薺藍膠多糖的分離純化和理化性質研究

李澤珍 狄建兵 陳 敏

(山西農業(yè)大學食品科學與工程學院1，太谷 030801)(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院2，北京 100083)

薺藍膠多糖的分離純化和理化性質研究

李澤珍1狄建兵1陳 敏2

(山西農業(yè)大學食品科學與工程學院1，太谷 030801)(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院2，北京 100083)

研究薺藍膠脫除蛋白的方法，薺藍膠多糖的分離純化，以及部分理化性質的測定。采用水提醇沉法從薺藍籽中提取薺藍膠，比較了Sevag法、堿性蛋白酶+Sevag法、胰蛋白酶+Sevag法3種脫除蛋白方法，此后經DE-52離子交換柱進行純化得到精制多糖。采用凝膠電泳、紫外掃描等進行純度鑒定，紅外掃描、液相色譜分析其結構和單糖組成，并進行部分理化性質的測定。結果表明，堿性蛋白酶+sevag法是脫除薺藍膠中蛋白的有效方法，分離純化的薺藍膠多糖CSP(camelina sativa polysaccharide)為單一級分，含有糖醛酸結構，吡喃糖環(huán)和β-糖苷鍵，其單糖組成包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖4種，摩爾比為11.95∶13.95∶0.79∶0.27。薺藍膠多糖CSP是一種水溶性，有較高黏度的酸性多糖類物質。

薺藍膠多糖 分離純化 理化性質

薺藍可抵抗冬季-16 ℃左右的低溫，對土壤條件要求低，如干旱、瘠薄、半沙質的地區(qū)都可種植，適應性強。與亞麻薺相比，薺藍農藝性狀好，抗病蟲、抗倒伏、高產質優(yōu)，具有許多優(yōu)點[1]。

近年來，薺藍作為一種新的高產油料作物越來越受到人們的重視[ 1-3]，如其栽培特性、食用價值等。相關研究表明，薺藍籽含油率為36%～42%，可作為食用植物油源；薺藍油中富含α-亞麻酸、亞油酸，其含量分別為33%～36%，18%～25%，并且VE含量高達36～44 mg/100 g，因而，薺藍油也被認為是具有特殊功能營養(yǎng)保健油源[4]。薺藍籽榨取油脂后的薺藍籽餅(粕)仍具有很高的應用價值，它含有高達42%～45%的蛋白質，可在家禽飼料中添加應用[5]，也可對其蛋白分離純化或酶解獲得多肽，作為生物活性物質在食品中添加[6]。薺藍籽表皮附著植物多糖膠質，采用水提醇沉法可獲得薺藍膠，其中含有70%以上的多糖和少量蛋白質[7]。薺藍膠中含有大量的植物多糖，已有研究表明，植物多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗衰老、降血糖和免疫調節(jié)等，并且具有毒副作用小，不易造成殘留等優(yōu)點[8]。近年來，多糖的研究被重視，研究方面包括分離純化、理化性質測定，以及生物活性的探討。目前，嚴奉偉等[9]、稅丹等[10]研究表明菜籽多糖具有清除自由基的能力，有明顯的抗氧化作用；毛豐瑋等[11]研究了亞麻籽殼多糖，對其提取工藝，分離純化，多糖結構進行了研究。而薺藍籽殼提取到的薺藍膠中的多糖，其分離純化及理化性質研究至今鮮見報導。

本研究對薺藍膠脫除蛋白方法進行了比較，對多糖成分進行了分離純化，并探討了純化后多糖的理化性質，旨在為薺藍膠多糖進一步的結構或構效關系研究、保健品的開發(fā)應用，提供一定的理論基礎，同時，進一步提高油料作物薺藍的經濟效益。

1 材料與儀器

薺藍膠：自制；單糖標品-葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶：Sigma公司；8～14 ku透析袋：美國聯合碳化公司；DE-52：Whatman Intermational Ltd；三氟乙酸、茚三酮-乙醇溶液、費林試劑、雙縮脲試劑、三氯化鐵、碘-碘酸鉀溶液、CTAB：分析純級。

752型紫外光柵分光光度計：上海精密科學儀器有限公司； HL-2S 恒流泵、SBS-100 電腦全自動部分收集器、層析柱(1.6 cm×40 cm)、HD-5 電腦紫外檢測儀：上海青浦滬西儀器廠；DYCZ-24D雙垂直電泳槽電泳儀、DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；UV-VIS紫外-可見光光譜分析儀：澳大利亞瓦里安有限公司；SY-4000K高效液相色譜設備：北京北分瑞利分析儀器有限責任公司；sugar pakⅠ色譜柱：沃特世公司；RI-K-2301示差折光檢測器：北京北分瑞利分析儀器有限責任公司；5DX紅外光譜儀：美國尼高力公司。

