油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取工藝及活性研究

劉 普 李小方 牛亞琪 鄧瑞雪 董俊青 尹衛(wèi)平

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術(shù)研究中心 河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，洛陽 471023)

油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取工藝及活性研究

劉 普 李小方 牛亞琪 鄧瑞雪 董俊青 尹衛(wèi)平

(河南省伏牛山野生藥材基源工程技術(shù)研究中心 河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，洛陽 471023)

以低聚茋類化合物提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素研究的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物的提取條件，并對(duì)提取物的抗菌、抗氧化及抑制腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為40∶1 mL/g，水浴溫度70 ℃，超聲時(shí)間40 min，在此條件下低聚茋類總提取率達(dá)到6.39%。活性測(cè)試顯示油用牡丹中低聚茋類化合物具有較好的抗菌、抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞的活性。

油用牡丹 低聚茋類化合物 響應(yīng)面法 生物活性

牡丹為芍藥科落葉灌木，是原產(chǎn)中國(guó)著名的觀賞花卉。牡丹全身是寶，其根皮、花、葉、種子等均可被應(yīng)用。2011年3月，國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)由丹鳳(PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang)和紫斑牡丹(P.rockii)的種子經(jīng)壓榨法制備的牡丹籽油可以作為新資源食品應(yīng)用(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2011年第9號(hào)公告)。牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸[1]，具有非常重要的保健及藥用價(jià)值。研究表明，不脫殼油用牡丹籽榨油后的籽餅粕中含有較多的低聚茋類化合物[2]。

低聚茋類化合物是一類具有1, 2-二苯乙烯骨架的聚合物的總稱，主要由白藜蘆醇及其衍生物以同種或異種單體經(jīng)脫氫后形成的聚合度不等的天然產(chǎn)物。近年來，低聚茋類化合物由于具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和良好的生物活性[3-6]，而備受研究者的關(guān)注[7]。

目前鮮見油用牡丹籽餅粕低聚茋類化合物提取工藝及活性研究的報(bào)道。本研究通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物的提取工藝，并通過抗菌、抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞作用來探討提取物的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油用牡丹籽餅粕由洛陽全福食品有限公司提供，為不脫殼紫斑牡丹(P.rockii)種子用壓榨法榨油后剩余部分。原植物由河南科技大學(xué)侯小改教授鑒定，種子標(biāo)本(FNS201301)存放于河南科技大學(xué)伏牛山天然產(chǎn)物資源標(biāo)本館。

牡丹醇A (Suffruticosol A)：自制，純度>98%(HPLC)；鉬酸鈉：天津市化學(xué)試劑四廠；鎢酸鈉，無水碳酸鈉，溴素，磷酸，磷鉬酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸，濃鹽酸，硫酸鋰：天津市博迪化工有限公司；沒食子酸，2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：阿拉丁試劑；PBS磷酸鹽緩沖劑，MTT(噻唑蘭)，F(xiàn)BS特級(jí)胎牛血清，DMEM高糖型培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；超純水：自制。

人肝癌HepG2和Hep3B細(xì)胞株由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。金黃色葡萄球菌(S.aureas)，白葡萄球菌(S.cremoris)、乳房鏈球菌(S.uberis)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，大腸桿菌(E.agalactiae)，綠膿假單胞菌(P.pyocyaneum)等由河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Ymnl-2008DE智能溫控雙頻超聲波萃取儀：南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；UV 2501-PC紫外-可見分光光度計(jì)：島津公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-D(Ⅲ) 型循環(huán)水真空泵：河南省予華儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；HANGPING FA2004電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；H-1650臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BPN-50CH二氧化碳培養(yǎng)箱：上海一恒科技儀器有限公司；MR5000酶標(biāo)儀：上海天美生化儀器工程有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚茋類化合物的提取

稱取1.0 g牡丹籽餅粕粉末，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，控制系統(tǒng)的溫度，在超聲提取器中提取一定時(shí)間。將提取液離心，取上清液，60 ℃條件下減壓蒸發(fā)除去乙醇，殘余物用50%乙醇溶解，過濾，定容于100 mL容量瓶中，即為低聚茋類化合物提取液，4 ℃避光保存。

