分光光度法測定燕麥β-葡聚糖含量

張 如 戴巧玲 吳小燕 李琳琳 陳元勝 吳 佳

(福州大學生物科學與工程學院，福州 350116)

分光光度法測定燕麥β-葡聚糖含量

張 如 戴巧玲 吳小燕 李琳琳 陳元勝 吳 佳

(福州大學生物科學與工程學院，福州 350116)

采用紫外可見分光光度法研究了剛果紅濃度、β-葡聚糖濃度、反應溫度、pH值、反應時間、離子濃度、光照、體系中可能共存的淀粉和蛋白等因素對測定燕麥β-葡聚糖含量的影響。同時，在紫外吸收光譜分析的基礎上運用化學計量學方法計算剛果紅與燕麥β-葡聚糖的結合常數K與結合位點數N及平均結合數n。結果表明：室溫條件下，剛果紅質量濃度50 μg/mL，pH 7.5，反應時間30 min，離子濃度0.1 mol/L時，吸光度與β-葡聚糖濃度在0～10 μg/mL范圍內具有較好的線性關系。光照對測定無影響，共存的淀粉和蛋白質對測定影響較小。在試驗條件下，剛果紅與燕麥β-葡聚糖的結合常數K為4.08×106、結合位點數N為336、平均結合數n為297。

燕麥 β-葡聚糖 剛果紅 分光光度法 結合模型

(1→3)(1→4)-β-D-葡聚糖，簡稱β-葡聚糖，屬于水溶性膳食纖維，是由D-葡萄糖以連續(xù)的β-(1→4)糖苷鍵和單個的β-(1→3)糖苷鍵連接而成的線性多糖[1]，β-(1→4)鍵與β-(1→3)的比例約為7∶3，β-葡聚糖主要存在于燕麥、大麥等谷物中，并以燕麥麩中含量較高，是燕麥中重要的功能成分。研究發(fā)現，燕麥β-葡聚糖具有多種生理功能，能夠降低膽固醇水平，預防心腦血管疾病，具有調節(jié)血糖，改善便秘，調理腸道等功能[2-5]。因此，研究人員對燕麥β-葡聚糖的提取、含量測定和結構性質等開展了大量的工作。

目前，測定β-葡聚糖含量較準確的方法主要是酶法和流動注射(FIA)熒光法[6-13]。但是酶法需要用到昂貴的高純度專一性酶，檢測時間較長。流動注射熒光法需要用到昂貴的儀器，需專人操作。因此，這2種方法都難以廣泛應用。據報道，剛果紅可與β-葡聚糖專一性結合，使溶液顏色加深[14-15]。利用這一原理，本研究以紫外可見分光光度計為檢測儀器，定量測定燕麥β-葡聚糖的含量，對測定條件和方法的準確度與精密度進行了研究。并運用化學計量學方法計算剛果紅與燕麥β-葡聚糖的定量結合規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 主要材料

燕麥β-葡聚糖標品：百特純大分子科技有限公司；剛果紅：上海晶純生化科技股份有限公司，ACS級；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

CARY50 Bio紫外可見分光光度計：美國瓦里安公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

燕麥β-葡聚糖標準溶液的配制：準確稱取0.010 0 g β-葡聚糖，加去離子水，80 ℃水浴攪拌溶解，冷卻至室溫后定容至100 mL，搖勻，即得到0.1 mg/mL的β-葡聚糖標準溶液。

剛果紅儲備液的配制：準確稱取0.050 0 g剛果紅，溶解于0.1 mol/L、pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中，定容至250 mL，搖勻，即得0.2 mg/mL的剛果紅溶液。使用時，配制成所需濃度的剛果紅溶液。

淀粉儲備液的配制：準確稱取0.315 8 g可溶性淀粉，加適量去離子水，5 min內加熱至沸，煮沸15 min，快速冷卻至室溫后定容至100 mL，搖勻，即得3.158 mg/mL淀粉儲備液。使用時，配制成所需濃度的淀粉溶液。

蛋白質儲備液的配制：準確稱取0.315 8 g酪蛋白，加10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，攪拌溶解完全后加10 mL 0.1 mol/L HCl中和后定容至100 mL，搖勻，即得3.158 mg/mL蛋白質儲備液。使用時，配制成所需濃度的蛋白質溶液。

