反膠束體系對花生蛋白功能性與結(jié)構(gòu)的影響研究

趙曉燕 朱海濤 張炳文 湯衛(wèi)東 張立金 何 磊

(濟(jì)南大學(xué)酒店管理學(xué)院食品科學(xué)與營養(yǎng)系，濟(jì)南 250022)

反膠束體系對花生蛋白功能性與結(jié)構(gòu)的影響研究

趙曉燕 朱海濤 張炳文 湯衛(wèi)東 張立金 何 磊

(濟(jì)南大學(xué)酒店管理學(xué)院食品科學(xué)與營養(yǎng)系，濟(jì)南 250022)

研究了反膠束體系對花生蛋白功能特性、氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)的影響。與水相法所提花生蛋白相比，2種方法制備的蛋白氮溶解指數(shù)與吸水性相近；反膠束法所提花生蛋白的顏色白亮，吸油性較差，但乳化特性與起泡性特性明顯優(yōu)于水相法所提花生蛋白。此外，反膠束萃取法有利于提高花生蛋白中某些氨基酸含量，如鮮味氨基酸天門冬氨酸、谷氨酸；反膠束萃取花生蛋白酰胺帶Ι的二級結(jié)構(gòu)光譜發(fā)生了移動，無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量有一定程度的增加，β-折疊含量稍微減少，新出現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量。

反膠束 萃取 花生蛋白 功能性 結(jié)構(gòu)

花生蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，與大豆蛋白、棉籽蛋白、菜籽蛋白等植物蛋白相比，具有獨特的風(fēng)味物質(zhì)，更易消化，所含毒性物質(zhì)少，是一種理想的食品基礎(chǔ)原料。國家糧油信息中心提供的數(shù)據(jù)顯示，2013年我國花生種植面積471萬hm2，花生總產(chǎn)量1 700萬t，位居世界第一[1]。我國花生原料資源豐富，應(yīng)該充分利用這一優(yōu)勢對花生進(jìn)行精深加工，開發(fā)出更多的高活性花生蛋白產(chǎn)品，將改性后具有優(yōu)良的功能特性的花生蛋白添加到食品中，拓寬花生蛋白利用領(lǐng)域，提高花生蛋白的利用率。

蛋白的功能特性主要包括溶解性、吸水性、吸油性、乳化性及乳化穩(wěn)定性，起泡性及泡沫穩(wěn)定性等[2]。蛋白質(zhì)的這些功能性質(zhì)不僅與本身的氨基酸組成、分子大小、分子結(jié)構(gòu)有關(guān)系，還受所處環(huán)境的溫度、pH、電離強度等的影響[3]。前人對花生蛋白粉溶液的各項功能特性進(jìn)行了研究，從試驗結(jié)果可知，外界環(huán)境因素對花生蛋白的功能特性有較大的影響[4-5]。反膠束對大豆與核桃蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性的影響已有相關(guān)研究，而反膠束對花生蛋白結(jié)構(gòu)與功能性的影響研究鮮有報道[6-8]。

本試驗研究了利用AOT/正己烷反膠束體系萃取的花生蛋白的功能特性，利用氨基酸分析儀(AAA)、傅里葉紅外光譜(FTIR)等對花生蛋白進(jìn)行了研究，并與傳統(tǒng)方法制備的花生蛋白的結(jié)構(gòu)及特性進(jìn)行了對照試驗。

1 材料與方法

1.1 原料

低溫花生粕：山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)。

1.2 藥品和試劑

AOT(丁二酸二異辛酯磺酸鈉)：上海益民化工廠；正己烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀均為北京化學(xué)試劑公司?；ㄉ停荷綎|魯花集團(tuán)生產(chǎn)的5S一級壓榨花生油。

1.3 儀器和設(shè)備

FJ200-S高速分散均質(zhì)機：上海索映儀器設(shè)備有限公司；LXJ-ⅡB離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；PHSJ-3F PH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHY-2A水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；SH-3磁力攪拌器：北京金紫光科技發(fā)展有限公司；L8900氨基酸分析儀(AAA)：日本日立公司；Pekin-Elmer Model GX傅里葉紅外光譜(FTIR)：英國Pekin-Elmer公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 花生蛋白制備

1.4.1.1 反膠束法提取花生蛋白[9-10]