1.3.2 低聚茋類化合物含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu試劑法[8-9]來測(cè)定低聚茋類提取物的含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，檢測(cè)波長(zhǎng)為750 nm。所得到回歸方程為：Y=0.094 3X+0.047 (R2=0.999 6)。

分別取提取物溶液1.0 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入60 mL的水，混合后加入5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；在0.5～8 min內(nèi)，加入15 mL 20%碳酸鈉溶液，用水定容。將溶液在20 ℃放置30 min后，在波長(zhǎng)為750 nm下測(cè)定吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出低聚茋類提取物相當(dāng)于沒食子酸的量。

1.3.3 抗菌活性篩選

1.3.3.1 菌懸液的制備

取少量已活化的待測(cè)菌于裝有9 mL無菌水的試管中，充分混合，制成菌懸液，用無菌吸管取1 mL菌懸液于試管中，加無菌水9 mL，依次制成濃度106～107個(gè)/mL的菌懸液，備用[10]。

1.3.3.2 瓊脂打洞擴(kuò)散法

將上述菌株混懸液，分別涂布于厚約6 mm 的藥皿平板上，然后在其中打成直徑約6 mm 的孔，加入質(zhì)量濃度為7.5 μg/mL的樣品溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小。

1.3.3.3 瓊脂擴(kuò)散法

取低聚茋類提取物用甲醇稀釋，采用二倍稀釋法將質(zhì)量濃度配制為7.5、3.75、1.88、0.938、0.469、0.234、0.117 μg/mL。然后在血平板上點(diǎn)種上述菌株。37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)試茋類提取物的抑制菌株生長(zhǎng)的最低藥物濃度MIC。

1.3.4 抗氧化活性篩選

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定[11]

將低聚茋類提取物用乙醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液，各取2 mL于容量瓶中，分別加入濃度為0.04 mg/mL的DPPH 溶液2 mL，振搖均勻，室溫下反應(yīng)20 min，離心，吸取上清液置于比色皿中，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A1)；另外，再各取2 mL不同濃度的低聚茋類化合物溶液置于容量瓶中，分別加入無水乙醇 2 mL，按照上述方法處理后，同樣在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度(A2)；以2 mL 0.04mg/mL的DPPH和2 mL無水乙醇反應(yīng)做為參比，其吸光度記為A0。則E(DPPH)為低聚茋類提取液對(duì)DPPH自由基的清除率。

E(DPPH)=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.3.4.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定[12]

將ABTS用蒸餾水配制成2 mmol/L 溶液，取50 mL上述溶液與200 mL K2S2O8水溶液(70mmol/L) 混合均勻，避光放置12～16 h，得ABTS·+溶液。用磷酸鹽緩沖液將ABTS·+溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02。將牡丹籽餅粕低聚茋類提取物不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫物用95%乙醇配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品液，取0.1 mL不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的洗脫樣品，加入1.9 mL ABTS·+溶液，混勻，在735 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

ABTS·+自由基清除率的計(jì)算公式：

S= (A0-A)/A0×100%

式中：A0為ABTS·+溶液的吸光度，A為加樣品后的吸光度。

1.3.4.3 超氧陰離子清除率測(cè)定

用NADH-PMS-NBT法[13]測(cè)定：采用Tris-HCl 緩沖液(濃度0.05 mmol/L，pH 8.0)將低聚茋類提取物溶液稀釋成不同的質(zhì)量濃度，分別取1.5 mL溶液置于5 mL容量瓶中，然后依次加入0.5 mL 300 μmol/L的NBT，0.5 mL 468 μmol/L的NADH，0.5 mL 60 μmol/L 的PMS，充分混勻之后，放入25 ℃水中5 min，然后在560 nm下測(cè)定吸光度，以緩沖液來代替低聚茋類溶液作為空白對(duì)照。

E(超氧陰離子)=(1-A0/A1)×100%

式中：E(超氧陰離子)為牡丹籽餅粕低聚茋類提取液對(duì)超氧陰離子的清除率/%；A1為牡丹籽餅粕低聚茋類提取液的吸光度；A0為空白對(duì)照組的吸光度。

1.3.4.4 總的抗氧化活性能力測(cè)定方法[11,14]

