紅花籽油的抗氧化功能研究

胡 濱 陳一資 王雪銘 蘇 趙

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014)

紅花籽油的抗氧化功能研究

胡 濱 陳一資 王雪銘 蘇 趙

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014)

針對紅花籽油的抗氧化功能進(jìn)行研究，通過其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除能力以及還原能力的測定，進(jìn)行體外抗氧化試驗；在體內(nèi)抗氧化試驗中，將60只雄性昆明種小鼠分為6組，其中陰性對照組和模型對照組給予蒸餾水，陽性對照組每日灌胃0.02 g/kg bw VE，3個試驗組每日分別灌胃0.625、1.25、2.5 g/kg bw紅花籽油，連續(xù)灌胃30 d。末次灌胃后，除陰性對照組外，模型對照組、陽性對照組和3個試驗組均給予50%乙醇12 mL/kg bw造過氧化損傷，6 h后取樣測定血清和肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽、丙二醛和蛋白質(zhì)羰基的含量。結(jié)果表明：在體外抗氧化試驗中，紅花籽油對化學(xué)體系產(chǎn)生的自由基具有較強(qiáng)清除能力，同時還具有還原能力；在體內(nèi)抗氧化試驗中，紅花籽油能顯著提高血清和肝臟SOD、GSH-Px、GSH水平，降低MDA和PC含量，對乙醇所致機(jī)體過氧化性損傷起保護(hù)作用，以0.625 g/kg bw劑量效果最佳。結(jié)論：紅花籽油具有抗氧化作用，但不能過量攝入。

紅花籽油 自由基 抗氧化 小鼠

紅花，是菊科紅花屬的一種集藥材、油料、染料和飼料為一體的特種經(jīng)濟(jì)作物，在我國已有兩千多年種植歷史。據(jù)《本草綱目》記載，紅花出自西域，味甘、無毒，其籽功與花同。紅花籽是紅花的種籽，紅花籽油是紅花種籽經(jīng)過壓榨等工藝精制而成，屬于高度不飽和脂肪酸油類，其中富含亞油酸、維生素E、黃酮等物質(zhì)[1]。研究表明，紅花籽油具有特殊的營養(yǎng)價值食品，長期食用具有輔助調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心腦血管疾病等作用[2-3]。

自由基是一類能與生物膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、DNA等生物大分子相互作用，并引起機(jī)體氧化損傷的物質(zhì)。機(jī)體過量的自由基與衰老、腫瘤、心血管疾病、免疫功能低下等很多退行性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。因此，尋找天然、無毒、高效的抗氧化活性成分，對維持健康、延緩衰老具有重要作用，現(xiàn)已成為多個學(xué)科領(lǐng)域的研究重點。目前紅花籽油的功能研究多集中在輔助調(diào)節(jié)血脂、提高免疫等方面[4]，而有關(guān)其抗氧化功能的具體研究卻很少報道。為此本試驗旨在以紅花籽油作為受試物，通過體外、體內(nèi)抗氧化試驗分別研究其抗氧化活性，為更廣泛利用紅花籽油資源和開發(fā)新的抗氧化補(bǔ)充劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 受試物及實驗動物

紅花籽油(Safflower seed oil，SSO)：新疆某公司純天然壓榨工藝生產(chǎn)，其中維生素E含量：630mg/kg，總黃酮含量：620 mg/kg。

雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，小鼠專用生長維持飼料，均由四川大學(xué)華西實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(川)-10-2006。

1.2 主要儀器和試劑

TE412-L電子天平：德國Sartorius公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；Thermo Fisher(St16r型)冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；UV-3200型紫外/可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；XHF-D型高速分散器：寧波新芝生物科技有限公司；7890A型氣相色譜儀：安捷倫科技(中國)有限公司。

超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測試盒、蛋白質(zhì)羰基(PC)均由南京建成生物工程研究所提供。DPPH：美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、維生素E、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、過氧化氫、磷酸鈉、無水乙醇等：均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 紅花籽油脂肪酸的組成分析

紅花籽油中脂肪酸的甲酯化制備按照GB/T 17376—2008(動植物油脂 脂肪酸甲酯制備)進(jìn)行；紅花籽油中脂肪酸的組成按照GB/T 17377—2008(動植物油脂 脂肪酸甲脂的氣相色譜分析)方法。