取濃度0.08 g/mL AOT/正己烷的反膠束溶液150 mL,加入0.05 mol/L的KCL緩沖液9 mL，搖勻，稍待片刻至溶液變澄清，加入3.75 g的100目的低溫花生粕，在40 ℃恒溫水浴中，180 r/min的速度震蕩1 h，3 000 r/min的條件下離心15 min，取上層清液得蛋白前萃液；取蛋白前萃液加入等體積的1 mol/L的KCL緩沖溶液，在40 ℃恒溫水浴中，250 r/min以上的速度震蕩1.5 h，4 500 r/min的條件下離心15 min，收集下層清液即蛋白后萃液；將后萃液放入分子質(zhì)量7 000 u的透析袋中，4 ℃條件下透析16～24 h，除去其中的電解質(zhì)離子，冷凍干燥即得花生蛋白。含水量為4.12%，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.37%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.17%(凱氏定氮法檢測)。

1.4.1.2 水相法提取花生蛋白[10]

取300 mL KH2PO4+Na2HPO4緩沖液(調(diào)節(jié)pH 7.0)加入15 g 100目的低溫花生粕，在40 ℃恒溫水浴中，250 r/min以上的速度震蕩2 h，4 500 r/min的條件下離心15 min，取上層清液；將上層清液在12 000 r/min的條件下高速離心20 min，所得清夜即為蛋白提取液；將上層清液放入分子質(zhì)量7 000 u的透析袋中，4 ℃條件下透析16～24 h，除去其中的電解質(zhì)離子，冷凍干燥即得花生蛋白。含水量為3.95%，粗脂肪質(zhì)量數(shù)為8.92%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.65%(凱氏定氮法檢測)。

1.4.2 花生蛋白功能特性研究

1.4.2.1 花生蛋白氮溶解指數(shù)(NSI)的測定

花生蛋白氮溶解指數(shù)(NSI)測定參照GB 5511—1985。

1.4.2.2 花生蛋白吸水性的測定[2]

花生蛋白的吸水性是指每克花生蛋白結(jié)合水的克數(shù)，測定方法：稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)花生蛋白粉，放入已稱重的50 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水，同時攪拌，至花生蛋白完全潤濕，室溫下放置30 min，在3 000 r/min的條件下離心15 min，棄掉上層清液后稱重。吸水性的計算如式(1)所示。

吸水性=(吸水后樣品質(zhì)量-吸水前樣品質(zhì)量)/吸水前樣品質(zhì)量

(1)

1.4.2.3 花生蛋白吸油性的測定[12]

準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)花生蛋白粉，放入已稱重的15 mL離心管中，加入3 mL花生油，用玻璃棒攪拌5 min至混合均勻，室溫下靜置30 min，在3 000 r/min的條件下離心15 min，吸去上層未吸附的花生油，稱重。吸油性的計算如式(2)。

吸油性=(吸油后樣品質(zhì)量-吸油前樣品質(zhì)量)/吸油前樣品質(zhì)量

(2)

1.4.2.4 花生蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定[13]

準(zhǔn)確稱取2.5 g(精確到0.000 1 g)花生蛋白粉，分散于50 mL蒸餾水中，再加入50 mL花生油，均質(zhì)2 min(10 000 r/min)，離心(3 000 r/min)10 min，取出離心管，觀察乳化情況，記錄乳化層高度及管中液體總高度，計算乳化能力EA，計算方法如式(3)所示。

EA=(H0/H)×100%

(3)

式中:H0為離心管中乳化層高度/ m；H為離心管中液體總高度/cm。

將離心管置于80 ℃水浴中加熱30 min后，用自來水冷卻至室溫，再次離心10 min，記錄乳化層高度及管中液體總高度，計算如花穩(wěn)定性ES，計算方法如式(4)所示。

ES=(H1/H2)×100%

(4)

式中:H1為加熱冷卻后離心管中乳化層高度/ cm；H2為加熱冷卻后離心管中液體總高度/cm。

1.4.2.5 花生蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定[14]

精確稱取1 g 蛋白粉試樣置于裝料杯中，加入100 mL蒸餾水，均質(zhì)(12 000 r/ min) 2 min ,記錄均質(zhì)停止時的泡沫體積，起泡能力計算方法如式(5)所示。

起泡能力=(均質(zhì)停止時泡沫體積/100) ×100%

(5)

均質(zhì)停止后，室溫下靜置30 min ，記錄此時泡沫體積,泡沫穩(wěn)定性計算方法如式(6)所示。

泡沫穩(wěn)定性=(30 min 后泡沫體積/均質(zhì)停止時泡沫體積)×100%

(6)

1.4.3 花生蛋白氨基酸分析[15]