2 試驗方法

2.1 薺藍膠脫除蛋白

薺藍膠的制備：按比例稱取薺藍籽殼與蒸餾水，重量比為1∶33，在61 ℃下浸提3.5 h，勻漿后離心處理，獲得上層膠液，多次加入無水乙醇沉淀，脫水濃縮，紗布過濾，得到的膠質在60 ℃下鼓風干燥。干燥后制品為纖維狀，粉碎后過篩(80目)，制得薺藍膠粉。

配制50 mL 0.4%薺藍膠溶液，分別使用Sevag法、堿性蛋白酶+Sevag法、胰蛋白酶+Sevag法對其進行脫蛋白處理[12-13]，用考馬斯亮藍染色法與苯酚-硫酸法分別測定3 種方法處理后的蛋白質含量以及多糖含量。脫除蛋白后的粗多糖液透析，冷凍干燥，制得薺藍膠粗多糖。

2.2 DEAE-52離子層析

稱取薺藍膠粗多糖，配制濃度為1.0 mg/mL的溶液，經微孔濾膜過濾后上樣，上樣量為10 mL。DE-52(Cl-型) (1.6 cm×40 cm) 蒸餾水洗脫4 h后，經0～1.5 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.6 mL/min，以5 mL/管分部收集。收集得到的洗脫液采用苯酚-硫酸法檢測糖峰部分，合并單一含糖峰位，蒸餾水中透析48 h后冷凍干燥，精制得到多糖組分。

2. 3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用pH8.3的Tris-甘氨酸為緩沖液，電泳條件為電壓400 V，電泳時間8 h。0.5%甲苯胺藍染色后，再用乙醇∶水∶乙酸(5∶5∶0.1)脫色處理。

2. 4 紫外光譜

稱取薺藍膠精制多糖，配制0.1 mg/mL的水溶液，紫外分析儀UV1800進行掃描，范圍為190～400 nm。

2.5 紅外光譜分析

KBr壓片法。紅外掃描范圍在4 000～400 cm-1。

2.6 單糖組成分析[14]

單糖標準液配置濃度為2.0 mg/mL。多糖的酸水解：稱取10 mg多糖CSP加入螺口試管中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)，充氮氣封管；100 ℃水浴6 h后取出；旋轉蒸發(fā)儀中真空濃縮至干(溫度低于40 ℃)，加入甲醇再由氮氣吹干，重復4～5次，直到完全除去TFA，最后配成溶液。

高效液相(HPLC)法分析CSP多糖的單糖組成成分，以warers sugar pakⅠ為色譜柱， 0.05 g /L EDTA鈣鈉溶液為流動相，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為90 ℃，RI-K-2301示差折光檢測器。

2.7 CSP多糖的理化性質[12]

對多糖CSP的多種理化性質進行檢測觀察，包括顏色、狀態(tài)、溶解性、CTAB絡合反應、碘-碘酸鉀反應、費林試劑反應、茚三酮反應、三氯化鐵反應、雙縮脲反應。

3 結果與分析

3.1 薺藍膠脫除蛋白

薺藍膠中蛋白質含量較高，sevag法需反復處理7次以上，才能使游離蛋白質除盡，最終蛋白質含量5.01 mg/mL，脫去58.5%的蛋白質，多糖損失率23.46%。酶解后，使用sevag法處理，可以減少后續(xù)有機溶劑脫除蛋白的次數，降低了多糖隨凝膠物沉淀而損失的可能。堿性蛋白酶處理后，sevag法僅處理2次，蛋白質脫除率為59.90%，胰蛋白酶處理后，仍需sevag法處理5次，其優(yōu)點是蛋白質脫除率最高(63.60%)，但多糖損失率很大。綜上所述，堿性蛋白酶+sevag法可以有效提高蛋白脫除效率，減少多糖損失，酶法與sevag法結合是脫除薺藍膠中蛋白的有效方法。

表1 不同脫蛋白方法處理的試驗結果

注：蛋白含量測定：考馬斯亮藍法。薺藍膠蛋白含量12.06 mg/mL。

3.2 薺藍膠多糖的分離純化

采用 DE-52(C1-型)柱層析，蒸餾水洗脫4 h后，用0～1.5 mol/L NaCl梯度洗脫。NaCl溶液梯度洗脫可獲得一種主要的分離組分，命名為CSP(camelina sativa polysaccharide)，分離效果見圖1。柱層析時，蒸餾水洗脫后檢驗無組分，NaCl溶液梯度洗脫后有組分，該組分是被DE-52吸附的酸性多糖峰，這說明薺藍膠多糖中的組分是酸性多糖，而不是中性多糖。