取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1.0 mL，分別置于10 mL離心管中，加入3.0 mL試劑溶液(包括0.6 mol/L的硫酸、28 mmol/L的磷酸鈉、4 mmol/L的鉬酸銨)?；旌弦河?5 ℃水浴鍋中水浴90 min。冷卻至室溫，在695 nm處測(cè)吸光度。以蒸餾水為空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.4.5 亞鐵離子還原(FRAP)能力測(cè)定方法[11,14]

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取6.08 mg硫酸亞鐵，溶于適量的水中，加入18 mol/L的硫酸0.25 mL, 再加水定容至50 mL，并放入小鐵釘。取上述溶液5 mL，加水定容至50 mL，即為800 μmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。用該溶液配制梯度FeSO4溶液，包括400、200、100、50、25 μmol/L，于593 nm測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取不同質(zhì)量濃度的各樣品溶液0.3 mL，加2.7 mL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液，搖勻后放置10 min，于593 nm測(cè)其吸光度值，以無水乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白，每個(gè)質(zhì)量濃度做3次，求平均值。根據(jù)所得吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4濃度，定義為FRAP值，其值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。

1.3.5 抑制腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試

1.3.5.1 細(xì)胞株懸浮液制備

將腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)在培養(yǎng)液(含F(xiàn)BS胎牛血清，青霉素和鏈霉素各100單位/mL及0.03%谷氨酰胺)中，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將生長(zhǎng)較好的細(xì)胞放入離心管離心，棄上清液。往離心管中加入PBS，用移液管反復(fù)吹吸，使所有的細(xì)胞都處于懸浮狀態(tài)。

1.3.5.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞，100 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)副孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待大部分細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)板取出，加藥，培養(yǎng)24 h，每孔加MTT 20 μL(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)。然后小心吸出孔中所有的液體，然后每孔加入100 μL異丙醇，繼續(xù)培養(yǎng)15 min，然后將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中，在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各組吸光度(A)值。

按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

抑制率=[(對(duì)照組A值-試驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，曲線的回歸方程為：Y=0.094 3X+0.004 7，R2= 0.999 6，式中：X為樣品質(zhì)量濃度(μg/mL)；Y為吸光度值。方程表明，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.5～0.35 μg/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間20 min，提取溫度40 ℃，在液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g的條件下研究液料比對(duì)提取率的影響。

由圖2 可得出，提取率在3.54%～3.86%之間變化，隨著提取液用量的增加，提取率在不斷增加。當(dāng)液料比達(dá)到30∶1 mL/g時(shí)，達(dá)到3.86%，再增加提取劑用量時(shí)，提取率變化不顯著。為節(jié)省溶劑同時(shí)兼顧茋類提取率，液料比選擇30∶1 mL/g較優(yōu)。

圖2 茋類提取物提取率隨液料比變化曲線

2.2.2 乙醇濃度的影響

固定液料比30∶1 mL/g，提取時(shí)間20 min，提取溫度40 ℃，分別以20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液作提取劑來考察提取率的影響。

圖3 茋類提取物提取率隨乙醇濃度變化曲線

由圖3可以得知，隨著乙醇濃度的增大，提取率在1.60%～4.35%之間變化。當(dāng)達(dá)到70%乙醇時(shí)，提取率達(dá)到最大值4.35%。隨后再增加乙醇濃度，反而下降。因此牡丹籽餅提取茋類化合物時(shí)，選用70%乙醇為宜。

2.2.3 提取時(shí)間的影響

固定液料比30∶1 mL/g，70%乙醇，提取溫度40 ℃，研究超聲提取時(shí)間分別為15、20、25、30、35、40 min時(shí)對(duì)提取率的影響。

圖4 茋類提取物提取率隨超聲時(shí)間的變化曲線

從圖4可以看出，牡丹籽餅中茋類提取物的提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，其變化范圍在5.512%～5.853%之間。在提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取率的增加開始變得緩慢。所以牡丹籽餅提取茋類，超聲提取時(shí)間選擇為40 min較優(yōu)。