1.3.2 測定波長的確定

向試管中加入一定體積的燕麥β-葡聚糖標準溶液，用去離子水補至2 mL，加入4 mL一定濃度的剛果紅溶液，得到不同濃度β-葡聚糖和剛果紅的混合液，立即渦旋振蕩10 s，靜置30 min后用紫外可見分光光度計對混合液在350～700 nm進行吸收光譜掃描。并將混合液吸收光譜減去相同濃度剛果紅溶液吸收光譜，得到兩者的差譜?；旌弦褐懈鹘M分濃度均為溶液中(共6 mL)的終濃度。試驗均做3次平行，后續(xù)試驗如無特殊說明，操作過程與此相同。

1.3.3 剛果紅濃度與β-葡聚糖線性范圍的確定

配制系列混合液，使其中剛果紅質量濃度為30～70 μg/mL，β-葡聚糖質量濃度為0～30 μg/mL，于550 nm處測定吸光度。試驗以相應濃度的剛果紅溶液為空白。

1.3.4 測定條件的影響

所有測定的混合液中，β-葡聚糖和剛果紅終質量濃度分別固定為8 μg/mL和50 μg/mL。

反應溫度的影響：配制混合液于5～50 ℃條件下靜置30 min，在550 nm處測定吸光度，以相同反應溫度的剛果紅溶液為空白。

離子濃度的影響：配制濃度為0～0.2 mol/L，pH值7.5的磷酸鹽緩沖液，將其作為溶劑配制剛果紅溶液。在550 nm處測定混合液吸光度，以相應離子濃度的剛果紅溶液為空白。

緩沖液pH值的影響：配制0.1 mol/L pH值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，將其作為溶劑配制剛果紅溶液。于550 nm處測定混合液吸光度，以相應pH值的剛果紅溶液為空白。

反應時間的影響：配制混合液靜置0～60 min，在550 nm處測定吸光度，以相同濃度的剛果紅溶液為空白。

淀粉的影響：向混合體系中加入淀粉儲備液，使其中淀粉與β-葡聚糖濃度之比為0～100。于550 nm處測定吸光度，以相同濃度的剛果紅溶液為空白。

蛋白質的影響：方法同淀粉的影響，蛋白質與β-葡聚糖濃度之比為0～100。

光照的影響：將混合液分別在正常光照與避光條件下靜置30 min，在550 nm處測定吸光度。以相同條件下的剛果紅溶液為空白。每組均做5次平行試驗。

1.3.5 精密度和加樣回收率試驗

精密度試驗：方法同1.3.4光照條件的影響中正常光照條件組。

加樣回收率試驗：取1 mL適當稀釋的燕麥麩皮水提液，加入0～0.48 mL的燕麥β-葡聚糖標準溶液，用去離子水補足至2 mL，加入4 mL剛果紅溶液，于550 nm處測定吸光度。以相同濃度的剛果紅溶液為空白。

回收率=(C-A)/B×100%

式中：A為燕麥麩皮水提液所含β-葡聚糖量；B為標準β-葡聚糖加入量；C為加入標準β-葡聚糖后水提液所測β-葡聚糖量。

1.3.6 剛果紅和β-葡聚糖結合模型

ΔA=A-εFCT

(1)

Δε=εB-εF

(2)

n=ΔA/(ΔεCG)

(3)

ΔA=Δε(1+KCT)/K-ΔεN(CTΔε/ΔA-1)CG

(4)

式中：A為剛果紅與葡聚糖復合物的吸光度；εF為游離剛果紅的摩爾吸光系數；CT為溶液中剛果紅總的濃度；εB為結合到葡聚糖上剛果紅的摩爾吸光系數；n為平均每個β-葡聚糖分子上結合的剛果紅分子數；CG為溶液中β-葡聚糖的濃度；K為結合常數；N為溶液中每一個β-葡聚糖分子上的總的結合位點數。

式(4)中，ΔεN是一個常數，Δε(1+KCT)/K是與試驗中所用剛果紅濃度有關的常數。以(CTΔε/ΔA-1)CG為橫坐標，ΔA為縱坐標作圖，可得一線性方程。通過該線性方程的截距與斜率可求得結合常數K與結合位點數N。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

圖1中剛果紅質量濃度為50 μg/mL，β-葡聚糖質量濃度為8 μg/mL。由圖1可知，混合液的吸收光譜與剛果紅溶液的相比，發(fā)生了明顯紅移，在480～600 nm范圍內吸光度明顯增加。由兩者的差譜可以看出，在波長550 nm處存在吸光度的最大差值。試驗發(fā)現對不同剛果紅濃度，不同β-葡聚糖濃度混合液測得的吸收光譜，與相應濃度的剛果紅吸收光譜比較起來，均在550 nm處有吸光度的最大差值，表明該波長處靈敏度最高，故選擇550 nm為測定波長。