1.3.2 體外抗氧化試驗

1.3.2.1 清除DPPH·能力的測定

1.3.2.3 清除羥自由基(·OH)能力的測定

1.3.2.4 還原力的測定

還原力的測定參考Christodouleas等[8]的方法。在具塞試管中加入2.0 mL不同質(zhì)量濃度的紅花籽油乙醇溶液，2 mL 0.25 mol/L的Na3PO4緩沖液(pH 6.6)，2 mL 1% K3[Fe(CN)6]，置于37 ℃恒溫水浴中保溫20 min后迅速冷卻，再加入10%三氯乙酸溶液2 mL，取反應(yīng)液2 mL，加入2 mL去離子水和1%的FeCl3溶液0.4 mL，混合10 min后，在700 nm處用無水乙醇調(diào)零測定其吸光值。

1.3.3 體內(nèi)抗氧化試驗

按照“國食藥監(jiān)?；痆2012]107號”文中《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》要求，采用乙醇造動物過氧化損傷模型進(jìn)行體內(nèi)抗氧化試驗[9]。將60只雄性昆明種小鼠按體重隨機(jī)分為6組，分別為陰性對照組、模型對照組、陽性對照組和3個試驗組，每組10只，分籠喂養(yǎng)。3個試驗組以0.625 g/kg bw(Ⅰ組)、1.25 g/kg bw(Ⅱ組)、2.5 g/kg bw(Ⅲ組)劑量灌胃紅花籽油(分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的1.25、2.5、5倍)，陰性對照組、模型對照組給予等體積蒸餾水，陽性對照組每日以0.02 g/kg bw劑量灌胃維生素E，每日早晨進(jìn)食前灌胃，連續(xù)灌胃30 d。末次灌胃后，模型對照組、3個試驗組和陽性對照組禁食16 h后，再1次性灌胃50%乙醇12 mL/kg bw，6 h后摘除眼球取血液和剖解取肝臟(陰性對照組不禁食取樣)，測定其中SOD、GSH-PX活性及GSH、MDA、PC含量[10-11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花籽油的脂肪酸組成

由表1可知，紅花籽油共分離鑒定出8個峰，采用峰面積歸一法確定了各組分的相對含量。紅花籽油中不飽和脂肪酸含量豐富，占總油量的90.9%，飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，為9.1%。尤其亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)73.1%，油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.5%。

表1 紅花籽油的脂肪酸組成/%

2.2 紅花籽油體外抗氧化試驗結(jié)果

2.2.1 紅花籽油對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其孤對電子在517 nm波長附近有強(qiáng)吸收；若有自由基清除劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱。因此通過測定吸收減弱的程度，可以評價受試物的抗氧化活性。Gai等[12]通過研究連翹籽油對DPPH·的清除能力證實了連翹籽油具有體外抗氧化活性。由圖1可知，在本試驗濃度范圍內(nèi)，紅花籽油對DPPH·具有一定的清除能力。當(dāng)紅花籽油的質(zhì)量濃度小于8 mg/mL時，紅花籽油對DPPH·的清除能力隨其濃度增大而迅速升高；當(dāng)紅花籽油的質(zhì)量濃度大于8 mg/mL時，紅花籽油對DPPH·的清除能力隨著其濃度增加而緩慢升高。通過該清除率曲線得出回歸方程y=16.61+4.85x，其中R2(決定系數(shù))=0.974 1，r(相關(guān)系數(shù))=0.987 0，通過查表知r>r0.01=0.917，即r極顯著(P<0.01)，表明紅花籽油的濃度與DPPH·的清除能力存在極顯著相關(guān)關(guān)系。所以在本試驗濃度范圍內(nèi)，清除率曲線回歸方程可用于紅花籽油對DPPH·清除能力的預(yù)測，得出紅花籽油對DPPH·的IC50為6.89 mg/mL。