2.2.4 提取溫度的影響

固定液料比分別為30∶1 mL/g，溶劑70%乙醇，超聲提取時(shí)間40 min，研究提取溫度分別為35、45、55、65、75 ℃時(shí)對(duì)提取率的影響。

圖5 茋類提取物提取率隨提取溫度的變化曲線

由圖5可知，在35～55 ℃之間，提取率隨著超聲提取溫度的增加而明顯增加，在65 ℃時(shí)達(dá)到最大值6.218%，繼續(xù)升高溫度，提取率開始下降。此時(shí)提取牡丹籽餅中的茋類化合物應(yīng)選擇溫度為65 ℃。

由單因素試驗(yàn)可知，最優(yōu)提取條件為：液料比30∶1 mL/g，70%乙醇，超聲提取40 min，提取溫度65 ℃。

2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面分析的設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、水浴溫度對(duì)牡丹籽餅茋類提取率影響較大的因素，根Box-Beknhen[13]中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14]，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)?？偣策M(jìn)行29次試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次數(shù)據(jù)的平均值。試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 牡丹籽餅茋類提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)，選擇對(duì)茋類提取率影響顯著的液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、水浴溫度，通過響應(yīng)面分析方法，響應(yīng)面分析試驗(yàn)所得結(jié)果如表3所示。利用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，進(jìn)行回歸擬合，得茋類化合物提取率方程為：

R=5.13+1.44×A+0.36×B+0.26×C+0.41×D+0.096×A×B-5.795E-003×A×C-0.12×A×D-0.26×B×C-0.13×B×D+0.15×C×D-1.05×A2+0.23×B2-0.012×C2-0.24×D2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察。由表3知，通過方差分析，可以看出A(乙醇體積分?jǐn)?shù))，B(液料比)，C(超聲時(shí)間)，3個(gè)因素對(duì)茋類提取率影響顯著，因素影響順序?yàn)橐毫媳?乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間。模型P<0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，能夠正確地反映茋類提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時(shí)間之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.079 011>0.05，不顯著，說明本試驗(yàn)無其他因素的顯著影響，模型是合適的。

2.3.2 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 7.0軟件從模型中得到低聚茋類的理論最佳提取工藝的條件：70.55%乙醇，液料比為40∶1 mL/g，提取時(shí)間40 min，提取溫度70.08 ℃。此時(shí)提取率為6.39%。為驗(yàn)證響應(yīng)面的可行性，采用所得到的優(yōu)化后的提取條件對(duì)茋類提取率進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所采用的實(shí)際操作條件為70%乙醇，液料比為40∶1 mL/g，提取時(shí)間40 min，提取溫度70 ℃，并據(jù)此進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。平行測(cè)定3次獲平均提取率為6.39%，與理論值基本吻合。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的超聲提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.4 抗菌活性研究

測(cè)定樣品質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL抑菌圈大小，并將樣品稀釋，測(cè)定樣品最低抑菌質(zhì)量濃度。

表4 對(duì)供試菌的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(IC50)

由表4可以看出，提取物對(duì)上述幾種菌株均顯示出非常好的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.118mg/mL，最大抑菌濃度為0.469 mg/mL，尤其是對(duì)致病菌—耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，具有較好的研究開發(fā)前景。

2.5 抗氧化測(cè)試結(jié)果

2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用

如圖6所示，油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對(duì)DPPH的清除能力較強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度(IC50)約為40.52 μg/mL，在低濃度時(shí)，其清除DPPH能力大于VC，但是當(dāng)濃度大于55.2 μg/mL，清除能力小于VC。

圖6 提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.5.2 對(duì)ABTS自由基的清除作用

油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對(duì)DPPH的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)(圖7)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其IC50約為38.65 μg/mL，在相同質(zhì)量濃度時(shí)，其清除DPPH能力均大于VC，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其清除率為VC的1.3倍。

圖7 提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用

2.5.3 對(duì)超氧陰離子的清除作用

從圖8可看出，油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對(duì)超氧陰離子的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在相同濃度時(shí)，其清除DPPH能力均大于VC，低聚茋類提取物IC50約為34.68 μg/mL，小于VC的IC50值46.54 μg/mL。