采用氨基酸分析儀測定2種方法所提取的花生蛋白中氨基酸的含量。

1.4.4 紅外光譜研究花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)[6]

用傅里葉紅外光譜(FTIR)測定花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)。樣品制備采用KBr壓片法，取花生蛋白樣品約3 mg 與溴化鉀200 mg 混合， 研磨均勻壓片。用Pekin-Elmer Model GX傅里葉紅外光譜儀測量在20 ℃測定樣品，檢測器DTGS。試驗條件為：分辯率4 cm-1，測量范圍4 000～400 cm-1，掃描信號累加32次，信噪比>500。圖譜處理：選擇酰胺Ⅰ帶光譜，作去卷積變換和二階導(dǎo)數(shù)數(shù)值處理，求出去卷積譜和二階導(dǎo)數(shù)譜，確定子峰峰位并作曲線擬合處理求出各子峰面積，找出結(jié)構(gòu)與譜帶的對應(yīng)關(guān)系，并對不同方法制備花生蛋白進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生蛋白的外觀評定與功能特性的研究

利用反膠束法提取的花生蛋白與利用水相法提取的花生蛋白相比，兩者在感官上有明顯差別：前者顏色亮白，呈現(xiàn)粉末狀；后者顏色為暗淡無光的白色，呈現(xiàn)絮狀。兩者功能特性測定結(jié)果如表1所示。

表1 花生蛋白產(chǎn)品的功能特性

由表1可以看出，2種方法所提的花生蛋白的功能特性有所差別。兩者的氮溶解指數(shù)相近，都比較高，因為2種方法所提取的蛋白都是溶于水的蛋白，所以制得的產(chǎn)品都能很好的復(fù)溶于水，所以兩者的氮溶解指數(shù)都很高。兩者的吸水性能相差不大，但水相法所提蛋白的吸油性明顯由于反膠束法所提蛋白。從兩者形態(tài)結(jié)構(gòu)上來看，水相法所提絮狀蛋白比反膠束法所提粉末狀蛋白能更好地“包藏”油脂，可能使其吸油顯著增多。另外，蛋白產(chǎn)品的吸油性還與其氨基酸組成等有關(guān)系。乳化性方面，反膠束法所提花生蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性優(yōu)于水相法所提花生蛋白。起泡性方面，反膠束法所提花生蛋白的起泡性明顯優(yōu)于水相法所提花生蛋白，而且穩(wěn)定性也相對較好。

2.2 花生蛋白氨基酸分析

采用氨基酸分析儀測定花生蛋白中氨基酸含量如表2所示。

表2 氨基酸成分分析

花生蛋白的氨基酸氨基酸組成比較豐富，含有18種氨基酸(因為采用酸水解法，色氨酸未檢出)。

由表2中可以看出，2種方法所提花生蛋白在氨基酸的種類上沒有差別，但在氨基酸總量和含量組成上有所不同。反膠束法所提花生蛋白氨基酸總量為70.16%，其中7種必需氨基酸含量為16.41%；水相法所提花生蛋白的氨基酸總量為65.82%，其中7種必需氨基酸含量為17.21%。2種方法所提氨基酸的主要氨基酸谷氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等在含量上相比，反膠束法所提的含量均高于水相法所提的含量。谷氨酸和天門冬氨酸這2種鮮味氨基酸在反膠束法所提花生蛋白中的含量明顯高于在水相法所提花生蛋白中的含量。

反膠束法所提花生蛋白中各種氨基酸含量的變化原因有可能是，由于反膠束溶液具有獨特的組成成分，在其疏水相互作用、靜電作用以及界面作用等的作用下，引起蛋白質(zhì)在制備過程中發(fā)生部分水解，或者部分氨基酸發(fā)生的轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致。

2.3 花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于蛋白的結(jié)構(gòu)分析大致經(jīng)歷了定性研究、半定量研究和定量研究3個發(fā)展階段，其中定量研究始于20世紀(jì)80年代。本研究采用了傅里葉變換紅外光譜儀測定蛋白的二級結(jié)構(gòu)，與常規(guī)的色散型紅外光譜儀相比，傅里葉變換紅外光譜儀具有靈敏度高、分辨率高、頻率精度高和信噪比高的優(yōu)勢。

反膠束相制備的花生蛋白的酰胺Ⅰ帶光譜及去卷積譜如圖1所示，從去卷積譜可以分離出7個子峰分別列于表3中；水相制備花生蛋白的酰胺Ⅰ光譜及去卷積譜如圖2所示，在去卷積光譜中可以觀察到的5個子峰別列于表3中。