圖1 吸收光譜與吸收差譜

2.2 剛果紅濃度與β-葡聚糖線性范圍的確定

2.2.1 剛果紅濃度的確定

由圖2可以看出，在一定濃度的剛果紅溶液中，隨著葡聚糖濃度的增加，吸光度逐漸增加并趨于平穩(wěn)。含較高濃度剛果紅混合液的吸光度曲線位于含較低濃度剛果紅混合液吸光度曲線的上方。為了實現定量測定，需要利用吸光度曲線的線性增加部分。經過比較發(fā)現，當葡聚糖質量濃度在0～10 μg/mL范圍內，混合液的吸光度大致隨葡聚糖的濃度呈線性增加的趨勢。在這一線性范圍內考察，對于相同濃度的葡聚糖溶液，當剛果紅質量濃度從30 μg/mL增加至50 μg/mL時，吸光度有所增加。進一步增加剛果紅濃度，混合液吸光度基本保持不變，吸光度曲線接近重合，可認為此時β-葡聚糖上的可結合位點基本都被剛果紅分子占據，因此當剛果紅質量濃度大于50 μg/mL時吸光度不再增加。不同剛果紅濃度下，葡聚糖質量濃度為0～10 μg/mL的線性擬合曲線的斜率見表1，由表1可見當剛果紅質量濃度大于50 μg/mL時回歸曲線的斜率基本保持不變且維持在0.031左右，說明在此濃度時測定的靈敏度達到最大且基本不再隨剛果紅濃度而增加。綜合考慮選擇剛果紅終質量質量濃度為50 μg/mL。

圖2 剛果紅濃度對復合物測定的影響

剛果紅質量濃度/μg/mL3040506070葡聚糖在0～10μg/mL范圍斜率0.0210.0250.0310.0310.032

2.2.2 β-葡聚糖線性范圍的確定

將圖2中50 μg/mL的剛果紅吸光度曲線單獨繪制，如圖3所示。由圖3可以看出，復合物的吸光度與β-葡聚糖質量濃度在0～10 μg/mL范圍內有較好的線性關系。

圖3 β-葡聚糖質量濃度對復合物測定的影響

2.3 測定條件的影響

2.3.1 反應溫度的影響

由圖4a可以看出，隨著反應溫度的增大，吸光度呈現先穩(wěn)定不變后減小的趨勢。其中5～35 ℃時，吸光度基本穩(wěn)定；35 ℃以上，吸光度顯著減小。推測反應溫度高于35 ℃時，剛果紅分子與β-葡聚糖之間的氫鍵作用力遭到破壞，不利于復合物的形成?？紤]到實際的實驗情況，反應溫度選擇在室溫下即可。

2.3.2 離子濃度的影響

因圖4b采用對數坐標，故不包括離子濃度為0時的吸光度0.020?？梢钥闯?，隨著離子濃度的增加，吸光度先顯著增加然后明顯減小。當離子濃度達到0.05 mol/L時，吸光度達到最大。離子濃度0.1 mol/L和0.05 mol/L時的吸光度基本相等。離子濃度較小時，因為少量帶負電荷的剛果紅分子與β-葡聚糖結合使β-葡聚糖分子帶負電荷，影響了更多剛果紅分子結合到β-葡聚糖上，所以此時混合液的吸光度較小。隨著離子濃度的增加，部分剛果紅分子的負電荷被屏蔽，減少了剛果紅分子與β-葡聚糖分子間的靜電斥力，有利于更多的剛果紅與β-葡聚糖結合形成復合物，故吸光度增加。當離子濃度過大時，剛果紅分子負電荷被屏蔽程度進一步增大，促使其自身聚集程度增加，所形成的剛果紅聚集體難以結合到β-葡聚糖分子上，減少了復合物的形成，故吸光度又減小?？紤]到0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液緩沖能力較強，選擇離子濃度為0.1 mol/L。

圖4 測定條件的影響

2.3.3 緩沖液pH值的影響

由圖4c可以看出，隨著緩沖液pH值的增大，吸光度呈現先增加后減小的趨勢。當pH值為7.5時，吸光度達到最大值。推測在該pH條件下，剛果紅分子與β-葡聚糖能較好的結合形成深紅色的復合物，故選擇緩沖液pH值7.5。