圖8 提取物對(duì)超氧陰離子的清除作用

2.5.4 對(duì)羥自由基的清除作用

如圖9所示，油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對(duì)羥自由基的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，在相同濃度時(shí)，其清除DPPH能力均略小于VC，低聚茋類提取物IC50約為26.45 μg/mL，與VC的IC50值24.58 μg/mL相當(dāng)。

圖9 提取物對(duì)羥自由基的清除作用

2.5.5 總的抗氧化活性能力測(cè)定方法

低聚茋類提取物總抗氧化能力隨其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)(圖10)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在相同濃度時(shí)，其抗氧化能力均大于VC。

圖10 提取物總抗氧化能力

2.5.6 亞鐵離子還原(FRAP)能力測(cè)定方法

油用牡丹籽餅粕低聚茋類提取物對(duì)亞鐵離子還原能力(圖12)隨其質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在相同濃度時(shí)，其還原能力均略小于VC。在質(zhì)量濃度為30 μg/mL時(shí)，低聚茋類提取物的FRAP值為467.8，而VC的則為487.6，相差比較少。

圖11 硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖12 提取物亞鐵離子還原能力

2.6 抑制腫瘤細(xì)胞測(cè)試結(jié)果

從圖13和圖14可以看出，MTT法檢測(cè)出牡丹籽餅粕中茋類提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B增殖具有一定抑制作用，其抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的劑量上的依賴性。對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用稍大于對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B的抑制作用。

圖13 低聚茋類化合物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用

圖14 低聚茋類化合物對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B的抑制作用

3 結(jié)論

3.1 由掃描波長(zhǎng)可以看出，低聚茋類提取物與沒食子酸、牡丹醇A具有相同的紫外吸收波長(zhǎng)，因此，可以采用沒食子酸來測(cè)定低聚茋類化合物的含量。

3.2 油用牡丹籽餅粕中含有豐富的低聚茋類化合物[2]。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取低聚茋類化合物的條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比為40∶1 mL/g，提取時(shí)間40 min，提取溫度70 ℃。此時(shí)提取率為6.39%。

3.3 油用牡丹籽餅粕中低聚茋類提取物具有一定的抗氧化，抗菌和抑制腫瘤細(xì)胞活性。隨著牡丹籽油的應(yīng)用，油用牡丹的種植面積在逐年擴(kuò)大，副產(chǎn)物牡丹籽餅粕也會(huì)越來越多，因此，有必要對(duì)油用牡丹籽餅粕中低聚茋類化合物展開純化工藝及活性的深入研究。

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Optimization Extraction Technology of Oligostilbenes from Seed Cake of Peony for Oil and Its Bioactivities

Liu Pu Li Xiaofang Niu Yaqi Deng Ruixue Dong Junqing Yin Weiping

(Henan Engineering Technology Research Center for Funiu Mountain Wild Medicinal Source,Chemical Engineering & pharmaceutical College,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023)

Stilbene compounds extraction yield as the evaluation index and on the basis of single-factor study, using the response surface analysis to optimize extraction condition of low poly stilbene compounds in the oil with peony seed cake. Meanwhile, the antioxidant, antimicrobial and antitumor activities of total oligostilbenes extract were assessed. The optimal values of the variables were as follows: ultrasonic treatment time 40 min, extraction temperature 70 ℃, ethanol concentration in aqueous solution 70%, and liquid/solid ratio 40∶1 (mL/g). Under such conditions, the predicted value of extraction yield of total oligostilbenes extract was 6.39%. The results of the bioactivities assay showed that the extraction of total oligostilbenes displayed varying degrees of antibacterial activity, exhibited strong activities against human HepG2and Hep3B in antitumoral activity, and also had strong antioxidant capacity.

peony for oil, oligostilbenes, response surface methodology, bioactivities

TS229

A

1003-0174(2016)06-0079-08

河南省科技項(xiàng)目(152102110079，162102310202)，河南省高校項(xiàng)目(16A210019)

2014-08-24

劉普，男，1978年出生，副教授，牡丹深加工的研究與開發(fā)

鄧瑞雪，女，1978年出生，副教授，功能活性天然產(chǎn)物