酯的轉(zhuǎn)化速率降低，脂肪酸甲酯的收率下降。因此甲醇滴加速率是必須考察的一個(gè)因素。甲醇滴加速率對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響見(jiàn)圖2。

注：甲醇滴加速度分別為△3.84×10-4g/(g油·min)；□3.43×10-4g/(g油·min)；◇2.72×10-4g/(g油·min)；○1.70×10-4g/(g油·min)；其他反應(yīng)條件：溫度40 ℃，含水量0%。

圖2 甲醇滴加速度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

圖2顯示，甲醇滴加速度從3.84×10-4g/(g油·min)降低到1.70×10-4g/(g油·min)，酯交換速率先增加后下降，在甲醇滴加速度為3.43×10-4g/(g油·min)時(shí)，酯交換速率最快，生物柴油收率最高，在600 min時(shí)，生物柴油收率達(dá)到49.57%，接近叔戊醇為稀釋劑的60.71%。

2.3 多級(jí)反應(yīng)對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

酯交換反應(yīng)是個(gè)可逆反應(yīng)，從反應(yīng)平衡的角度出發(fā)，為提高生物柴油的收率，必須增加反應(yīng)體系中反應(yīng)物甲醇的含量或者降低副產(chǎn)物甘油的含量。因?yàn)檫^(guò)高的甲醇含量對(duì)酶有毒害作用，試驗(yàn)采用多級(jí)反應(yīng)，級(jí)間脫除甘油的方法提高生物柴油收率。在實(shí)際操作中，由于采用了甲醇滴加方式，體系中甲醇濃度較低，又沒(méi)有其他稀釋劑的存在，甘油在油相中的溶解度極低，極易通過(guò)沉降分層的方法脫除。

試驗(yàn)采用兩級(jí)操作，在第一級(jí)酯交換反應(yīng)接近平衡時(shí)，通過(guò)沉降分層脫除甘油，油相和固定化脂肪酶進(jìn)入第二級(jí)，滴加甲醇進(jìn)行二級(jí)酯交換反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：□ 一級(jí)酯交換；◇二級(jí)酯交換；其他反應(yīng)條件為溫度40 ℃，甲醇的滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)，含水量0%。

圖3 分級(jí)反應(yīng)對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

如圖3所示，第一級(jí)反應(yīng)在600 min后收率增加極緩，反應(yīng)漸趨平衡。脫除甘油后的油相，繼續(xù)用第一級(jí)反應(yīng)所用的酶催化進(jìn)行第二級(jí)反應(yīng)，360 min后，脂肪酸甲酯收率提高了5%多。說(shuō)明在一級(jí)反應(yīng)生成的副產(chǎn)物甘油不僅抑制了反應(yīng)向正方向進(jìn)行，而且它附著在酶制劑的表面抑制了酶的催化作用。

2.4 水含量對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

微量水對(duì)維持酶的構(gòu)象、發(fā)揮催化作用是必須的[12]。脂肪酶含有適量的水份，有利于提高脂肪酶的活性。

為了考察含水量對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響。在優(yōu)化的甲醇滴加速度下，將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水和甲醇混合經(jīng)蠕動(dòng)泵滴加到反應(yīng)體系中進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：含水量分別為□0%；◇0.2%；△0.5%；○1%；其他反應(yīng)條件：溫度40 ℃，甲醇的滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)

圖4 含水量對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

圖4顯示，含水量在0.2%～1%內(nèi)，隨著含水量的增加，脂肪酸甲酯的收率不斷降低，并且在實(shí)驗(yàn)所考察的含水量下，脂肪酸甲酯的收率均低于原酶?？赡苁窃械墓潭ɑ久敢呀?jīng)含有使之達(dá)到最高活性的必需水，再繼續(xù)加入水會(huì)導(dǎo)致酶空間構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致脂肪酶的活性降低甚至失活。

2.5 溫度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

溫度影響酶的活性，進(jìn)而影響酶催化生成脂肪酸甲酯的收率。試驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度對(duì)酶催化生成生物柴油收率的影響，以獲得適宜的酶促反應(yīng)溫度。溫度對(duì)生物柴油收率的影響見(jiàn)圖5。

注：溫度分別為+40 ℃；*45 ℃；○50 ℃；△55 ℃；□60 ℃；◇65 ℃；其他反應(yīng)條件：甲醇的滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)，含水量0%。