圖1 薺藍膠多糖的柱層析圖譜

3.3 凝膠電泳

薺藍膠多糖CSP組分達到了電泳純，凝膠電泳獲得到單一區(qū)帶(圖2)，這表明CSP為單一組分多糖。

圖2 CSP的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜圖

3.4 紫外掃描光譜

紫外掃描圖譜(圖2)表明，多糖CSP中不含蛋白質、多肽及核酸的成分，其掃描范圍內260、280 nm處均無吸收。

圖3 CSP的紫外掃描圖譜

3.5 多糖紅外掃描分析

圖4 CSP紅外光譜圖

3.6 單糖組成分析

如圖5、圖6所示，CSP是一種雜多糖。其單糖組成包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖，相對摩爾比為：11.95∶13.95∶0.79∶0.27。結合多糖的紅外掃描，可知薺藍膠多糖CSP是由β-糖苷鍵連接的4種單糖組成的雜多糖。

圖5 單糖標樣HPLC檢測圖譜

圖6 CSP的單糖HPLC檢測圖譜

表2 單糖的HPLC洗脫信息

3.7 多糖CSP的理化性質

多糖CSP的CTAB絡合反應為陽性外，其他反應均為陰性，表明CSP組分具有水溶性，有較高黏度，是非淀粉類酸性多糖。同時，CSP組分不含淀粉、還原糖、酚類物質、蛋白、多肽物質。

表3 CSP的理化性質

注：“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應。

4 結論

薺藍膠脫除蛋白方法的研究，結果表明堿性蛋白酶+sevag法是有效的脫除薺藍膠蛋白質的方法，可以顯著減少sevag法處理的次數，并降低多糖的損失。

薺藍膠粗多糖經離子交換柱層析，進行分離純化，得到一個主要組分CSP。該組分聚丙烯酰胺凝膠電泳只有一條帶，紫外掃描260、280 nm處無吸收，純度鑒定表明CSP為單一組分。高效液相色譜分析表明，CSP多糖含有4種單糖，分別為鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖，摩爾比為11.95∶13.95∶0.79∶0.27。糖苷鍵分析結果表明，薺藍膠多糖CSP是由β-糖苷鍵連接的4種單糖組成的雜多糖。紅外掃描表明CSP是多糖類化合物，具有吡喃糖的β-糖苷鍵結構，并含有糖醛酸。其理化性質試驗表明，CSP是非淀粉類多糖，具有水溶性、較高黏度，是不含淀粉、還原糖、酚類物質、蛋白、多肽的酸性多糖類物質。

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Isolation, Purification and Physicochemical Properties of the Polysaccharides from Camelina Sativa Gum

Li Zezhen1Di Jianbing1Chen Min2

(College of Food Science & Engineering，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801)(College of Food Science & Nutritional Engineering，China Agricultural University2，Beijing 100083)

The methods of deprotein from Camelina Sativa gum,isolating and purifying the polysaccharides, and determining the partial physicochemical characters of polysaccharides were investigated. Water extraction and alcohol precipitation are employed to isolate Camelina Sativa gum from seed shell. Comparison was carried out between three different methods, Sevag, combination of Sevag with trypsase, combination of Sevag with alkaline protease for deproteinization. After the removal of protein, the Camelina Sativa polysaccharides were purified by DEAE-cellulose chromatography. The purity is identified by polyacrylamide gel electrophoresis and UV scanning, while its structure and monosaccharides composition were analyzed by IR scanning and HPLC, and particial physicochemical properties are measured. The results showed that Sevag method combined with alkaline protease could greatly increases removal rate of protein；separated and purified Camelina sativa polysaccharide was an homogeneous component which contains uronic acids, pyranoid ring and β-glycosidic bond. And physichemical characters of CSP showed that it mainly contains rhamnose, xylose, arabinose and glucose in the molar ratio of 11.95∶13.95∶0.79∶0.27. CSP was an acidic polysaccharides with water-soluble, high viscosity.

camelina sativa polysaccharide, ioslation and puirifcation, physichemical characters

TS201.1

A

1003-0174(2016)06-0052-05

2015-04-29

李澤珍，女，1980年出生，講師，果蔬貯藏與加工，天然產物開發(fā)

陳敏，女， 1956年出生，教授，天然產物開發(fā)