圖1 SSO對DPPH·的清除作用

圖2 SSO對的清除作用

2.2.3 紅花籽油對·OH的清除作用

·OH是體內(nèi)活性最強(qiáng)的自由基，是在生命活動的氧化代謝過程中產(chǎn)生的，可導(dǎo)致大量疾病發(fā)生。因此對·OH清除率的檢測具有重要意義。朱紅葉等[14]研究發(fā)現(xiàn)黑莓籽油對·OH具有較強(qiáng)的清除能力，證實了黑莓籽油具有體外抗氧化活性。由圖3可知，在本試驗濃度范圍內(nèi)，紅花籽油對·OH具有明顯的清除能力。當(dāng)紅花籽油的質(zhì)量濃度小于8 mg/L時，紅花籽油對·OH自由基的清除能力隨其濃度增大而顯著升高；當(dāng)紅花籽油質(zhì)量濃度大于8 mg/mL時，紅花籽油對·OH的清除能力隨著濃度增加而增幅減緩。通過該清除率曲線得出回歸方程y=7.78+4.64x，其中R2(決定系數(shù))=0.983 8，

r(相關(guān)系數(shù))=0.991 9，通過查表知r>r0.01=0.917，即r極顯著(P<0.01)，表明紅花籽油的濃度與·OH的清除能力存在極顯著相關(guān)關(guān)系。所以在本試驗濃度范圍內(nèi)，清除率曲線回歸方程可用于預(yù)測紅花籽油對·OH的清除能力，得出紅花籽油對·OH的IC50為9.11 mg/mL。

2.2.4 紅花籽油的還原能力

通常情況下，還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)，可通過測定還原力來反映抗氧化活性強(qiáng)弱。若樣品在波長700 nm處的吸光值越大，則其還原能力越強(qiáng)。林海[15]采用鐵氰化鉀法研究不同濃度的歐李仁油在700 nm處的吸光值大小，表明其隨著濃度增加吸光值越大，證實了歐李仁油具有較強(qiáng)的還原能力。由圖4可知，在本試驗濃度范圍內(nèi)，紅花籽油的吸光度值隨著濃度的增加而增大，表明紅花籽油具有一定的還原能力，可作為一種良好的電子供體終止自由基鏈?zhǔn)降姆磻?yīng)。

圖4 SSO的還原能力

2.3 紅花籽油體內(nèi)抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1 紅花籽油對小鼠體重的影響

試驗期間各組小鼠食欲、飲水正常，活潑好動，精神良好，皮毛順滑有光澤。體重測定結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠平均體重測定結(jié)果(n=10)

由表2可知，試驗初期，各組小鼠體重差異不顯著(P>0.05)；試驗?zāi)┢?，試驗Ⅲ組體重高于其他組，但差異未達(dá)到顯著水平。所以，在整個試驗期間，各組小鼠的體重差異不顯著(P>0.05)，表明在本試驗條件下紅花籽油對小鼠的生長發(fā)育和健康情況無不良影響。

2.3.2 紅花籽油對小鼠主要臟器系數(shù)的影響

臟器指數(shù)可以在一定程度上反映灌胃的受試物對小鼠器官的影響，從而對受試物可能的毒副作用進(jìn)行分析。由表3可知，各組小鼠的心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、肺臟系數(shù)、腎臟系數(shù)彼此之間差異不顯著(P>0.05)，表明灌胃紅花籽油未對小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟造成不良影響。

表3 各組小鼠臟器系數(shù)測定結(jié)果(n=10)

2.3.3 紅花籽油對小鼠血清中SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC的影響

各組試驗動物血清中SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC的測定結(jié)果見表4。

表4 小鼠血清SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC的測定結(jié)果(n=8)

注：同行肩標(biāo)相同大寫或小寫宇母表示差異不顯著，如A和A，a和a；肩標(biāo)相同大小寫宇母或不同小寫宇母表示差異顯著，如A和a，a和b；肩標(biāo)不同大寫字母，或不同大小寫宇母表示差異極顯著，如A和B，A和b；下表同。