2.3.4 反應時間的影響

由圖4c可以看出，隨著反應時間的增加，吸光度不斷增加。其中0～10 min范圍內，吸光度顯著增加；10～20 min范圍內，吸光度緩慢增加；30 min以后，吸光度基本穩(wěn)定。推測剛果紅分子結合到葡聚糖分子上形成復合物是一個動態(tài)過程，此過程達到平衡需要一定的時間，在試驗條件下，經30 min基本達到平衡。故選擇反應時間為30 min，以獲得較為穩(wěn)定的吸光度值。

2.3.5 淀粉的影響

因圖4d采用對數坐標，故不包括未添加淀粉時的吸光度0.257?？梢钥闯觯數矸叟c葡聚糖濃度比值小于10時，吸光度基本穩(wěn)定，比值大于10時，吸光度明顯減小。這可能是因為在含較高淀粉濃度的溶液中，淀粉與剛果紅相互作用，形成了類似碘與淀粉所形成的包合物，阻礙了剛果紅分子與葡聚糖分子的結合，造成了吸光度的降低。但是，剛果紅與淀粉間的結合作用較弱，因此，當體系中淀粉濃度較低時，對吸光度影響較小。由圖4d可見，當淀粉與葡聚糖濃度比值小于10時，淀粉對測定燕麥β-葡聚糖含量幾乎沒有影響。

2.3.6 蛋白質的影響

因圖4d采用對數坐標，故不包括未添加蛋白質時的吸光度0.256。可以看出，當蛋白質與葡聚糖濃度比值小于5時，吸光度基本穩(wěn)定，比值大于5時，吸光度下降明顯。這可能是因為較高濃度蛋白質溶液中，蛋白質與剛果紅發(fā)生了結合，從而影響了剛果紅與葡聚糖分子的結合[18-19]。當蛋白質與葡聚糖濃度比值小于5時，蛋白質對測定燕麥β-葡聚糖含量幾乎沒有影響。

2.3.7 光照的影響

因為光照可能會使剛果紅分子發(fā)生順反異構變化，從而可能影響剛果紅與β-葡聚糖的結合，所以分別在正常光照條件和避光條件下進行對比實驗。由表2可以看出，正常光照條件和避光條件下，在550 nm處5次重復試驗的平均吸光度基本相同。因此，認為光照對測定燕麥β-葡聚糖含量沒有影響。

表2 光照對復合物測定的影響

2.4 精密度和加樣回收率試驗

2.4.1 精密度試驗

通過對同一濃度β-葡聚糖的多次測定來檢驗分光光度法的精密度。由表2正常光照組可以看出，5次試驗結果重復性較好，RSD=0.78%，表明分光光度法測定β-葡聚糖含量有較高的精密度。

表3 加樣回收率試驗

2.4.2 加樣回收率試驗

通過對已知濃度β-葡聚糖的測定，來檢驗分光光度法的準確度。由表3可以看出，試驗結果平均回收率為101.32%，表明分光光度法測定β-葡聚糖含量有較高的準確度。

2.5 剛果紅和β-葡聚糖結合模型

圖5 ΔA～(CTΔε/ΔA-1)CG×10-9

3 結論

室溫條件下，剛果紅質量濃度50 μg/mL，pH 7.5，反應時間30 min，磷酸鹽緩沖液離子濃度0.1 mol/L時，吸光度與β-葡聚糖質量濃度在0～10 μg/mL范圍內具有線性關系。光照對分光光度法測定燕麥β-葡聚糖含量無影響，較低濃度的共存淀粉和蛋白質對測定影響較小。在試驗條件下，剛果紅與燕麥β-葡聚糖的結合常數K為4.08×106、結合位點數N為336、平均結合數n為297。剛果紅分光光度法測定燕麥β-葡聚糖含量有較好的精密度和準確度。因此，在一定條件下，剛果紅分光光度法能較好的測定燕麥β-葡聚糖的含量。

[1]汪海波，劉大川，謝筆鈞，等．改進熒光法測定β-葡聚糖含量研究[J]．中國糧油學報，2004，19(1)：70-74

[2]劉影，董利．燕麥的營養(yǎng)成分與保健作用[J]．中國食物與營養(yǎng)，2009，3：55-57

[3]Anderson J W．Plant fibre and blood pressure[J]．Annals of Internal Medicine，1983，98：842-846

[4]Anderson J W．Dietary fibre and human health[J]．Horticultural Science，1990，25：1488-1495