圖1 反膠束制備花生蛋白的原始光譜(A)和去卷積光譜(B)

圖2 水相制備花生蛋白的原始光譜(A)和去卷積光譜(B)

由圖1、圖2和表3中可以看出，反膠束制備的花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)在酰胺Ⅰ有7個子峰，水相制備的花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)在酰胺Ⅰ有5個子峰，兩者相比頻率基本沒有變化，但是反膠束制備的花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)的紅外特征中出現(xiàn)了新的頻率。

反膠束制備的花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生位移的可能原因：一是反膠束制備花生蛋白過程中，原料與有機溶劑接觸，引起了蛋白結(jié)構(gòu)的變化；二是反膠束相中的表面活性劑與花生蛋白之間相互作用，引起了蛋白結(jié)構(gòu)的變化。關(guān)于這一方面，Chang等[16-17]做過相關(guān)試驗，但具體機理尚需研究。

表3 水相和反膠束制備的花生蛋白酰胺Ⅰ帶頻率(cm-1)

2.3.1 花生蛋白在酰胺Ⅰ帶中的二級結(jié)構(gòu)分布

α-螺旋結(jié)構(gòu)在酰胺Ⅰ帶中所在范圍為1 650～1 660 cm-1。反膠束制備的花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)譜帶則在1 652 cm-1；而水相制備的花生蛋白在酰胺Ⅰ帶中沒有發(fā)現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)。

β-折疊結(jié)構(gòu)在酰胺Ⅰ帶的波段有2個，通常為1 615～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1附近[17]。由圖1和表3中可知，反膠束制備的花生蛋白的β-螺旋結(jié)構(gòu)對應(yīng)的譜帶分別為1 615，1 622，1 634，1 686 cm-1；由圖2和表3中可知，水相制備的花生蛋白的β-螺旋結(jié)構(gòu)對應(yīng)的譜帶分別為1 615，1 622，1 686 cm-1。兩者相比，水相制備的花生蛋白1 634 cm-1附近的β-折疊結(jié)構(gòu)消失。

蛋白的無序結(jié)構(gòu)的譜帶在約在1 645 cm-1左右，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)譜帶約在1 660 cm-1和1 700 cm-1附近。2種方法所制備的花生蛋白在酰胺Ⅰ帶中的無序結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)沒有明顯差別，無序結(jié)構(gòu)均在1 645 cm-1附近，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)均在1 699 cm-1附近。

2.3.2 花生蛋白在酰胺Ⅰ帶中的二級結(jié)構(gòu)定量分析

利用紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)可以直接對蛋白二級結(jié)構(gòu)的成分進(jìn)行定量分析。在二階導(dǎo)數(shù)譜中，確定子峰峰位，作出曲線擬合，求出各子峰面積，所得到的子峰面積對應(yīng)于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)成分的面積的比值即該二級結(jié)構(gòu)所占比例。表4是對花生蛋白在酰胺Ⅰ帶中的二級結(jié)構(gòu)定量分析結(jié)果。

表4 花生蛋白在酰胺Ⅰ帶的二級結(jié)構(gòu)定量分析

由表4可知，與水相制備的相比，反膠束制備的花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的百分含量有所下降，降低了5.75%；無序結(jié)構(gòu)差別不大；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量高出2.24%。另外，反膠束制備蛋白的二級結(jié)構(gòu)還含有2.75%α-螺旋結(jié)構(gòu)，這是水相法所提花生蛋白中所沒有的。

3 結(jié)論

3.1 2種方法所提花生蛋白在外觀上有所差異。反膠束法所提花生蛋白為亮白細(xì)膩的粉末狀；水相法所提花生蛋白為絮狀且顏色暗淡。

3.2 在功能特性方面，2種方法所提花生蛋白的氮溶解指數(shù)、吸水性相近；水相法所提花生蛋白的吸油性要比反膠束法所提花生蛋白的好；反膠束法所提花生蛋白的乳化性與穩(wěn)定性要比水相法所提花生蛋白的好；在起泡性和起泡穩(wěn)定性上，反膠束法所提花生蛋白要明顯優(yōu)于水相法所提花生蛋白。

3.3 2種方法所提花生蛋白的氨基酸種類沒有差別，但是在含量上有所差異。反膠束制備有利于提高花生蛋白中某些氨基酸的含量，如2種鮮味氨基酸天門冬氨酸、谷氨酸。

3.4 通過傅里葉紅外光譜(FTIR)測定花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)可知，反膠束法提取花生蛋白會對花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生作用。與水相法所提花生蛋白相比，反膠束制備的花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的百分含量降低了5.75%，無序結(jié)構(gòu)差別不大，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的含量高出2.24%，2.75%，α-螺旋結(jié)構(gòu)是水相法所提花生蛋白中所沒有的。