本試驗采用1次給動物灌胃大劑量的乙醇，以建立動物過氧化損傷模型進(jìn)行研究。當(dāng)乙醇大量攝入，可激活氧分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞的過氧化效應(yīng)及體內(nèi)GSH的耗竭。而GSH的主要作用是清除體內(nèi)自由基，以保護(hù)蛋白質(zhì)和酶分子中的巰基。SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD能夠清除超氧陰離子自由基，GSH-Px能催化過氧化氫的分解，這兩種酶活性的變化能反映機(jī)體氧化損傷的程度。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，PC是蛋白質(zhì)在氧化修飾過程中出現(xiàn)損傷的標(biāo)志，它們的變化均可反映組織細(xì)胞損傷的程度。由表4可知，模型對照組小鼠血清中的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與陰性對照組相比差異極顯著(P<0.01)，表明乙醇氧化損傷模型造模成功。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與陰性對照組、模型對照組和陽性對照組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。Ⅰ組、Ⅱ組的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與Ⅲ組相比差異顯著(P<0.05)，Ⅰ組與Ⅱ組差異不顯著(P>0.05)。這表明Ⅰ組小鼠灌胃0.625 g/kg bw紅花籽油具有升高乙醇氧化損傷小鼠血清SOD、GSH-Px、GSH含量和降低血清MDA、PC含量的作用。Ⅱ組小鼠灌胃1.25 g/kg bw紅花籽油表現(xiàn)出血清和肝臟的SOD、GSH-Px、GSH含量下降，MDA和PC含量有上升的趨勢，但差異不顯著。Ⅲ組小鼠灌胃2.5 g/kg bw紅花籽油時血清和肝臟SOD、GSH-Px、GSH水平顯著下降，MDA和PC含量明顯上升，抗氧化能力低于Ⅰ組、Ⅱ組。這可能是由于紅花籽油的大量攝入，導(dǎo)致機(jī)體能量大幅增加，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得抗氧化能力下降，這也表明高劑量油脂攝入對機(jī)體抗氧化能力沒有促進(jìn)作用，還可能產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。王敏等[16]通過連續(xù)6周給動物灌胃不同劑量苦蕎胚油，發(fā)現(xiàn)中劑量組具有抗氧化作用，而高劑量組作用不明顯。所以，本試驗結(jié)果與同類研究結(jié)果類似。

2.3.4 紅花籽油對小鼠肝組織SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC的影響

各組試驗動物肝組織中SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC的測定結(jié)果見表5。

表5 小鼠肝臟SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC的測定結(jié)果(n=8)

通常機(jī)體各種氧化還原反應(yīng)均可在肝臟進(jìn)行，使得肝臟成為各種活性氧攻擊的主要目標(biāo)，因此對肝臟抗氧化能力的檢測顯得尤為重要。由表5可知，模型對照組小鼠肝組織中的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與陰性對照組相比差異極顯著(P<0.01)，表明乙醇過氧化肝損傷模型造模成功。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與陰性對照組、模型對照組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；Ⅰ組、Ⅱ組的SOD、GSH-PX、GSH含量與陽性對照組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)，Ⅰ組、Ⅱ組的MDA、PC含量與陽性對照組相比不顯著(P>0.05)；Ⅲ組的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與陽性對照組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；Ⅰ組、Ⅱ組的SOD、GSH-PX、GSH、MDA、PC含量與Ⅲ組相比差異顯著(P<0.05)，Ⅰ組與Ⅱ組差異不顯著(P>0.05)，這表明Ⅰ組小鼠灌胃0.625 g/kg bw紅花籽油對乙醇過氧化肝損傷小鼠肝組織中的SOD、GSH-Px、GSH含量具有升高作用，而對肝組織中的MDA、PC含量有降低作用。Ⅱ組的抗氧化能力略低于Ⅰ組，但差異不顯著。Ⅲ組的抗氧化能力低于Ⅰ組、Ⅱ組。這也可能是由于紅花籽油中亞油酸含量較高，當(dāng)其大量攝入后，亞油酸在肝組織可大量合成花生四烯酸，而過量的花生四烯酸可在環(huán)氧化酶和脂氧化酶的作用下產(chǎn)生前列腺素E、白三烯B4等細(xì)胞源性炎癥介質(zhì)，這可加重肝臟的應(yīng)激反應(yīng)，使得其抗氧化能力下降[17]。苗利利等[18]研究發(fā)現(xiàn)給小鼠連續(xù)灌胃不同劑量的石榴籽油，低劑量組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性明顯高于對照組，表現(xiàn)出抗氧化作用。所以，本試驗結(jié)果與同類研究結(jié)果類似。