[5]Anderson A A M，Armo E，Fredriksson H，et al．Molecular weight and structure of (1→3)，(1→4)-β-D-glucans in dough and bread made from hull-less barley milling fractions[J]．Journal of Cereal Science，2004，40：195-204

[6]Hallfrisch J，Scholfield D J，Behall K M．Physiological responses of men and women to barley and oat extracts (Nu-trimX)．II．Comparison of glucose and insulin responses[J]．Cereal Chemistry，2003，80(1)：80-83

[7]涂杰，張新申，俞凌云，等．流動注射剛果紅光度法快速測定谷物制品中β-葡聚糖含量的方法[J]．糧食與飼料工業(yè)，2009，2：46-48

[8]Switala K J，Schick K G，Griffith A，et al．Rapid determination of beta-glucan in wort by flow injection analysis[J]．Journal of the American Society of Brewing Chemists，1989，47(2)：54-56

[9]YunC H，Estrada A，Van K A，et al．Immunomodulatory effects of oat β-glucan administered intragastrically or parenterally on mice infected withEimeriavermiformis[J]．Microbiogy and Immunology，1998，42(6)：457-465

[10]McCleary B V，Codd R．Measurement of (1→3)，(1→4)-β-D-glucan in barley and oats：a streamlined enzymic procedure[J]．Journal of the Science of Food and Agriculture，1991，55：303-312

[11]Munck L，Jorgensen K G，Ruud-Hansen J，et al．The EBC methods for determination of high molecular weight β-glucan in barley，malt，wort and beer[J]．Journal of the Institute of Brewing，1989，95：79-82

[12]Rieder A，Knutsen S H，Ballance S，et al．Cereal β-glucan quantification with calcofluor-application to cell culture supernatants[J]．Carbohydrate Polymers，2012：1564-1572

[13]Wood P J，Weisz J．Use of calcofluor in analysis of oat beta-D-glucan[J]．Cereal Chemistry，1984，61(1)：73-75

[14]Wood P J，Paton D，Siddigui L R，et al．Determination of β-glucan in oats and barley[J]．Cereal Chemistry，1977，54(3)：524-533

[15]張娟，杜先鋒，饒硯琴．剛果紅法測定燕麥中β-葡聚糖含量的研究[J]．安徽農業(yè)大學學報，2007，34(1)：23-26

[16]Jiao Q，Liu C，Sun Q，et al．Investigation on the binding site in heparin by spectrophotometry[J]．Talanta，1999，48：1095-1101

[17]Wu J，Deng X，Tian B Q，et al．Interactions between oat β-glucan and calcofluor characterized by spectroscopic method[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56：1131-1137

[18]詹國慶，羅登柏，譚祖憲，等．蛋白質與剛果紅結合反應的研究[J]．分析科學學報，2004，20(4)：370-372

[19]馬衛(wèi)興，錢保華，楊緒杰，等．剛果紅與蛋白質相互作用的分光光度研究及分析應用[J]．理化檢驗化學分冊，2005，41(7)：492-494.

Quantification of Oat β-Glucan by Spectrophotometry

Zhang Ru Dai Qiaoling Wu Xiaoyan Li Linlin Chen Yuansheng Wu Jia

(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116)

Spectrophotometry was used to determine the content of oat β-glucan. The effects of some factors were investigated, including the concentration of Congo red and oat β-glucan, reaction temperature, pH, reaction time, ion concentration, exposure to light, and the starch and protein coexisting in the system. The binding equilibrium constant K, the total number of binding sites per β-glucan molecule N, and the binding number of Congo red per β-glucan molecule n were determined by chemometrics based on the analysis of ultraviolet-visible absorption spectra. The results showed that the absorbency had a linear relationship with β-glucan in the concentration from 0 to 10 μg/mL under the condition that room temperature, Congo red concentration 50 μg/mL, pH 7.5, reaction for 30 min, and ion concentration 0.1 mol/L. Exposure to light had no effect on the determination. Starch and protein had a relatively low effect on the absorbency. The binding equilibrium constant K, binding sites N and average binding numbernare 4.08×106, 336 and 297, respectively under the experimental conditions.

oat,β-glucan,congo red,spectrophotometry,binding model

TS201.2

A

1003-0174(2016)06-0140-06

國家自然科學基金項目(31101224)，福建省自然科學基金項目(2013J05049)

2014-09-24

張如，男，1989年出生，碩士，食品工程

吳佳，男，1980年出生，副教授，食品化學