圖5 溫度對(duì)脂肪酸甲酯收率的影響

如圖5所示，當(dāng)酶促溫度從40 ℃增加到60 ℃，脂肪酸甲酯收率增加，酶促溫度繼續(xù)增加到65 ℃，脂肪酸甲酯的收率略有下降。溫度在60 ℃時(shí)，經(jīng)過(guò)550 min的反應(yīng)時(shí)間，脂肪酸甲酯收率高達(dá)98.75%，能達(dá)到生產(chǎn)的要求。盡管較高的酶促溫度會(huì)激發(fā)酶短期內(nèi)的催化活性，但從長(zhǎng)期來(lái)看必會(huì)影響酶的壽命，需進(jìn)一步考察酶的壽命與酶促反應(yīng)溫度的關(guān)系，并結(jié)合溫度對(duì)短期活性的影響，綜合考慮選擇酶促反應(yīng)的溫度。

3 結(jié)論

酶催化酯交換反應(yīng)合成生物柴油的過(guò)程速率和產(chǎn)品收率受酶活性的影響，酯交換反應(yīng)中的反應(yīng)物甲醇和產(chǎn)物甘油對(duì)脂肪酶有毒害作用，反應(yīng)體系中添加稀釋劑能有效減弱甲醇對(duì)脂肪酶的毒害，提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，但增加了后續(xù)分離的難度和成本。以產(chǎn)物成分之一的棕櫚酸甲酯作為稀釋劑，能保護(hù)酶的活性同時(shí)避免了額外的分離過(guò)程，但增加了體系中產(chǎn)物濃度，不利于正反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物收率不高。甲醇滴加的操作方式不僅有利于酶活性的保持，而且加入反應(yīng)體系中的甲醇基本上反應(yīng)完全，甲醇用量接近于化學(xué)計(jì)量，用量少，甲醇回收能耗低。甲醇滴加速度影響脂肪酸甲酯收率，3.43×10-4g/(g油·min)是較適宜的滴加速率。酯交換反應(yīng)是可逆反應(yīng)，甘油的生成不僅會(huì)影響酶的活性，而且會(huì)阻礙正反應(yīng)的進(jìn)行，采用多級(jí)反應(yīng)，級(jí)間通過(guò)沉降分層脫除甘油，可有效提高脂肪酸甲酯收率。就Novozym 435固定化脂肪酶而言，水的加入不利于酶活性的提高，但酶促溫度對(duì)其活性有很大影響，反應(yīng)溫度從40 ℃增加到60 ℃，脂肪酸甲酯收率相應(yīng)從49.57%提高到98.75%，但考慮到過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)影響酶的使用壽命，酶促反應(yīng)的溫度還需進(jìn)一步研究確定。

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Production of Biodiesel through Transesterification of Soybean Oil Catalyzed by Immobilized Lipase

Chen Junyan Lu Xianghong Nie Yong Ji Jianbing

(Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014)

Novozym 435 immobilized lipase was used as catalyst, biodiesel was prepared from Soybean oil by dripfeeding of methanol. The influences of the dropping speed of methanol, water content, reaction temperature and reaction stages on the yield of biodiesel were examined. The results showed that dripfeeding of methanol could prevent enzyme from the poisoning of methanol, and the yield of biodiesel could get to the same level as adding tert-amyl alcohol. The dropping speed of methanol and the reaction temperature had significant influences on the FAME yield, so the dropping speed of methanol and the reaction temperature could be adjusted to improve the FMAE yield. The highest biodiesel yield of 98.75% was obtained when the dropping speed of methanol was 3.43×10-4g (g methanol/g oil·min), and temperature was 60 ℃. Glycerol, the byproducts from the production of biodiesel, would influence the activity of the enzyme and the biodiesel yield. Using the secondary reaction and removing of glycerol could be helpful to improve the biodiesel yield. For Novozym 435 immobilized lipase, addition of water was against the increase of biodiesel yield.

drip-feeding,Novozym 435,transesterification,biodiesel

TQ645

A

1003-0174(2016)12-0057-05

863計(jì)劃(2014AA022103)

2015-06-11

陳俊燕，女，1990年出生，碩士，生物質(zhì)能源

陸向紅，女，1971年出生，副教授，生物質(zhì)能源