3 討論

紅花籽油的抗氧化作用與其所含有的多種抗氧化成分關(guān)系密切，其中不飽和脂肪酸含量豐富，尤其亞油酸含量高達(dá)73.1%，油酸含量為16.5%。而亞油酸作為必需脂肪酸參與磷脂的合成，并以磷脂形式構(gòu)建線粒體和細(xì)胞膜，在維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性防止過氧化損傷中起重要作用。而油酸在體內(nèi)也具有輔助抗氧化的作用。Rezig等[19]通過研究南瓜籽油的抗氧化活性證實，其所含的不飽和脂肪酸(亞油酸、油酸)具有抗氧化的作用。Ting等[20]通過體內(nèi)和體外抗氧化試驗證實富含不飽和脂肪酸的沙棘籽油具有明顯抗氧化作用。董迪迪等[21]研究楊梅籽油的抗氧化活性證實，楊梅籽油富含的多種不飽和脂肪酸與其抗氧化作用關(guān)系密切。通常，體內(nèi)存在內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶類抗氧化系統(tǒng)，如SOD、GSH-Px等；以及非酶類抗氧化系統(tǒng)，如GSH、VE等，二者均可有效清除多余自由基，使體內(nèi)氧化與還原反應(yīng)保持平衡狀態(tài)。紅花籽油中VE含量豐富，VE又具有很強(qiáng)的抗氧化作用，它通過自身苯環(huán)的羥基失去電子或H+，以清除氧自由基和過氧化物，間接提高體內(nèi)抗氧化酶的活性。馬玲等[22]研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽油具有抗氧化作用不僅與其所含有的亞麻酸有關(guān)，還與其富含VE有關(guān)。此外，紅花籽油中還富含黃酮類物質(zhì)，而后者具有明顯的抗氧化活性，它通過直接清除自由基、促進(jìn)GSH生成以及間接誘導(dǎo)抗氧化酶的產(chǎn)生等作用提高體內(nèi)的抗氧化功能[23]。

4 結(jié)論

本試驗通過模擬化學(xué)體系產(chǎn)生自由基研究紅花籽油的體外抗氧化作用，再通過連續(xù)30 d對小鼠灌胃不同劑量的紅花籽油后，以1次大劑量灌胃乙醇造成動物過氧化損傷以研究紅花籽油的體內(nèi)抗氧化作用。試驗結(jié)果按照“國食藥監(jiān)?；痆2012]107號”文中《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知》的評定標(biāo)準(zhǔn)，紅花籽油具有抗氧化作用，其抗氧化作用與其濃度有關(guān)，適量攝入可以顯著提高小鼠機(jī)體的抗氧化能力。所以，紅花籽油在食用過程中不能過量攝入。

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The Antioxidant Activity of Safflower Seed Oil

Hu Bin Chen Yizi Wang Xueming Su Zhao

(College of Food engineering, Sichuan Agricultural University, Ya′an 625014)

To investigate the antioxidant activity of Safflower seed oil (SSO). The antioxidant activity of SSO in vitro was evaluated by determining the abilities to scavenge DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radicals as well as reducing power. Totally 60 male mice of Kunming in vivo were classified into six groups. The negative control group and model control group were administered intragastrically distilled water, and positive control group was administered intragastrically a dose of 0.02 g/kg bw Vitamin E. Three test groups of mice were administered intragastrically respectively at a dose of 0.625, 1.25 and 2.5 g/kg bw SSO. After 30 consecutive days of intragastric administration, all mice except for negative control group were given by 50% alcohol at a dose of 12 mL/kg bw to induce liver injury. At 6h after alcohol administration, all mice were killed. Their bloods and liver were collected for the measurement of superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX),glutathione transferase (GSH), malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl (PC).The result shown that SSO had relatively strong scavenging power for DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radicals, and possessed reducing power in vitro experiment. And SSO significantly increased the content of SOD, GSH-PX, GSH, and decreased the content of MDA and PC in serum and liver. So SSO had protective function for the alcohol-induced injury in vivo experiments, especially the dose of 0.625 g/kg bw was optimum. Conclusion: SSO had antioxidant activities, but it can′t be overused and be paid attention to the dosage in the diet.

safflower seed oil, free radicals, antioxidant activity, mice

TS229

A

1003-0174(2016)06-0086-07

四川省教育廳課題(2014-450-55)

2014-10-01

胡濱，男，1975年出生，副教授，博士，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)

陳一資，女，1941年出生，教授，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)