[1]FAS-USDA web [EB/OL]. www.fas.usda.gov

[2]American Association of Cereal Chemists (AACC), Approved Methods of the AACC[S]. Method 44-19, 10th ed., AACC, St. Paul, MN, USA, 2000

[3]李曉剛，張永丹．花生粕的酶解新工藝研究[J]．食品工業(yè)科技，2004, 25(2)：102-103

[4]董貝森，朱海濤，于躍芹. 花生蛋白粉溶液流變學(xué)特性及功能性的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，1999，15(1)：251-252

[5]徐維艷，王衛(wèi)東，秦衛(wèi)東. 花生蛋白的制備、功能性質(zhì)及應(yīng)用[J]. 食品科學(xué)，2010，31(17)：476-479

[6]Chen X Y, Ru Y, Chen F L, et al. FTIR spectroscopic characterization of soy proteins obtained through AOT reverse micelles [J]. Food Hydrocolloids, 2013, 31: 435-437

[7]Zhao X Y, Chen F S, Chen J Q, et al. Effects of AOT reverse micelle on properties of soy globulins[J]. Food Chemistry, 2008, 111: 599-605

[8]Liu F L, Wang X C, Zhao X Y, et al. Surface properties of walnut protein from AOT reverse micelles[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2014, 49: 626-633

[9]趙曉燕，蓋國勝，薛文通, 等．二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計法優(yōu)化AOT 反膠束體系萃取大豆蛋白質(zhì)的研究[J]．中國糧油學(xué)報，2008,23 (6): 56-63

[10]王憲昌，虎海防，趙曉燕等．反膠束法提取核桃粕中蛋白的前萃工藝研究[J]. 中國糧油學(xué)報，2014, 29 (1):91-94

[11]Nagano T, Hirotsuka M, Mori H, et al. Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40: 941-944

[12]張立偉. 富硒菜籽蛋白產(chǎn)品的制備、功能特性及應(yīng)用研究[D].武漢：武漢食品工業(yè)學(xué)院，1995

[13]周瑞寶. 植物蛋白功能原理與工藝[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007

[14]劉大川. 植物蛋白工藝學(xué)[M]. 北京:中國商業(yè)出版社,1993

[15]Zhao X Y., Chen J, Lu Z F., et al. Analysis of the Amino Acids of Soy Globulins by AOT Reverse Micelles and Aqueous Buffer[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011, 165: 802-813

[16]Chang Q, Chen J, Zhang X, et al. Effect of the Cosolvent Type on the Extraction of α-Amylase with Reversed Miceles: Circular Dichroism Study[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1997, 20: 87-92

[17]Chang Q L, Liu H Z, Chen J Y. Fourier Transform Infrared Spectra Studies of Protein in Reverse Micelles: Effect of AOT/Isooctance on the Secondary Structure of α-Chymotrypsin[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1994, 1206: 247-25.

Effect of Reverse Micelles on the Functional Properties and Structure of Peanut Protein

Zhao Xiaoyan Zhu Haitao Zhang Bingwen Tang Weidong Zhang Lijin He Lei

(Department of Food Science and Nutrition, School of Hotel Management, University of Jinan, Jinan 250022)

The review studies the effect of reverse micelles on functional properties, amino acid composition and the secondary structure of peanut protein. The results show that similar nitrogen solubility index and water absorption of protein using AOT reverse micelles and aqueous buffer extraction are found. Color of peanut protein obtained through reverse micelles is bright and white with poor oil absorbency, while the emulsifying properties and foaming properties are significantly better than that of aqueous buffer phase. In addition, the reverse micelles could improve certain amino acids in peanut protein, for example the flavor amino acid, asparaginic acid and glutamic acid; The second derivative spectra of proteins in amide Ι bands from reverse micelles has been shifted compared with their spectra with aqueous buffer extraction method, random coil and β-corner content increase, while β-sheet reduces in a certain extent, and new α-helix content appears.

reverse micelles, extraction, peanut protein, functional properties, structure

TS201.4

A

1003-0174(2016)06-0063-05

國家自然科學(xué)基金(21406133)

2014-10-19

趙曉燕，女, 1975 年出生，副教授，食品理論與加工應(yīng)用及生物粉體技術(shù)